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单个B淋巴细胞的抗病毒抗体的筛选与鉴定

2020-12-08阅读(765)

单个B淋巴细胞的抗病毒抗体的筛选与鉴定

论文摘要

抗体作为机体获得性免疫的重要工具,在体液免疫反应中占有重要地位。由于其特异性与有效性,因此人们不断尝试通过各种体外表达技术获得抗体,用于病毒病的研究与防治。从多克隆抗体制备技术到杂交瘤细胞技术,再到基因工程抗体制备技术的发展中,人们发现抗体制备仍然面临着难度大、耗时长、异源性反应等问题。基于此,近年来发展出从一种单个B淋巴细胞制备抗体的新兴技术,该方法依赖于流式分选技术,能够在单个B淋巴细胞中分离表达出大量天然构象的特异性抗体。本研究利用基于单个B淋巴细胞制备单克隆抗体技术,分别开展抗O型FMDV抗体、抗CPV抗体与抗RABV人源抗体的制备与鉴定。在健康C57BL/6小鼠脾脏悬浮液中,利用泛B细胞表面标记CD19的磁珠富集B细胞后,采用流式分选技术经过B220+/IgG1+/CD38+/O型FMDV抗原+分选,以19/500000的比例获得单个抗原特异性B细胞,随后利用单细胞反转录-巢式PCR反应,扩增获得8个抗体轻链可变区完整基因片段与19个抗体重链可变区完整基因片段,阳性比例分别为33.3%与79.2%,其中轻/重链天然配对的抗体基因只有6对,分别为:2-4 FAb、11-8 FAb、7-8 FAb、7-9 FAb、12-5 FAb和5-7 FAb;将其分别与含有轻/重链保守区的表达载体构建为轻/重链重组质粒后,转染入HEK-293细胞中表达出6株单克隆抗体,经过Western blot鉴定抗体轻/重链的表达,其结果显示只有3株抗体（5-7 FAb、11-8 FAb和12-5 FAb）的分子量大小与预期抗体大小一致（重链55 kD、轻链25kD）;利用ELISA鉴定抗体类型结果显示3株抗体均属于IgG1型抗体,表明利用上述技术获得的B细胞均为IgG1+B细胞;免疫荧光试验证明3株抗体均能够在胞质内完整表达。通过ELISA对成功表达的3株抗体进行特异性检测,显示抗体均能特异性结合灭活的O型FMDV抗原,其A450nm值高于阴性对照组3倍左右;进一步通过免疫荧光试验证明,获得的3株抗体能够特异性结合细胞内复制的O型FMDV。同时利用该技术中对应的表达载体,我们构建了CPV鼠源重组抗体与抗RABV人源重组抗体轻/重链的表达质粒,并获得抗CPV鼠源重组抗体与抗RABV人源重组抗体各1株,经免疫荧光试验表明获得的抗CPV及RABV抗体均能够在胞质内表达且与抗原发生特异性结合,微量中和试验表明抗RABV重组抗体具有一定的中和活性,其原液在按1:32稀释后有70%的中和效率,抗体经过浓缩后按1:168稀释仍然有60%的中和效率。本论文建立了单个B淋巴细胞直接制备单克隆抗体术,利用该技术从健康小鼠上通过磁珠富集、流式分选技术和单细胞PCR技术,在单个B淋巴细胞水平上筛选和鉴定出O型FMDV、CPV及RABV抗体,为开发基于抗体的病毒检测与治疗提供了新方法与思路。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 抗体
  •     1.1.1 抗体的结构
  •     1.1.2 抗体的功能
  •     1.1.3 抗体库的产生
  •     1.1.4 抗体制备技术
  •     1.1.5 基于单细胞技术抗体的制备
  •   1.2 抗体在动物病毒病防控中的应用
  •     1.2.1 口蹄疫
  •     1.2.2 犬细小病毒病
  •     1.2.3 狂犬病
  •   1.3 本研究的内容与意义
  •   1.4 实验所需仪器
  • 第二章 O型 FMDV单克隆抗体的筛选与鉴定
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验动物与细胞
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要溶液及其配置
  •     2.1.4 实验涉及相关网站以及分析软件
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 制备小鼠脾脏B细胞悬浮液
  •     2.2.2 磁珠富集B细胞
  •     2.2.3 口蹄疫病毒抗原的PE标记
  •     2.2.4 细胞染色与流式单细胞分选
  •     2.2.5 单细胞cDNA的获取
  •     2.2.6 单细胞PCR引物设计与扩增
  •     2.2.7 序列测定及分析
  •     2.2.8 克隆PCR产物的磁珠纯化
  •     2.2.9 一步法克隆
  •     2.2.10 重组表达质粒的提取与鉴定
  •     2.2.11 抗体的表达与纯化
  •     2.2.12 抗体的表达鉴定
  •     2.2.13 抗体的特异性鉴定
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 O型 FMDV衣壳蛋白的浓度测定
  •     2.3.2 单个O型 FMDV阳性B细胞的分选
  •     2.3.3 单细胞PCR获得O型 FMDV抗体轻/重链基因
  •     2.3.4 FMDV O型抗体基因克隆
  •     2.3.5 抗体的表达结果
  •     2.3.6 抗体的鉴定
  •   2.4 讨论
  • 第三章 CPV重组抗体的制备与鉴定
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 质粒与细胞
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 主要溶液及其配置
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 CPV重组抗体可变区的扩增
  •     3.2.2 克隆PCR产物的纯化
  •     3.2.3 重组克隆
  •     3.2.4 重组表达质粒的提取与鉴定
  •     3.2.5 CPV重组抗体的表达
  •     3.2.6 CPV重组抗体的表达鉴定
  •     3.2.7 CPV重组抗体的特异性鉴定
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 CPV重组抗体的克隆PCR与连接
  •     3.3.2 CPV重组抗体轻/重链表达结果
  •     3.3.3 CPV重组抗体的完整表达结果
  •     3.3.4 CPV重组抗体特异性鉴定结果
  •   3.4 讨论
  • 第四章 RABV重组人源抗体的制备与鉴定
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 病毒与细胞
  •     4.1.2 主要试剂
  •     4.1.3 主要溶液及其配置
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 RABV抗体可变区的扩增
  •     4.2.2 克隆PCR产物的纯化
  •     4.2.3 重组克隆
  •     4.2.4 表达质粒的提取与鉴定
  •     4.2.5 RABV重组人源抗体的表达
  •     4.2.6 RABV重组人源抗体的表达鉴定
  •     4.2.7 RABV重组人源抗体的特异性鉴定
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 RABV抗体的克隆PCR与连接
  •     4.3.2 RABV重组人源抗体轻重链的表达结果
  •     4.3.3 RABV重组人源抗体的完整表达结果
  •     4.3.4 RABV重组人源抗体特异性鉴定结果
  •   4.4 讨论
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张雨

    导师: 张志东

    关键词: 淋巴细胞,单克隆抗体,流式单细胞分选,巢式,病毒

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    基金: “十三五”国家重点研发计划项目(2016YFE0204100,2016YFD0500108,2016YFD0500907),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y2019GH10),中国农业科学院创新工程专项基金

    分类号: S852.4

    总页数: 70

    文件大小: 4094K

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