孙成法[1]2003年在《雷公藤红素抑制血管内皮细胞体外增殖与血管生成机理的实验研究》文中认为第一部分 雷公藤红素抑制血管内皮细胞体外增殖机理的实验研究 目的：探讨雷公藤红素抑制血管内皮细胞体外增殖的机理。 方法：通过生长曲线、细胞涂片H-E染色的光镜下观察、以及流式细胞仪研究雷公藤红素抑制血管内皮细胞株ECV304体外增殖的机理。 结果：生长曲线表明，在体外雷公藤红素能够明显抑制内皮细胞株ECV304增殖。内皮细胞经流式细胞仪分析表明，低浓度时(5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml)的雷公藤红素主要引起内皮细胞DNA合成受阻，高浓度时(20μg/ml)同时还表现为细胞毒作用，引起内皮细胞坏死，经细胞涂片的H-E染色得到了证实。 结论：雷公藤红素通过阻碍DNA合成及细胞毒作用抑制内皮细胞的体外增殖。 第二部分 雷公藤红素抑制血管生成机理的实验研究 目的：探讨雷公藤红素在体外抑制血管生成的机理。 方法：应用RT-PCR检测一定浓度雷公藤红素作用下的内皮细胞株ECV304E-selectin和ICAM-1的表达，采用流式细胞仪检测不同浓度雷公藤红素作用下内皮细胞株ECV304表面CD31的表达。 结果：RT-PCR的结果表明经过雷公藤红素处理后，内皮细胞株ECV304ICAM-1的表达明显地降低，而E-selectin，CD31并未见表达。 结论：雷公藤红素在体外通过影响内皮细胞ECV304的黏附分子ICAM-1等的表达，从而抑制血管生成。
黄煜伦[2]2002年在《雷公藤单体抑制胶质瘤细胞与血管生成的实验研究》文中研究指明第一部分 雷公藤单体对胶质细胞与内皮细胞的体外作用的实验研究 目的 研究雷公藤单体对胶质瘤细胞及血管内皮细胞株的体外抑制作用 方法 通过MTT法测定四种雷公藤单体对胶质瘤细胞株SHG44、C6、U251及血管内皮细胞株ECV的体外抑制作用。 结果 发现雷公藤单体中叁萜类红素等对胶质瘤细胞有一定的抑制作用而且对血管内皮细胞有明显的抑制作用。而雷公藤二萜类单体雷公藤甲素及LLDT-10对胶质瘤细胞有极明显的抑制作用，但对血管内皮细胞无作用。 结论 红素对血管内皮细胞有明显抑制作用而二萜类中的雷公藤甲素等对胶质瘤细胞有明显的抑制作用。体外实验为今后体内实验提供了依据。 [关键词]：雷公藤红素雷公藤甲素 内皮细胞 胶质瘤 第二部分 雷公藤红素抑制血管生成的实验研究 目的：探讨雷公藤红素对血管生成的抑制作用。 方法：采用MTT法测定雷公藤红素对血管内皮细胞株ECV增殖的影响，观察雷公藤红素对ECV迁移实验和小管形成实验的作用，以及对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。血管生成抑制的体内实验采用Matrigel plug实验。 结果：雷公藤红素明显抑制ECV的体外增殖，IC_(50)为1.33μg/ml，而且可抑制ECV的迁移和小管形成，并呈明显的剂量依赖性。同时也抑制鸡胚尿囊膜血管生成作用和Matrigel plug中的血管新生。 结论：雷公藤红素具有明显抑制血管生成的作用，有可能成为极具前途的血管生成抑制剂。
周幽心, 孙成法, 许期年, 傅军, 黄煜伦[3]2003年在《雷公藤红素体外抑制血管内皮细胞增殖的研究》文中提出恶性胶质瘤多具有丰富的间质血管,抗肿瘤血管形成是当前胶质瘤治疗研究的热点之一。本研究探讨雷公藤红素体外抑制血管内皮细胞增殖的机理。方法:通过生长曲线、细胞涂片、HE染色后光镜下观察、以及流式细胞仪研究雷公藤红素抑制血管内皮细胞株ECV304体外增殖的机理。结果:生长曲线表明,在体外雷公藤红素能够明显抑制内皮细胞株ECV304增殖。内皮细胞经流式细胞仪分析表明,低浓度时(5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml)的雷公藤红素主要引起内皮细胞S期受阻,高浓度时(20μg/ml)同时还表现为细胞毒作用,引起内皮细胞坏死。结论:雷公藤红素通过阻碍DNA合成及细胞毒作用抑制内皮细胞的体外增殖。
周幽心, 孙成法, 许期年, 沈海林, 黄煜伦[4]2004年在《雷公藤红素抑制血管内皮细胞株增殖的体外研究》文中研究表明目的探讨雷公藤红素抑制血管内皮细胞体外增殖的机理。方法通过生长曲线、HE染色以及流式细胞仪分析雷公藤红素抑制血管内皮细胞株ECV304体外增殖状况。结果在体外雷公藤红素能够明显抑制内皮细胞株ECV304增殖,低浓度(5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml)的雷公藤红素主要引起血管内皮细胞S期受阻,高浓度(20μg/ml)同时还表现为细胞毒作用,引起血管内皮细胞坏死。结论雷公藤红素通过阻碍DNA合成及细胞毒作用抑制血管内皮细胞的体外增殖。
黄煜伦, 周幽心, 周岱, 许期年, 叶明[5]2003年在《雷公藤红素抑制血管生成的实验研究》文中研究说明目的 探讨雷公藤红素对血管生成的抑制作用。方法 采用MTT法测定雷公藤红素对血管内皮细胞株 (ECV)增殖的影响 ,观察雷公藤红素对ECV迁移实验和小管形成实验的作用 ,以及对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。体内实验采用Matrigelplug方法。结果 雷公藤红素可明显抑制ECV的体外增殖 ,IC50 为 1.33μg/ml;可抑制ECV的迁移和小管形成 ,并且呈明显的剂量依赖性 ;同时具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成和Matrigelplug中的血管新生的作用。结论 雷公藤红素具有明显抑制血管生成的作用 ,有可能成为有效的血管生成抑制剂。
姜华[6]2005年在《雷公藤红素抑制荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的实验研究》文中认为第一部分 雷公藤红素对荷瘤裸鼠的抑瘤实验 目的 探讨雷公藤红素在裸鼠胶质瘤动物模型治疗人脑胶质瘤的可行性。 方法 建立BALB/c裸小鼠SHG-44胶质瘤同种移植动物模型,将34只荷瘤裸鼠随机分为5组,空白对照组、高、中、低剂量雷公藤红素作用组、阳性对照组,采用腹腔内注射给药方法。雷公藤红素按叁种浓度4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg分组给药,每日一次,每周五天:阳性对照顺铂组按2mg/kg给药,每周两次;空白对照组只喂养不做任何处理。共给药四周。全部荷SHG-44胶质瘤裸鼠于给药后第28天断颈处死并剔出肿瘤,将肿瘤组织分块处置。定期观察肿瘤生长情况测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。 结果 五组荷SHG-44胶质瘤裸鼠的移植瘤体积(处死后测量)比较,差异显着(F=5.519,P<0.01);与空白对照组相比,雷公藤红素4mg/kg组、雷公藤红素2mg/kg组均能抑制肿瘤生长(P<0.05=,其体积抑瘤率分别为35%、26.9%。 结论 雷公藤红素能明显抑制荷SHG-44胶质瘤裸鼠的移植瘤生长,并存在剂量依赖性。
程薇[7]2009年在《雷公藤红素对人急性髓系白血病原代细胞增殖和凋亡的影响》文中研究说明背景与目的急性白血病是最常见的血液系统恶性肿瘤,是一组异源性起源的恶性克隆性疾病,年发病率3～4/10万。其中急性髓系白血病约占70%,是成人白血病的主要类型。化疗是目前治疗白血病的主要手段。随着化疗方案的不断改进和新的化疗药物的出现,白血病的预后已有非常明显的改善,但仍然存在白血病耐药及停药后白血病复发等问题,严重影响了病人的生活质量及长期生存。因此,寻找有效的抗肿瘤新药、探索相关治疗新方案具有重要意义。近年来,某些中药及其有效组分因具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用备受关注。雷公藤(TWHF)泛指卫矛科雷公藤属植物,是我国传统中药材之一,具有抗炎、免疫抑制、抑菌和抗肿瘤等多种药理作用。雷公藤红素(celastrol)是从雷公藤的根部分离到的叁萜类色素,分子式为C_(29)H_(38)O_4,分子量为450。有文献报道,红素不仅具有免疫抑制和抗炎作用,还对多种肿瘤细胞具有显着的体外抑制作用。目前有关雷公藤红素对白血病的研究尚处于基础研究阶段,可见到雷公藤红素用于部分白血病细胞株的报道,而该药用于急性髓系白血病原代细胞的研究国内外罕见报道,有待进一步探索。本研究将雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞,观察其在体外对急性髓系白血病原代细胞增殖及凋亡的影响,以探讨应用雷公藤红素治疗白血病的可能性,为临床应用雷公藤红素提供理论依据。方法1.人急性髓系白血病细胞分离与培养采用密度梯度法分离初诊急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞,以1×10~6/ml接种在培养瓶中,37℃、5%CO_2条件下RPMI-1640中悬浮培养,2～3天换液一次。取处于对数生长期,细胞活性大于95%的细胞进行实验。2.台盼蓝染色活细胞计数法采用台盼蓝染色进行活细胞计数。取40μl雷公藤红素处理过的急性髓系白血病原代细胞悬液用台盼蓝染色后,然后镜检100个细胞,其中拒染细胞为活细胞,染成蓝色细胞为死细胞,计算出活细胞百分率。3.甲基噻唑基四唑比色法(MTT法)取处于指数生长期的未处理急性髓系白血病原代细胞按1×10~6/mL接种于96孔培养板,180μl/孔。实验孔红素终浓度分别为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L,同时设置不加药物的对照孔和不加药物与细胞的调零孔,均设4个复孔。将培养板放至37℃、5%CO2温箱分别培养3h,6h,12h,24h后,每孔加入MTT 20μl,37℃继续培养4h,离心,弃上清,每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO),低速震荡,使甲瓒晶体完全溶解,置酶标仪在490nm波长处测定每孔的光密度值(OD)。计算细胞增殖抑制率,并以药物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标绘制细胞生长抑制曲线,找出雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞的最适时间和最适浓度。4.磷脂酸丝氨酸外翻技术(Annexin V-FITC/PI法)采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术法。取终浓度为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞6h及2μmol/L雷公藤红素作用3h、6h、12h、24h后的急性髓系白血病细胞悬液100μl,分别加入10μl Annexin V-FITC,室温避光10min后加入碘化丙啶染色液5μl,避光反应5min,加入400μl 1×Annexin V-FITC结合液,混匀,立即上流式细胞仪定量检测(一般不超过1h),试验重复3次。同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照。5.细胞凋亡峰定量分析(PI单染法)采用PI单染法定量分析细胞凋亡峰。取终浓度为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞6h的细胞悬液,用冰预冷的70%乙醇4℃固定24h,取固定后的细胞用PBS洗涤,加入RNAase 37℃消化30min,再加入PI染液,混匀后4℃避光染色15min。流式细胞仪进行细胞周期分析,低于G1期DNA含量细胞为凋亡细胞,实验重复3次。6.数据统计实验数据采用SPSS 13.0统计软件分析,所有统计结果以均数±标准((?)±s)表示,多样本均数的比较采用单因素方差分析,α=0.05为检验水准。结果1.不同药物浓度及作用时间与细胞增殖抑制率变化的关系采用MTT比色法检测结果显示:不同浓度雷公藤红素组两两比较,2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的雷公藤红素对急性髓系白血病原代细胞增殖的抑制作用相比,差异无统计学意义(P＞0.05),与1μmol/L组及对照组相比较,均具有显着性差异(P＜0.01),最适作用浓度为2μmol/L。不同时间雷公藤红素组两两比较发现,6h、12h和24h时雷公藤红素对急性髓系白血病原代细胞的增殖抑制率相比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与3h时相比较,均具有显着性差异(P＜0.01),最适作用时间为6h。总的来说,雷公藤红素可抑制急性髓系白血病原代细胞的生长,其作用的最适浓度为2μmol/L,最适时间为6h。2.不同药物浓度及作用时间与细胞凋亡率变化的关系流式细胞术检测结果显示1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L雷公藤红素作用6h,急性髓系白血病原代细胞均可出现凋亡现象,凋亡率分别为(34.03±17.07)%、(49.53±19.84)%、(50.56±15.80)%、(28.28±21.21)%,明显高于不加药物的对照组(4.95±1.85)%(P＜0.01);2μmol/L、5μmol/L浓度组与其他组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05),二者之间比较,凋亡率无明显差异(P＞0.05)。雷公藤红素10μmol/L浓度组的细胞凋亡率较5μmol/L组明显降低(P＜0.05)。红素浓度为2μmol/L时,作用3h、6h、12h、24h后细胞凋亡率分别为(19.67±0.16)%、(37.44±1.01)%、(40.10±1.42)%、(46.53±0.37)%,各组之间相比较有统计学意义(P＜0.05)。3.流式细胞仪对细胞凋亡峰的定量分析用流式细胞仪PI单染法测定结果显示:1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L雷公藤红素作用于急性髓系白血病原代细胞6h后,均可出现G1亚峰(Apoptosis峰),凋亡峰定量分析结果分别(19.34±5.28)%、(39.84±9.99)%、(46.40±2.67)%、(32.32±8.42)%,均明显高于不加药物的对照组(P＜0.01);2μmol/L组和5μmol/L、10μmol/L组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),与1μmol/L组相比较,差异有统计学意义(P＜0.05);雷公藤红素10μmol/L浓度组细胞凋亡率较5μmol/L组明显降低(P＜0.05)。结论1.雷公藤红素在(1～10μmol/L)浓度范围内可抑制急性髓系白血病原代细胞的增殖,最适作用浓度为2μmol/L,最适作用时间为6h。2.雷公藤红素在(1～10μmol/L)浓度范围内,可诱导急性髓系白血病原代细胞凋亡,提示诱导细胞凋亡可能是雷公藤红素抗白血病作用的重要机制。
黄黎黎[8]2011年在《雷公藤红素通过HIF-1α-Sema4D信号通路对乏氧诱导血管新生的抑制作用的研究》文中研究表明目的:研究雷公藤红素(Celastrol)对乏氧诱导的肿瘤血管新生的影响,并探讨其可能机制。方法:不同浓度的Celastrol处理乏氧条件下的血管内皮细胞株(EA.hy926)和肿瘤细胞株(HepG2和A549)6h或16h后,采用MTT法检测Celastrol对乏氧条件下细胞增殖的影响;小管形成实验及迁徙实验检测Celastrol对乏氧诱导的内皮细胞血管新生的影响;FITC-phalloidin及侵袭实验检测Celastrol对乏氧诱导的肿瘤细胞侵袭能力的影响;Real-time PCR检测Celastrol对乏氧条件下轴突导向因子4D(Semaphorin 4D,Sema4D)mRNA表达的影响;Western blot及ELISA检测Celastrol对乏氧条件下Sema4D膜型及分泌型蛋白表达的影响。结果:Celastrol抑制乏氧条件下血管内皮细胞(EA.hy926)及肿瘤细胞(A549和HepG2)的增殖,干预6h后,IC50值分别为10.16±0.21,11.60±1.61,14.97±0.73μg/mL,作用时间延长至16h时,IC50值分别为6.54±0.30,4.32±0.45,5.66±0.51μg/mL,其抑制作用呈剂量和时间依赖性;乏氧可以诱导内皮细胞迁徙,乏氧干预16h后,透膜细胞数量增加,给予0.25,0.75,2μg/mLCelastrol干预后,可剂量依赖性降低内皮细胞迁徙;乏氧可以诱导内皮细胞小管形成,乏氧干预16h后,细胞连接形成小管样网状结构,给予0.25,0.75,2μg/mLCelastrol干预后,可剂量依赖性抑制内皮细胞形成管腔的能力;乏氧可以诱导肿瘤细胞骨架重建,乏氧干预16h后,F-actin显着增加,中间张力丝平行排列,细长的丝状伪足和片状伪足明显可见,给予2μg/mL Celastrol干预后,F-actin细胞形态明显回复,仅见少量的丝状和片层伪足;乏氧可以诱导肿瘤细胞侵袭,乏氧干预16h后,穿越Matrigel“屏障”的细胞数量增加,给予0.25,0.75,2μg/mL Celastrol干预后,可剂量依赖性抑制肿瘤细胞侵袭;与单纯乏氧组相比,Celastrol处理组明显抑制A549细胞中Sema4D mRNA及膜型和分泌型蛋白的表达。结论:Celastrol能明显抑制乏氧诱导的血管新生,下调Sema4D基因及蛋白的表达可能是Celastrol抗乏氧诱导的血管新生的重要机理之一。目的:研究雷公藤红素(Celastrol)对乏氧诱导的HIF-1α信号通路及其上游信号通路PI3K/Akt的影响。方法:在乏氧条件下培养肝癌细胞株HepG2细胞16h,并以不同浓度Celastrol处理,采用免疫荧光及Western blot检测Celastrol对乏氧诱导的细胞核内HIF-1α表达的影响;Real-time PCR检测Celastrol对常氧及乏氧条件下HIF-1αmRNA表达的影响;Real-time PCR检测Celastrol对HIF-1α靶基因VEGF及CA9 mRNA表达的影响;ELISA检测Celastrol对VEGF蛋白表达的影响;Western blot检测Celastrol对Akt及pAkt蛋白表达的影响。结果:常氧状态下HepG2细胞中HIF-1α少量表达且主要表达于胞质,单纯乏氧组经16h乏氧干预后HIF-1α表达明显上调且集中表达于胞核,给予2μg/mL Celastrol干预后,HepG2细胞中HIF-1α荧光染色强度明显减弱且胞核中表达下降。Western blot结果显示,常氧下,HepG2细胞中仅有微量核蛋白表达。乏氧16 h,HepG2细胞中HIF-1α核蛋白表达显著增加。给予2μg/mL或4μg/mLCelastrol干预,HepG2细胞中HIF-1α核蛋白表达显著降低。Real-time PCR结果显示,常氧下,0.75-4μg/mL浓度范围内的Celastrol对HIF-1αmRNA的表达有明显的抑制作用。乏氧下,0.25-4μg/mL浓度范围内的Celastrol对HIF-1αmRNA的表达有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。单纯乏氧组与常氧相比,VEGF和CA9 mRNA表达量显着增加,0.25-4μg/mL浓度范围内的Celastrol可明显抑制乏氧诱导的VEGF和CA9 mRNA,且该作用呈剂量依赖性。ELISA结果显示,乏氧干预16 h后,VEGF的浓度显着增加,给予浓度梯度为0.25, 0.75, 2μg/mL Celastrol处理后,VEGF浓度明显下降,且呈剂量依赖性。Western blot结果显示,乏氧下,HepG2细胞中Akt和pAkt蛋白均有较强表达,给予0.25-4μg/mL Celastrol干预,HepG2细胞中Akt和pAkt蛋白表达均显着降低。结论:Celastrol能明显抑制乏氧肿瘤细胞中HIF-1α信号通路,该作用部分是通过对PI3K/Akt通路的抑制实现的。下调HIF-1α基因及蛋白的表达可能是Celastrol抗血管新生及抑制Sema4D表达的重要机理之一。
杨杰[9]2008年在《雷公藤红素对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞的作用》文中研究表明目的:观察雷公藤红素对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞(mouse retinal endothelial cells,MREC)的增殖和凋亡及VEGF表达的影响,为视网膜新生血管的药物防治提供新的思路和理论依据。方法:体外原代培养MREC,通过免疫细胞化学方法检测FⅧr-Ag鉴定培养的MREC;使用不同浓度的雷公藤红素作用于原代培养的MREC,分别使用MTT法和流式细胞术观察其对细胞增殖和凋亡的影响,使用免疫细胞化学检测药物作用前后MREC中VEGF的表达,并使用血管抑素150μg/ml做为阳性对照组药物。结果: 1:免疫细胞化学检测体外原代培养的MREC,Ⅷ因子相关抗原抗体染色,呈阳性染色;2:MTT比色法结果显示,用0.01μg/ml,0.02μg/ml,0.05μg/ml,0.1μg/ml, 0.5μg/ml的雷公藤红素处理MREC培养24h、48h和72h ,雷公藤红素0.02μg/ml以上时,与对照组比较有显着性差异(P<0.05)。作用24h细胞增殖抑制率分别为8.62±4.23%,24.41±6.27%,46.51±5.95%,65.62±9.21%,65.62±9.21%,74.69±11.26%;作用48h细胞增殖抑制率分别为9.34±3.78%、26.21±7.35%、51.36±6.39%、66.59±8.99%、73.19±10.24%、76.16±15.21%;作用72h细胞增殖抑制率分别为11.24±4.62%、32.69±7.21%、55.28±10.25%、70.22±9.34%、75.84±13.69%、78.93±10.76%。随着药物浓度的逐渐提高,作用时间的增加,细胞存活率逐渐下降,而细胞抑制率逐渐升高;3:流式细胞术结果分析显示,当雷公藤红素浓度为0.05μg/ml时,MREC的凋亡率为8.42±1.07%,与空白对照组有差异性(P<0.05),与对照血管抑素组间无显着差异性(P>0.05);4:分别用0.01μg/ml,0.02μg/ml,0.05μg/ml, 0.1μg/ml的雷公藤红素处理MREC培养24h ,行免疫细胞化学实验检测VEGF的表达,对图片用灰度值扫描显示随着药物浓度的增高,VEGF的表达量逐渐减少,雷公藤红素能下调VEGF的表达,也呈剂量依赖关系(p<0.05)。结论:雷公藤红素对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞的增殖有抑制作用,呈时间和剂量依赖性;并能诱导细胞的凋亡;雷公藤红素抑制视网膜新生血管与下调视网膜血管内皮细胞中VEGF的表达有关。
胡婕[10]2011年在《雷公藤红素逆转K562/A02细胞多药耐药的实验研究》文中研究指明白血病是造血系统常见的恶性肿瘤,是一组异质性起源的恶性克隆性疾病,年发病率3-4/10万。目前治疗白血病的方法主要是化疗,随着化疗方案的改进和新化疗药的出现、支持治疗的加强及干细胞移植技术的应用,白血病的治疗效果有了明显的改善。然而,多药耐药的产生则成为目前部分白血病患者不能获得缓解,或缓解后复发的主要原因。因此,寻找新的抗肿瘤药物、探索新的治疗方案具有重要的意义。近年来,中药及其有效的成分逆转白血病多药耐药引起了人们的注意。雷公藤泛指卫矛科雷公藤属植物,是我国传统的中药材。雷公藤红素是雷公藤单体之一,是一种叁萜类天然化合物,又名南蛇藤素,分子式为C29H38O4。,分子量为450。文献报道雷公藤红素有免疫抑制、抑制血管内皮细胞体外增值、抑制HMC-1细胞的黏附及其黏附分子的表达；雷公藤红素还能体外诱导非小细胞肺癌细胞株H1299、人急性髓系白血病细胞株HL-60、恶性胶质细胞瘤株、视网膜母细胞瘤等肿瘤的凋亡。本研究以人慢性粒细胞白血病急变K562细胞株和耐阿霉素K562/A02细胞株为靶细胞,采用CCK-8方法和流式细胞术,探讨雷公藤红素对K562/A02细胞的逆转作用,并检测了雷公藤红素对K562/A02细胞内ADM浓度和P-gp的表达的影响。方法：1、K562和K562/A02细胞的培养K562细胞培养于含10%新生牛血清、100U/ml青霉素和1000ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基中,K562/A02细胞培养于含阿霉素(ADM 1μmol/L)的上述培养基中,将2种细胞置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养,2-3天传代1次,其中K562/A02细胞在实验前两周改用无阿霉素的培养基培养。取对数生长期细胞用于实验。2、CCK-8法检测ADM、雷公藤红素的细胞毒性及耐药细胞的耐药倍数取对数生长期细胞,采用台盼兰染色活细胞计数方法。取30 u 1细胞悬液,用台盼兰染色后镜检100个细胞并计算活细胞百分率,其中拒染细胞为活细胞,染成蓝色的细胞为死细胞。取存活率大于95%的细胞为实验细胞。将K562和K562/A02细胞(2～3×109cells/孔)于96孔板中,由高到低浓度分别加入ADM(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μmol/L),雷公藤红素(320、160、80、40、20、10、5、2.5μmol/L),每孔设3个复孔,终体积150 u l。在37℃、5%CO2培养箱中培养72小时后,每孔加入CCK-8试剂10μ1,继续培养2小时,以空白孔调零,在全自动酶标仪450nm处测吸光度值,参比波长650nm。所测数据采用SPSS16.0统计软件计算生长抑制率在50%的药物浓度即半数抑制率(IC50)。抑制率(%)=(1-实验组0D值/对照组OD值)×100%；耐药倍数=(耐药细胞的IC50/敏感细胞的IC50)。实验重复3次,取平均值。3、CCK-8法检测雷公藤红素耐药逆转性取对数生长期、存活率大于95%的K562/A02细胞(2～3×104cells/孔)于96孔板中。实验分组：①K562/A02、②K562/A02+雷公藤红素、③K562/A02+VLP。所加ADM等药物浓度同上,每孔设3个平行孔,终体积150μl。并用维拉帕米(VLP)组5μg/L作为阳性对照。在37℃,5%CO2培养箱中孵育72小时后加入10μl CCK-8,继续培养2小时后,以空白孔调零,检测波长同上。计算半数抑制率(IC50)。实验重复3次。逆转倍数=(耐药细胞逆转前的IC50/耐药细胞逆转后的IC50)。4、流式细胞术检测K562和K562/A02细胞内的ADM浓度取对数生长期、存活率大于95%的细胞于24孔板中,实验分6组①K562/A02、②K562/A02+ADM、③K562/A02+ADM+雷公藤红素(IC50)、④K562/A02+ADM+雷公藤红素(IC50)、⑤K562、⑥K562+ADM。第③、④组分别先加入IC10和IC50的雷公藤红素,24h后在第②③④⑥组中再加入ADM10μg/ml,药物作用3小时,收集细胞1×106个细胞,冷PBS(4℃,0.01mol/L,Ph7.4)洗涤2次,再重悬于冷PBS液中,4℃保存至上样进行流式细胞仪检测(激发波长Ex=488nm,发射波长Em=575nm)。5、流式细胞术检测P-gp表达取对数生长期、存活率大于95%的细胞于24孔板中,实验分4组,分别为①K562/A02、②K562/A02+ADM(IC50)、③K562/A02+雷公藤红素(IC50)、④K562/A02+ADM(IC50)+雷公藤红素(IC50),置培养箱孵育48h后,收集细胞,约3×105个细胞,用冷的PBS液洗2遍,按操作说明加入P-gp抗体,室温下避光孵育30分钟后上流式细胞仪检测,并给出相应的P-gp表达率。结果：1、雷公藤红素对K562、K562/A02细胞的增值抑制作用结果雷公藤红素对K562和K562/A02细胞的IC50分别为411.59±26.551μmol/L和295.58±23.288μmol/L,两者差异明显(P<0.05)。ADM对K562、K562/A02的IC50分别为0.749±0.741μmol/L、59.755±6.883μmol/L,耐药倍数为79.78倍,说明K562/A02对ADM有明显的耐药性(P<0.05)。细胞毒剂量的雷公藤红素可降低ADM对K562/A02细胞的IC50,提高对ADM的敏感性,应用雷公藤红素后,IC50为0.507±0.070μmol/L,较单用ADM明显减低(P<0.05),耐药性逆转倍数(RF)为117.860倍；而加入5μg/L维拉帕米后的IC50为17.196±6.303μmol/L,也明显低于单用ADM组(P<0.05),RF为3.745倍。2、流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度和细胞膜P-gp的表达结果经流式细胞仪检测发现加入雷公藤红素后,细胞内的ADM的浓度明显增加,加入IC,。浓度的雷公藤红素和IC50浓度的雷公藤红素后细胞内的阿霉素浓度分别为73.727±8.626、102.86±4.518；增加倍数分别为1.102和1.537倍。且两组细胞内的阿霉素浓度有明显差异(P<0.05)。单用阿霉素时,K562/A02细胞的P-gp的表达波峰无明显影响；单用雷公藤红素后,K652/A02细胞的P-gp的表达波峰明显降低；当雷公藤红素和阿霉素合用后,K562/A02细胞的P-gp的表达也比单用阿霉素有明显的降低。结论：1、阿霉素和雷公藤红素对K562/A02、K562的半数抑制率浓度(IC50)均有显着差异。K562/A02细胞对ADM的耐药性是K562细胞的79.78倍。2、细胞毒剂量的雷公藤红素作用后,ADM对K562/A02细胞的IC50显着下降。3、细胞毒剂量和非细胞毒剂量的雷公藤红素处理后的K562/A02细胞和K562细胞内的ADM浓度显着增加。4、雷公藤红素能明显下调K562/A02细胞的P-gp表达。
参考文献：
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[10]. 雷公藤红素逆转K562/A02细胞多药耐药的实验研究[D]. 胡婕. 郑州大学. 2011
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