猪链球菌2型VicRK双组份调控系统的功能研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人兽共患病原菌,不仅会给养殖业造成巨大的经济损失,而且严重影响人类的公共安全。根据荚膜多糖抗原的差异可以分为29个血清型,其中2型（SS2）为危害最严重的血清型。首次报道的人感染猪链球菌病的国家为丹麦,后来在欧洲,北美洲,南美洲,大洋洲,亚洲等多个地区都有人感染SS2的报道。双组份调控系统是细菌感应外界变化并作出重要应答反应的一种系统,其对细菌的生长代谢和致病性发挥着重大的作用。YycG/YycF双组份系统最早发现于枯草芽孢杆菌中,后来由于其在细胞壁代谢中发挥着重要的作用被命名为WalK/WalR,在肺炎链球菌中被命名为VicK/VicR。有文献报道VicRK在一些细菌的链长、形态、生长、代谢、细胞壁稳态、生物被膜、细胞毒力等方面发挥着重要的作用,但是在猪链球菌中却没有相关的报道。本文主要对猪链球菌2型VicRK双组份系统进行研究,了解其作用机制。具体内容如下:1.猪链球菌2型vicK基因缺失突变株和互补菌株的构建及生物学特性在构建vicK/vicR缺失突变株的过程中发现vicR基因缺失致死,只构建了vicK基因缺失突变株。在ΔvicK突变株的基础上利用电转化的方法构建了互补菌株CΔvicK。通过革兰氏染色的方法研究了野生株WT、突变株ΔvicK、互补菌株CΔvicK在链长,形态等方面特点,结果显示三个菌株的链长,形态无明显的差异,说明vicK基因对SS2的链长和形态没有影响。通过在TSB加10%血清静止、摇动、加入0.5 mmol/L二酰胺、加入0.5 mmol/L过氧化氢、加入3 mmol/L百草枯以及不加血清等条件下测定三个菌株的生长曲线,结果显示除了不加血清的条件,突变株ΔvicK生长速率明显低于野生株和互补菌株,其他条件三个菌株生长没有明显差异,说明vicK基因除了在低营养条件下对SS2的生长有影响外在其他条件下并不对SS2造成影响。2.vicK基因对SS2致病性的影响对hBMEC（人脑微血管内皮细胞）黏附和Hep-2细胞（人喉癌上皮细胞）黏附、入侵实验中,发现vicK基因缺失突变株ΔvicK的黏附、入侵能力明显低于野生株和互补菌株。在人血全血杀菌实验中,发现突变株ΔvicK在全血中的存活能力明显低于野生株,说明vicK基因在SS2抵抗先天性免疫中发挥着重要的作用。在仔猪竞争感染实验中,发现突变株ΔvicK在各个器官中的定植能力明显低于野生株,说明vicK基因在SS2的毒力方面发挥着重要的作用。为了寻找VicRK双组份调控系统调控的毒力基因,我们做了RNA-seq实验,并验证了其数据的准确性,从RNA-seq数据中找到了9个可能受控制的毒力基因,并用EMSA（凝胶电泳实验）验证了这些毒力基因是受VicRK双组份调控系统调控的。

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摘要

Abstract

缩略语表（Abbreviation）

1.前言

1.1 猪链球菌病

1.1.1 病原学

1.1.2 流行病学

1.1.3 临床症状

1.1.4 诊断和治疗

1.1.5 预防和控制

1.2 双组份调控系统（TCS）

1.2.1 猪链球菌中的双组份调控系统

1.2.2 VicK/VicR系统的研究进展

1.3 猪链球菌毒力因子的研究进展

1.3.1 细菌表面成分

1.3.2 表面与分泌蛋白

1.3.3 酶类毒力因子

1.3.4 蛋白调控因子

2.研究目的与意义

3.实验材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、质粒和培养条件

3.1.2 主要试剂

3.1.3 培养基与抗生素的配制

3.1.4 主要缓冲液及其配制

3.1.5 主要仪器与设备

3.1.6 引物

3.1.7 实验动物和实验细胞

3.2 实验方法

3.2.1 自杀性重组质粒的构建

3.2.2 猪链球菌2 型基因缺失突变株的构建

3.2.3 C?vicK互补菌株的构建

3.2.4 野生株、突变株和互补菌株的基础生物学特性研究

3.2.5 细胞黏附、入侵实验

3.2.6 人全血杀菌实验

3.2.7 竞争感染实验

3.2.8 猪链球菌RNA的提取

3.2.9 RNA-seq

3.2.10 荧光定量PCR

3.2.11 VicR蛋白的表达和纯化

3.2.12 EMSA实验

3.2.13 统计分析

4.结果与分析

4.1 多序列比对

4.2 猪链球菌2型vicK基因缺失突变株鉴定

4.3 猪链球菌2型vicK基因互补菌株的鉴定

4.4 体外生长特性比较

4.4.1 形态学比较

4.4.2 溶血环观察

4.4.3 生长特性比较

4.4.4 体外应激反应

4.5 突变株ΔvicK对细胞黏附能力下降

4.6 vicK能促进猪链球菌2 型菌株在人全血中的存活

4.7 vicK基因影响猪链球菌2 型菌株对仔猪的毒力

4.8 差异基因检测

4.9 筛选与毒力相关基因

4.10 VicR蛋白的鉴定

4.11 VicR蛋白能够直接调控一些毒力基因的表达

5.讨论

5.1 课题的选择

5.2 VicRK双组份系统与猪链球菌2 型的应激反应

5.3 VicRK双组份系统与猪链球菌2 型的致病性

6.结论

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹嫚嫚

导师: 贝为成

关键词: 猪链球菌型,双组份系统,系统,毒力,凝胶电泳实验

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.611

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000579

总页数: 68

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猪链球菌2型VicRK双组份调控系统的功能研究

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