奶牛溶菌酶基因（Lyz）和气管抗菌肽基因（TAP）表达质粒的构建、抗菌效果及安全性评价

论文摘要

随着乳制品消费水平的不断提高,人们越来越关注牛奶的质量。奶牛乳腺炎已经成为严重影响牛乳品质的重要因素,抗生素是比较有效的治疗手段,但抗生素带来的负效应日益凸显,病原菌耐药性增强、牛乳中抗生素残留等众多问题,导致奶牛产奶量降低和生乳品质下降。因此,研发新型可替代抗生素的产品,对于提升牧场经济效益、提高牛乳品质具有重大意义。本研究通过RT-PCR、同源重组等技术构建奶牛溶菌酶基因（Lyz）/气管抗菌肽基因（TAP）乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。将上述质粒转染到奶牛的原代乳腺上皮细胞和泌乳高峰期的小鼠中,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白,荧光定量PCR和Western Blot检测技术验证上述质粒在乳腺上皮细胞水平和乳腺组织水平的特异性表达。通过细胞功毒实验分析表达产物抗菌效果,通过小鼠负重实验、耐缺氧实验、体重变化称量、血液生化指标和脏器指数评估重组质粒的安全性。旨在通过重组质粒实现奶牛溶菌酶、气管抗菌肽内源抗菌物质在乳腺组织的特异性表达,提高奶牛自身的免疫力,以达到防治乳腺炎和提高原料奶质量的目的。主要研究结果如下:1治疗奶牛乳腺炎表达质粒的构建通过RT-PCR从牛乳腺上皮细胞扩增Lyz、TAP基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中,利用同源重组技术,以奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因（BLG）启动子替换pEGFP-N1载体原有CMV启动子,构建了奶牛溶菌酶基因（Lyz）/气管抗菌肽基因（TAP）乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。琼脂糖凝胶电泳结果显示,奶牛溶菌酶基因（LLz）、气管抗菌肽基因（TAP）和β-乳球蛋白基因（BLG）启动子序列,PCR扩增出与预期片段长度匹配的条带,且菌液PCR检测显示,每个目的片段均连接到增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中的所需位置。BLG基因启动子克隆测序后,通过BLAST比对发现,克隆的启动子序列与数据库中该基因5’上游相似性达99%。分析该片段,分别在第887bp-892bp、1188bp-1191bp、2080-2085bp位置存在GC-box、CAAT-box和TATA-box的启动子元件,表明所选片段为BLG基因的启动子片段。重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP测序结果显示与目的片段长度相符,目的基因阅读框正确,未出现错误位置。2重组质粒细胞表达活性及抗菌效果采用脂质体转染法将重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP分别转染至奶牛原代乳腺上皮细胞（bPMEC）和人肾脏上皮细胞（HEK293T）,荧光显微镜观察到只有奶牛原代乳腺上皮细胞在转染两种重组质粒后均表现出绿色荧光,人肾脏上皮细胞无显色。荧光定量PCR检测也表明两种重组质粒只有在转染至奶牛原代乳腺上皮细胞后,基因Lyz、TAP相对表达量极显著高于未转染空白对照组,在人肾脏上皮细胞中无表达。用重组质粒转染的原代乳腺上皮细胞感染金黄色葡萄球菌后,细胞存活率显著高于未转染重组质粒的对照组,与未感染金黄色葡萄球菌、未转染重组质粒的空白组对比没有显著差异。细胞死亡率极显著低于对照组（P<0.01）。3重组质粒小鼠乳腺的表达和安全性评价通过尾静脉注射法使用基因体外转染试剂,将重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP转染至处于泌乳高峰期的小鼠体内,荧光定量PCR结果显示,小鼠乳腺组织中基因TAP和Lyz的表达水平显著增加。在小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中未检测到靶基因的表达。Western Blot检测显示,在转染重组质粒的小鼠乳腺组织中检测到重组质粒绿色荧光蛋白基因EGFP所表达的蛋白质产物,在未用重组质粒转染的小鼠乳腺组织中未检测到该表达产物。对小鼠的各种生理生化指标进行检测表明,发现重组质粒对小鼠行为活动指标、质量变化、血液生化指标、脏器指数无显著影响。本研究制备了两种新型乳腺特异性表达质粒,并验证了细胞水平、活体水平的表达情况和抗菌效果,为未来该质粒应用于奶牛乳腺炎的防治奠定了一定的基础,为奶牛乳腺炎的防治提供了新思路、新方法,为奶牛溶菌酶、奶牛气管抗菌肽在奶牛乳腺中特异性表达、研发新型可替代抗生素产品提供重要理论依据和技术支持。

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第一章文献综述

1 奶牛乳腺炎的病因及危害

1.1 病原微生物因素

1.2 饲养管理因素

1.3 奶牛自身因素

1.4 奶牛乳腺炎的危害

2 奶牛乳腺炎治疗技术研究进展

3 奶牛溶菌酶的研究进展

3.1 奶牛溶菌酶的生物学功能

3.2 奶牛溶菌酶的应用

4 奶牛气管抗菌肽的研究进展

4.1 抗菌肽生物学功能

4.2 抗菌肽的应用

5 重组质粒应用于治疗奶牛乳腺炎的设想

第二章治疗奶牛乳腺炎表达质粒的构建

1 材料

1.1 血样、载体与细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 引物设计与合成

2.2 基因克隆模板获取

2.3 奶牛乳腺特异性表达启动子（BLG）基因序列的克隆与鉴定

2.4 Lyz基因编码序列的克隆与鉴定

2.5 TAP基因编码序列的克隆与鉴定

2.6 Lyz/TAP基因乳腺特异性表达质粒的构建

3 结果与分析

3.1 奶牛BLG启动子序列PCR扩增与序列分析

3.2 奶牛Lyz基因编码序列PCR扩增与重组质粒鉴定

3.3 奶牛TAP基因编码序列PCR扩增与重组质粒鉴定

3.4 奶牛Lyz/TAP基因乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz/TAP的鉴定

4 讨论

4.1 目的基因的选择

4.2 乳腺特异性表达启动子的筛选

5 小结

第三章重组质粒转染细胞表达活性及抗菌效果

1 材料

1.1 乳腺组织与细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 奶牛乳腺原代上皮细胞分离培养与纯化

2.2 Lyz/TAP重组质粒在乳腺上皮细胞的特异性表达

2.3 Lyz/TAP重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞的抗菌效果

3 结果与分析

3.1 Lyz/TAP基因在奶牛乳腺上皮细胞中的特异性表达

3.2 Lyz/TAP重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞表达量分析

3.3 Lyz/TAP重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞的抗菌效果分析

4 讨论

4.1 重组质粒在奶牛乳腺上皮细胞的特异性表达

4.2 重组质粒转染对乳腺上皮细胞抗菌能力的影响

5 小结

第四章 Lyz/TAP重组质粒小鼠乳腺表达及安全性评价

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 小鼠体内转染Lyz/TAP重组质粒

2.2 Lyz/TAP重组质粒在小鼠乳腺组织中的特异性表达

2.3 Lyz/TAP重组质粒对小鼠的安全性评价

3 结果与分析

3.1 荧光定量PCR和Western Blot实验结果

3.2 Lyz/TAP重组质粒对小鼠行为活动的影响

3.3 Lyz/TAP重组质粒对小鼠呼吸运动的影响

3.4 Lyz/TAP重组质粒对小鼠体重的影响

3.5 Lyz/TAP重组质粒对小鼠血液指标的影响

3.6 Lyz/TAP重组质粒对小鼠脏器指数的影响

4 讨论

4.1 重组质粒在小鼠乳腺组织的特异性表达

4.2 重组质粒对小鼠安全性的影响

5 小结

第五章全文结论

参考文献

致谢

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张志鹏

导师: 杨章平

关键词: 奶牛乳腺炎,牛乳品质,溶菌酶,气管抗菌肽,安全性

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 江苏现代农业(奶牛)产业技术体系(JATS[2018]300),江苏省农业自主创新基金(CX(17)1005)

分类号: Q78;S858.23

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001579

总页数: 63

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奶牛溶菌酶基因（Lyz）和气管抗菌肽基因（TAP）表达质粒的构建、抗菌效果及安全性评价

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