PABPC1影响甲型流感病毒复制的分子机制研究

论文摘要

甲型流感病毒（InfluenzaAVirus）是分节段的单负链RNA病毒,能够造成人类季节性流感流行和大流感爆发。我们知道,病毒在细胞中复制能力取决于病毒与宿主细胞之间的博弈能力,即体现在病毒与宿主因子相互作用的差异,特别是针对甲型流感病毒在宿主细胞核中进行病毒基因组转录与复制,因此会有更多的宿主因子和病毒因子的相互作用来参与调控二者之间的博弈。为了筛选出潜在的宿主因子,我们以串联亲和纯化系统（Tandem Affinity Purification Tag system,TAP-Tags）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）相结合,以物理性的相互作用与功能性分析相结合,对病毒的主要8个病毒因子（PA,PB1,PB2,NP,M1,M2,NS1,NS2）与宿主因子间相互作用进行筛选,我们共筛选到185个宿主因子。宿主因子的功能分析表明,这些宿主因子大部分参与RNA的加工、剪接和调控等过程,符合甲型流感病毒的复制特征。我们进一步利用RNAi（RNA interference）技术筛查了27个综合得分较高的宿主因子对甲型流感病毒复制的影响。结果显示,具有正向调控病毒复制的宿主因子有10个,没有明显调控作用的宿主因子有16个。有意思的是,我们首次发现在敲低PABPC1（Poly（A）Binding Protein,Cytoplasmic 1）后,甲型流感病毒的复制能力明显增强,PABPC1是具有负调控作用的宿主因子,这与之前的报道有所不同。PABPC1属于PABP家族,能够对mRNA进行转录后和翻译水平调控。我们研究结果显示,PABPC1能够抑制甲型流感病毒的蛋白表达,尤其是对HA、NA、M2和NS2的抑制效果显著。但是,我们检测病毒的mRNA后发现,PABPC1对病毒mRNA的稳定性并没有显著影响。然后我们通过病毒RNP重组系统（Viral Ribonucleoprotein Reconstitution System）进行验证,结果显示PABPC1 同样能够显著抑制HA、NA、M2和NS2的表达。我们继续以病毒HA的重组RNP系统深入研究发现,PABPC1以剂量依赖的方式抑制HA的蛋白表达和vRNA的合成,并在翻译水平影响HA的蛋白表达。通过对PABPC1的功能区域分析,我们发现PABPC1的RRM1（RNA recognitionmotif1）具有关键作用,缺失RRM1后,HA的表达发生回复。当病毒感染时PABPC1会重新定位到细胞核中,可能与抑制病毒复制有关。这些结果表明PABPC1负调控甲型流感病毒的复制。在前期筛选时,PABPC1与病毒非结构蛋白NS1存在相互作用,我们进一步验证发现,与之前的报道相反,PABPC1与NS1的相互作用是依赖于RNA介导的,NS1能拮抗PABPC1对流感病毒复制的负调控作用,但是作用机制有待进一步研究。总之,我们通过对病毒因子相互作用的宿主因子筛选,得到大量候选研究对象。我们首次发现PABPC1对甲型流感病毒复制具有负调控作用。PABPC1主要在病毒的mRNA的翻译过程中进行负调控,这可能是宿主细胞针对非己mRNA识别和抑制的天然保护措施。甲型流感病毒在长期进化过程中也产生了相应的拮抗作用,较为充分的体现了甲型流感病毒与宿主细胞间的博弈。以上研究结果不仅会深化我们对宿主因子在流感病毒RNA转录与复制中作用的认识,并会为开发新型抗病毒药物提供新思路。

论文目录

摘要

Abstract

英文缩略表

第一章前言

1.1 甲型流感病毒

1.1.1 甲型流感病毒的结构和蛋白

1.1.2 甲型流感病毒的复制周期及相互作用宿主因子

1.1.3 甲型流感病毒非结构蛋白NS1的结构和功能

1.2 PABPC1的结构和功能

1.2.1 PABPC1的结构

1.2.2 PABPC1的功能

1.2.3 PABPC1与流感病毒

第二章与甲型流感病毒因子相互作用的细胞宿主因子筛选

2.1 引言

2.2 材料及方法

2.2.1 病毒和细胞

2.2.2 质粒和抗体

2.2.3 TAP-TAG纯化

2.2.4 蛋白质免疫印迹

2.2.5 银染色法

2.2.6 LC-MS/MS分析

2.2.7 生物信息学分析

2.2.8 RNAi技术

2.2.9 流感病毒感染细胞

2.2.10 统计分析

2.3 实验结果

2.3.1 甲型流感病毒蛋白的表达和TAP-tag纯化

2.3.2 LC-MS/MS分析以及IAV蛋白-人蛋白相互作用

2.3.3 生物信息学分析

2.3.4 NP相互作用的蛋白分析

2.3.5 NS1相互作用的蛋白分析

2.3.6 RNAi技术验证筛选蛋白在甲型流感病毒感染中的作用

2.4 讨论

第三章 PABPC1影响甲型流感病毒复制的分子机制研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 细胞

3.2.2 质粒和抗体

3.2.3 RNAi敲低PABPC1表达

3.2.4 流感病毒生长曲线的测定

3.2.5 流感病毒的单轮感染

3.2.6 噬斑测定流感病毒滴度

3.2.7 RNP重组系统的构建

3.2.8 蛋白免疫印迹

3.2.9 RNA的提取

3.2.10 RT-qPCR

3.2.11 Primer Extension

3.2.12 RNA降解速率的测定

3.2.13 Poly（A）尾长度的测定

3.2.14 核糖体分析

3.2.15 间接免疫荧光

3.2.16 免疫共沉淀

3.2.17 数据分析

3.3 实验结果

3.3.1 PABPC1抑制流感病毒复制

3.3.2 甲型流感病毒抑制PABPC1的表达

3.3.3 PABPC1差异影响甲型流感病毒的蛋白表达

3.3.4 PABPC1对RNP重组系统的影响

3.3.5 PABPC1以剂量依赖的方式抑制HA的表达

3.3.6 PABPC1对甲型流感病毒不同亚型的聚合酶和HA有抑制作用

3.3.7 PABPC1的抑制作用不依赖于NCR

3.3.8 PABPC1不影响病毒RNA聚合酶活性

3.3.9 PABPC1降低RNP重组系统的翻译水平

3.3.10 PABPC1的RRM1具有关键抑制作用

3.3.11 甲型流感病毒感染时内源PABPC1的定位发生变化

3.3.12 过表达PABPC1不影响甲型流感病毒的mRNA的稳定性

3.3.13 PABPC1和NS1的相互作用依赖于RNA的介导

3.3.14 NS1拮抗PABPC1的抑制作用

3.4 讨论

第四章研究总结

4.1 研究结论

4.2 研究中的不足及有待解决的问题

参考文献

文章情况

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张文钰

导师: 邓涛

关键词: 甲型流感病毒

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 北京协和医学院

分类号: R373.13

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000086

总页数: 106

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