导读:本文包含了亚低温培养论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:保护剂,原代,神经元,神经组织
亚低温培养论文文献综述
高筱雅,潘速跃,黄建欧,胡亚芳,顾勇[1]（2014）在《体外培养原代皮质神经元糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂》一文中研究指出保护缺血半暗带区细胞是大面积脑梗死治疗的主要目标。目前的神经保护剂在临床转化方面均遇到了障碍,这是由于一种药物靶点过于单一,不能对复杂的缺血级联产生有效应的结果。治疗性低温用于治疗脑梗死疗效有限,并且还有许多副作用。因此,有必要联合应用有效的神经保护剂和亚低温(HT)以改善脑梗死的疗效。目的筛选与HT有协同作用的神经保护剂,并验证联合(本文来源于《中华医学会第十七次全国神经病学学术会议论文汇编（下）》期刊2014-09-18）
高筱雅[2]（2014）在《体外培养原代皮质神经元重度糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究》一文中研究指出研究背景中国脑血管病年均发病率为193-779/10万,死亡率81-441/10万不等,已经成为中国第一位的死因和致残原因。缺血性脑血管病——脑梗死占脑血管病的大多数,其中大面积脑梗死的死亡率可高达80%,且绝大部分导致严重残疾。脑血管病的高发病率、高致死率、高致残率,给社会和家庭带来沉重的负担。如何降低大面积脑梗死的致残率和致死率是目前研究的热点和难点。脑缺血后神经细胞的损害是一系列缺血级联效应的后果,包括线粒体功能紊乱、细胞内钙超载、高钠和低K+、ROS和NO生成增加、兴奋性氨基酸毒性、炎性因子及粘附分子释放增加、微血管阻塞、血脑屏障破坏、Caspase蛋白家族的级联激活等。在梗死后几分钟到几天,不同的病理过程在时间上互相重迭并起到推波助澜的作用。脑梗死病变区按缺血的程度可分为缺血核心区和缺血半暗带区。核心区内细胞因完全缺血、过度激活的兴奋性神经递质／受体的毒性等致使细胞在几分钟内死亡。缺血半暗带区的细胞因缺血后周边侧枝循环的再灌注,还有存活的可能。由于再灌注时间窗只有4.5h,许多患者就诊时核心区的细胞已不可逆死亡,因此靶向干预缺血半暗带区是目前实验研究和临床治疗的主要目标。在脑保护治疗中,治疗性低温是目前被临床证明有效的脑保护措施之一。亚低温通常指28～35℃,而临床广泛应用的是33-314℃。亚低温在颅脑外伤、心肺复苏后缺血缺氧性脑病和新生儿窒息的治疗中都取得了卓着的成绩。但是,亚低温在脑梗死治疗方面的应用近年才刚刚起步,实验室及临床的证据尚不充足。我们前期的研究表明,亚低温可以缩小MCAO大鼠的梗死灶面积,但是神经功能评分并没有随之改善,因此需要进一步采取措施提高疗效。此外,亚低温治疗也有许多副作用,如寒战,过度镇静抑制呼吸功能,以及长时间亚低温使肺部感染、下肢深静脉血栓等并发症发生率增加等等。因此,有必要联合应用有协同作用的药物,以进一步改善亚低温治疗的效果,改善脑梗死的预后。目前有报道在体外或体内实验中具有神经保护作用的药物很多,从其作用机制来看,包括谷氨酸受体阻滞剂、Y-氨基丁酸受体激动剂、钙离子拮抗剂、自由基清除剂、抗生素和免疫抑制剂、生长因子类、5-羟色胺受体激动剂、膜成分及其稳定剂、脑代谢剂、神经肽类、抗糖尿病药物、激素类、中成药及各种新药等。但是,这些药物在临床转化方面均遇到了障碍。究其原因,除了动物实验设计缺陷、种族差异、药物疗效不够显着、临床应用时机大多晚于实验研究、副作用过大等之外,还因为脑梗死后的损害涉及到多个相互关联、互相重迭的病理机制,而一种药物仅仅作用于缺血级联的一个或某几个环节,作用靶点过于单一,不能对缺血级联产生有效应的结果。基于脑梗死病理机制的复杂性和多样性,联用多种有协同作用的药物或治疗方法有可能取得突破性的效果,如联合非药物性神经保护手段——治疗性低温。在亚低温与神经保护剂联合应用方面国内外均有所涉猎。国内外和我们前期的研究都证实,某些药物如硫酸镁、脑源性神经生长因子等,在与亚低温联用治疗实验动物脑梗死时表现出协同效应。但是,目前国内外尚未有研究对现有的神经保护剂与亚低温联用的疗效进行过系统的筛选。我们根据神经保护剂的作用机制、可获得性、毒性、易用性等特点选取了26种神经保护剂纳入研究。与动物模型和人体实验相比,体外糖氧剥夺／复糖复氧(OGD/R)模型可在体外模拟不同程度的缺血／再灌注状态,实验条件更一致,并能进行高通量的单药或复合药物筛选,耗时耗资少,具有动物模型及人体实验不可比拟的优越性；而神经元细胞是脑组织中的主要细胞,其预后决定了脑组织的总体预后,因此我们首先建立了原代皮质神经元的重度OGD/R模型,然后利用这一模型对26个神经保护剂与亚低温的联合作用进行了筛选。我们选取了细胞活力和凋亡率作为药物筛选的两个主要指标,前者反映活细胞数目的多少,后者反映细胞受损伤的程度。此外,脑梗死后的缺血级联过程中与神经元细胞有关的几个主要环节包括：细胞内钙超载、线粒体膜电位下降、ROS生成、NO生成、Caspase-3的激活,因此我们进一步验证了筛选出的药物与亚低温联合治疗对这些环节的保护作用。研究目的：(1)利用体外培养原代皮质神经元重度OGD/R细胞模型筛选与亚低温具有协同作用的神经保护剂；(2)在原代皮质神经元的体外重度OGD/R模型中,进一步验证联合应用神经保护剂和亚低温对缺血再灌注级联反应的各个环节的保护作用。研究方法：(1)体外培养原代皮质神经元,免疫组化神经元特异标记物β-Tubulin Ⅲ染色鉴定神经元细胞纯度。(2)建立原代皮质神经元体外重度OGD/R模型,体外模拟重度脑缺血／再灌注状态。体外培养原代皮质神经元随机分成5组：OGD1.5h、OGD3h、 OGD4.51h、OGD6h及正常对照组,每组4瓶细胞。OGD各组分别给予OGD1.5h、OGD3h、OGD4.5h. OGD6h后复糖复氧,正常对照组不予处理,48小时后采用Tunnel法测定细胞凋亡率,根据凋亡率选择适当的糖氧剥夺时间作为模型干预时间。(3)确立原代皮质神经元体外重度OGD/R后的最佳亚低温(HT)治疗方案。体外培养原代皮质神经元随机分成10组：HT33℃1.5h.HT33℃3h. HT33℃4.5h.HT33℃6h.HT34℃1.5h.HT34℃3h.HT34℃4.5h. HT34℃6h、OGD/R对照组及正常对照组,每组4瓶细胞。除正常组外所有组给予OGD4.5h后复糖复氧,然后各治疗组采用不同的亚低温水平和时间进行干预：33℃1.5h、33℃3h、33℃4.5h、33℃6h、34℃1.5h、34℃3h.34℃4.5h、34℃6h,OGD/R对照组不予处理,48小时后采用Tunnel法测定细胞凋亡率,以细胞凋亡率最低的亚低温水平和时间作为最佳亚低温治疗方案。(4)筛选神经保护剂的最佳工作浓度：将原代皮质神经元细胞随机分为3-5组,每组6个复孔,给予OGD/R后采用不同剂量的神经保护剂进行治疗,CCK-8试剂盒检测细胞活力,采用细胞活力改变率(ΔCV%)衡量神经保护剂对神经元的保护作用,选取细胞活力改变率最低的药物浓度作为下一步实验时的工作浓度。(5)筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂：将原代皮质神经元细胞随机分为5组,神经保护剂组、HT组、神经保护剂+HT组、OGD/R对照组及正常对照组,每组6个复孔(测细胞活力)或4个瓶(测细胞总凋亡率)。除正常组外各组给予OGD4.5h复糖复氧,然后分别给予神经保护剂、HT、神经保护剂+HT治疗,OGD/R对照组不予任何治疗,正常对照组正常培养,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力变化率,Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞总凋亡率(早期+晚期凋亡率),筛选出与亚低温联用时对细胞活力变化率和总体凋亡率均有联合保护作用的药物。(6)验证神经保护剂与亚低温对缺血级联的主要环节的联合保护作用：将皮质神经元随机分成5组：神经保护剂组、HT组、神经保护剂+HT组、OGD/R对照组及正常对照组,每组4瓶细胞。除正常组外各组给予OGD4.5h复糖复氧,然后分别给予神经保护剂、HT、神经保护剂+HT治疗,OGD/R对照组不予任何治疗,正常对照组正常培养,JC-1染色流式细胞仪测定线粒体膜电位,DCF-DA染色多功能酶标仪测定线粒体ROS生成,FLUO-3染色流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度,DAF-FM DA染色流式细胞仪检测细胞内NO水平,及Western Blot测定Caspase3表达。统计分析采用随机数法进行分组,用均数士标准差(x±S)描述统计值。用IBM SPSS (Version20.0,USA)软件分析。析因设计先采用析因分析来分析两因素间交互作用,并绘出交互作用图,然后采用两独立样本的t检验来分析各因素的单独效应；多组间两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐的数据用LSD-t检验进行多重比较,方差不齐的数据用Games-Howell检验进行多重比较。P<0.05认为有统计学意义。研究结果(1)原代皮质神经元胞浆和突触被anti-β-Tubulin Ⅲ染色呈红色荧光,胞核被DAPI染色呈蓝色荧光,体外培养原代皮质神经元纯度为97.31±0.831%(2)随着糖氧剥夺时间的延长,原代皮质神经元TUNEL染色阳性率逐渐增高,OGD1.5h、3h、4.5h、6h分别为9.048±3.128%、25.383±5.492%、45.217±20.778%和74.524±11.199%。OGD1.5h组凋亡率与正常对照(5.117±4.157)没有差异,其他各组间均有差异(F=79.986,P=0.000)。OGD6h尽管凋亡率高达74.52±11.199%,但总细胞数也明显减少,因此选择OGD4.5h作为体外原代皮质神经元重度OGD/R模型的干预时间。(3)亚低温水平和亚低温时程之间存在交互作用,交互作用对细胞凋亡率有影响(F=4.108,P=0.009); OGD/R后细胞凋亡率较正常对照组显着增高,从2.659±1.613%增加至58.227±9.773%(t=19.433,P=0.000)；在OGD/R后给予亚低温治疗,34℃亚低温4.5h凋亡率最低(15.390±3.343%),与其他各组差异有统计学意义(34℃1.5h:38.886±9.982%,3h:25.253±5.769%,6h:42.938±9.266%;33℃1.5h:40.771±11.723%、3h:35.895±7.122%、4.5h:27.752±7.654%、6h:39.825±12.228%)(F=22.374, P=0.000)(方差不齐,采用单因素ANOVA检验Games-Howell法)。原代皮质神经元重度OGD/R模型最佳亚低温治疗水平为34℃,最佳亚低温时间为4.5h。(4)筛选出26个神经保护剂的最佳工作浓度：白蛋白：5%(F=28.805,P=0.000)；阿托伐他汀：0.1μM(F=9.996,P=0.002);氯苯氨丁酸：10μM(F=128.964, P=0.000); BDNF human:25ng/ml(F=13.812, P=0.000);布美他尼：50μM(F=7.220, P=0.006);胞磷胆碱：100mM(F=108.716, P=0.000); CsA:0.01μM(F=4.383, P=0.032);8-OH-DPAT:100μM(F=96.434, P=0.000);去铁敏：100μM (F=17.072, P=0.000);依达拉奉：100μM(F=85.527, P=0.000);格列苯脲：μM(F=34.426,P=0.000);格列齐特：10μM(F=113.337, P=0.000); GM1:1μM(F=10.804, P=0.001); HUK:0.0015PNA/ml(F=20.374, P=0.000); MgSO4:3mM(F=66.204, P=0.000);米诺环素：0.1μM(F=16.638, P=0.000); MK-801:10μM(F=8.469, P=0.003);甲强龙：10μM(F=11.968, P=0.001); Ngb:50nM(F=16.194, P=0.000);尼莫地平：10μM(F=3.281, P=0.066); NXY-059:250mM(F=5.821, P=0.013);孕酮：0.1pM(F=0.565, P=0.580);利鲁唑：100mM(F=8.506, P=0.003);丙酮酸钠：10μM(F=36.500, P=0.000); α-生育酚：1μM(F=79.606, P=0.000); VAS2870:2μM(F=19.489, P=0.000)=(5) OGD/R后神经元的细胞活力显着降低,随着细胞状态、细胞数的不同,细胞活力下降35-70%不等(t=-64.754～-16.003, P=0.000)0联用亚低温与baclofen(F=8.685, P=0.008)、BUM(F=37.521, P=0.000)、CDPC(F=14.148, P=0.001)、DPAT(F=5.576,P=0.028)、依达拉奉(F=17.712,P=0.000)、格列齐特(F=27.411, P=0.000)、GM1(F=51.121, P=0.000)、MP(F=26.277, P=0.000)、尼莫地平(F=6.404,P=0.020)、丙酮酸(F=10.279,P=0.004)对△CV%有影响。单独效应分析：5个药物：BDNF、格列苯脲、]HUK、MK-801、Ngb与亚低温联用可降低ΔCV%,较单用亚低温(BDNF:t=7.043, P=0.000; GBC:t=2.650, P=0.024; HUK:t=3.600, P=0.009; MK-801:t=5.518, P=0.000; Ngb:t=5.509, P=0.000)或单用药物更佳(BDNF:t=5.507, P=0.000; GBC:t=2.553, P=0.044; HUK:t=3.563, P=0.006; MK-801:t=8.853, P=0.000; Ngb:t=7.282, P=0.000)。(6) OGD/R后细胞总凋亡率从12.138±0.658%增加至26.430±1.706%(t=-15.633, P=0.000),5个药与亚低温均对总凋亡率有交互作用,HUK、NGB、GBC与亚低温的交互作用对总凋亡率有影响(F=47.458,15.572,9.504；P=0.000,0.002,0.002)。单独效应分析：HUK、MK-801和Ngb与亚低温联用时可降低总凋亡率至13.108±1.006%、15.508±0.938%和11.138±0.893%,比单用亚低温(24.933±1.822%)(HUK:F=11.360, P=0.000; MK-801:F=9.196, P=0.000; Ngb:F=13.595, P=0.000)或药物(HUK:26.270±2.055; MK801:18.725±1.292%; Ngb:18.175±1.181%)(HUK: F=11.504, P=0.000; MK801:F=4.031, P=0.008;Ngb:F=9.504, P=0.000)更佳。(7) OGD/R后线粒体膜电位下降的细胞比例从正常16.703±0.546%升高到31.880±1.877%(t=15.531, P=0.000)。 MK-801和Ngb与亚低温有交互作用；MK-801或Ngb与亚低温的交互作用对OGD/R后神经元的MMP有影响(F=42.474,8.188;P=0.000,0.014)。单独效应分析：联用HUK, MK-801,或Ngb和亚低温降低MMP至12.848±0.448%,13.183±0.613%和19.443±0.706%,较单用药物(HUK:18.130±0.717%, MK-801:20.973±0.423%, Ngb:32.198±1.235%)(HUK:F=12.495, P=0.000; MK-801: F=20.911, P=0.000; Ngb:F=17.933, P=0.000)或亚低温(27.165±0.737%)为佳(HUK:F=33.213,P=0.000; MK-801:F=29.176, P=0.000; Ngb:F=15.138,P=0.000)。(8) OGD/R后神经元ROS相关ODs值自正常19.639±2.688升高达201.596±3.939(t=-93.452, P=0.000); MK-801和Ngb与亚低温均对ROS有交互作用；联用HUK、MK-801或Ngb与亚低温对ROS生成皆有影响(F=858.166,285.321,973.659; P=0.000)。单独效应分析：联用HUK. MK-801、Ngb和亚低温显着减少ROS依赖性ODs至29.542±2.604,31.712±3.328和33.270±4.458,优于单用药物(HUK:56.63±7.815, MK-801:89.363±11.731, Ngb:69.022±4.667)(F=8.055,11.581,13.569; P=0.000)或亚低温(48.377±5.279)(F=7.839,6.542,5.356; p=0.000)。(9)正常原代皮质神经元细胞内[Ca2+]i依赖性Fluo-3/AM平均荧光强度为1693.000±23.678, OGD/R后增高达3104.250±90.112(t=-30.294, P=0.000); HUK或Ngb与亚低温有交互作用。联合HUK或Ngb与亚低温对[Ca]i浓度依赖性平均荧光强度有影响(F=18.743,45.911；P=0.001,0.000)。单独效应分析：联用HU、MK-801、Ngb和亚低温显着减少Geo Mean到1817.500±51.157,1794.250±26.837和2212.750±23.908,优于单用药物(HUK:2339.250±47.822,MK-801:2561.000±34.186和Ngb:2576.250±73.781)(F=14.901,35.284,9.374; P=0.000)或亚低温(2330.500±22.986)(F=18.294,30.352,7.101; p=0.000)。(10)正常细胞内NO平均荧光强度(Geo Mean)为1146.500±73.831, OGD/R显着增加细胞内NO的生成达1374.250±110.328(t=-3.431,P=0.017)。叁种药物与亚低温对NO相关平均荧光强度均有交互作用；联用叁种药物与亚低温均对NO相关平均荧光强度无影响(HUK:F=0.310, P=0.588; MK-801: F=1.555, P=0.593; Ngb:F=0.302, P=0.236). Ngb (1253.250±100.590)或者Ngb与亚低温联用(1180.500±76.116)均可降低NO生成,联用较单用亚低温(1352.750±82.140)效果为佳(t=3.076,P=0.022),但并不优于单用Ngb(t=1.153, P=0.296)。其余治疗对NO均无影响(P>0.05)。(11)叁种药物与亚低温联用可增加OGD/R后原代皮质神经元Caspase3的表达,较单用亚低温或单用药物更佳。结论联合应用HUK、Ngb、MK-801与亚低温对体外培养OGD/R后的皮质神经元细胞活力及凋亡率有保护作用,并且抑制线粒体凋亡途径的多个环节：减少ROS生成、细胞内钙超载、线粒体膜电位下降以及Caspase-3的激活。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-05-01）
叶启发,袁金忠,明英姿,熊力,牛英[3]（2007）在《亚低温离体大鼠肝细胞悬浮培养后的功能》一文中研究指出目的观察亚低温条件下离体大鼠肝细胞悬浮培养后的完整性和功能。方法离体肝细胞悬浮于添加有葡萄糖和牛血清白蛋白(BSA)的碳酸氢盐缓冲介质内30℃下孵育48 h,期间及其后测定细胞的完整性和功能指标。结果30℃条件下离体0、24及48 h内白蛋白合成及Ⅰ相药物生物转化能力差异无统计学意义(P>0.05),流式细胞仪活细胞计数和台盼蓝清除率显示细胞完整性差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝细胞混悬液内的离体肝细胞在亚低温条件下能够保持较高活力,为制备应用于生物人工肝的离体肝细胞混悬液提供了可行性。(本文来源于《中华实验外科杂志》期刊2007年09期）
张世昌[4]（2005）在《乳猪肝细胞亚低温培养的初步研究》一文中研究指出肝细胞是生物人工肝的核心原材料,生物人工肝对肝功能衰竭患者的治疗作用完全依赖于所用肝细胞的生物学功能。目前生物人工肝研究的主要细胞材料是人肝细胞、肝肿瘤细胞株和猪肝细胞,但由于人肝细胞米源匮乏以及肿瘤细胞株潜在的不安全性,猪肝细胞已经逐步成为生物人工肝研究(本文来源于《第叁届国际暨全国肝衰竭与人工肝学术会议论文集》期刊2005-03-01）
赵庆杰,潘欣蓉,苏志强,王德生[5]（2004）在《亚低温对体外培养皮质神经细胞兴奋损伤后的保护作用》一文中研究指出目的探讨亚低温对不同浓度谷氨酸(Glu)损伤体外培养皮质神经元的保护作用。方法在建立体外培养皮质神经元的兴奋型损伤模型基础上,应用倒置相差显微镜下细胞计数和生化检测LDH(本文来源于《中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编》期刊2004-04-01）
潘欣蓉,赵庆杰,苏志强,王德生[6]（2004）在《亚低温对兴奋性损伤后的体外培养皮质神经元突触生长素表达的影响》一文中研究指出目的研究不同浓度兴奋性氨基酸对体外培养神经元突触生长素的表达及亚低温对其干预的影响。方法建立体外培养皮质神经元的兴奋性损伤模型,观察亚低温在不同浓度谷氨酸作用下,对体外皮质神经元损伤后突触生长素的表达及保护作用。结果不同浓度谷氨酸组(50μmol/L、100μmol/(本文来源于《中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编》期刊2004-04-01）
傅泉,江博雄,裘明德[7]（2001）在《亚低温对培养神经细胞缺氧状态下保护作用的研究》一文中研究指出目的:亚低温对体外培养神经细胞缺氧下的保护机制。方法:培养大鼠脑皮质神经元,分低温组(３４℃)及常温组(３７℃),缺氧相应时段观测细胞形态、细胞存活率、细胞活力,缺氧后４ｈ的细胞电镜观察线粒体。结果:亚低温组各项指标均优于常温组(Ｐ＜０．０５)。结论:亚低温延迟缺氧级联反应的过程,机制与降低细胞代谢水平及对线粒体的保护有关。(本文来源于《中国临床神经科学》期刊2001年04期）
亚低温培养论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景中国脑血管病年均发病率为193-779/10万,死亡率81-441/10万不等,已经成为中国第一位的死因和致残原因。缺血性脑血管病——脑梗死占脑血管病的大多数,其中大面积脑梗死的死亡率可高达80%,且绝大部分导致严重残疾。脑血管病的高发病率、高致死率、高致残率,给社会和家庭带来沉重的负担。如何降低大面积脑梗死的致残率和致死率是目前研究的热点和难点。脑缺血后神经细胞的损害是一系列缺血级联效应的后果,包括线粒体功能紊乱、细胞内钙超载、高钠和低K+、ROS和NO生成增加、兴奋性氨基酸毒性、炎性因子及粘附分子释放增加、微血管阻塞、血脑屏障破坏、Caspase蛋白家族的级联激活等。在梗死后几分钟到几天,不同的病理过程在时间上互相重迭并起到推波助澜的作用。脑梗死病变区按缺血的程度可分为缺血核心区和缺血半暗带区。核心区内细胞因完全缺血、过度激活的兴奋性神经递质／受体的毒性等致使细胞在几分钟内死亡。缺血半暗带区的细胞因缺血后周边侧枝循环的再灌注,还有存活的可能。由于再灌注时间窗只有4.5h,许多患者就诊时核心区的细胞已不可逆死亡,因此靶向干预缺血半暗带区是目前实验研究和临床治疗的主要目标。在脑保护治疗中,治疗性低温是目前被临床证明有效的脑保护措施之一。亚低温通常指28～35℃,而临床广泛应用的是33-314℃。亚低温在颅脑外伤、心肺复苏后缺血缺氧性脑病和新生儿窒息的治疗中都取得了卓着的成绩。但是,亚低温在脑梗死治疗方面的应用近年才刚刚起步,实验室及临床的证据尚不充足。我们前期的研究表明,亚低温可以缩小MCAO大鼠的梗死灶面积,但是神经功能评分并没有随之改善,因此需要进一步采取措施提高疗效。此外,亚低温治疗也有许多副作用,如寒战,过度镇静抑制呼吸功能,以及长时间亚低温使肺部感染、下肢深静脉血栓等并发症发生率增加等等。因此,有必要联合应用有协同作用的药物,以进一步改善亚低温治疗的效果,改善脑梗死的预后。目前有报道在体外或体内实验中具有神经保护作用的药物很多,从其作用机制来看,包括谷氨酸受体阻滞剂、Y-氨基丁酸受体激动剂、钙离子拮抗剂、自由基清除剂、抗生素和免疫抑制剂、生长因子类、5-羟色胺受体激动剂、膜成分及其稳定剂、脑代谢剂、神经肽类、抗糖尿病药物、激素类、中成药及各种新药等。但是,这些药物在临床转化方面均遇到了障碍。究其原因,除了动物实验设计缺陷、种族差异、药物疗效不够显着、临床应用时机大多晚于实验研究、副作用过大等之外,还因为脑梗死后的损害涉及到多个相互关联、互相重迭的病理机制,而一种药物仅仅作用于缺血级联的一个或某几个环节,作用靶点过于单一,不能对缺血级联产生有效应的结果。基于脑梗死病理机制的复杂性和多样性,联用多种有协同作用的药物或治疗方法有可能取得突破性的效果,如联合非药物性神经保护手段——治疗性低温。在亚低温与神经保护剂联合应用方面国内外均有所涉猎。国内外和我们前期的研究都证实,某些药物如硫酸镁、脑源性神经生长因子等,在与亚低温联用治疗实验动物脑梗死时表现出协同效应。但是,目前国内外尚未有研究对现有的神经保护剂与亚低温联用的疗效进行过系统的筛选。我们根据神经保护剂的作用机制、可获得性、毒性、易用性等特点选取了26种神经保护剂纳入研究。与动物模型和人体实验相比,体外糖氧剥夺／复糖复氧(OGD/R)模型可在体外模拟不同程度的缺血／再灌注状态,实验条件更一致,并能进行高通量的单药或复合药物筛选,耗时耗资少,具有动物模型及人体实验不可比拟的优越性；而神经元细胞是脑组织中的主要细胞,其预后决定了脑组织的总体预后,因此我们首先建立了原代皮质神经元的重度OGD/R模型,然后利用这一模型对26个神经保护剂与亚低温的联合作用进行了筛选。我们选取了细胞活力和凋亡率作为药物筛选的两个主要指标,前者反映活细胞数目的多少,后者反映细胞受损伤的程度。此外,脑梗死后的缺血级联过程中与神经元细胞有关的几个主要环节包括：细胞内钙超载、线粒体膜电位下降、ROS生成、NO生成、Caspase-3的激活,因此我们进一步验证了筛选出的药物与亚低温联合治疗对这些环节的保护作用。研究目的：(1)利用体外培养原代皮质神经元重度OGD/R细胞模型筛选与亚低温具有协同作用的神经保护剂；(2)在原代皮质神经元的体外重度OGD/R模型中,进一步验证联合应用神经保护剂和亚低温对缺血再灌注级联反应的各个环节的保护作用。研究方法：(1)体外培养原代皮质神经元,免疫组化神经元特异标记物β-Tubulin Ⅲ染色鉴定神经元细胞纯度。(2)建立原代皮质神经元体外重度OGD/R模型,体外模拟重度脑缺血／再灌注状态。体外培养原代皮质神经元随机分成5组：OGD1.5h、OGD3h、 OGD4.51h、OGD6h及正常对照组,每组4瓶细胞。OGD各组分别给予OGD1.5h、OGD3h、OGD4.5h. OGD6h后复糖复氧,正常对照组不予处理,48小时后采用Tunnel法测定细胞凋亡率,根据凋亡率选择适当的糖氧剥夺时间作为模型干预时间。(3)确立原代皮质神经元体外重度OGD/R后的最佳亚低温(HT)治疗方案。体外培养原代皮质神经元随机分成10组：HT33℃1.5h.HT33℃3h. HT33℃4.5h.HT33℃6h.HT34℃1.5h.HT34℃3h.HT34℃4.5h. HT34℃6h、OGD/R对照组及正常对照组,每组4瓶细胞。除正常组外所有组给予OGD4.5h后复糖复氧,然后各治疗组采用不同的亚低温水平和时间进行干预：33℃1.5h、33℃3h、33℃4.5h、33℃6h、34℃1.5h、34℃3h.34℃4.5h、34℃6h,OGD/R对照组不予处理,48小时后采用Tunnel法测定细胞凋亡率,以细胞凋亡率最低的亚低温水平和时间作为最佳亚低温治疗方案。(4)筛选神经保护剂的最佳工作浓度：将原代皮质神经元细胞随机分为3-5组,每组6个复孔,给予OGD/R后采用不同剂量的神经保护剂进行治疗,CCK-8试剂盒检测细胞活力,采用细胞活力改变率(ΔCV%)衡量神经保护剂对神经元的保护作用,选取细胞活力改变率最低的药物浓度作为下一步实验时的工作浓度。(5)筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂：将原代皮质神经元细胞随机分为5组,神经保护剂组、HT组、神经保护剂+HT组、OGD/R对照组及正常对照组,每组6个复孔(测细胞活力)或4个瓶(测细胞总凋亡率)。除正常组外各组给予OGD4.5h复糖复氧,然后分别给予神经保护剂、HT、神经保护剂+HT治疗,OGD/R对照组不予任何治疗,正常对照组正常培养,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力变化率,Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞总凋亡率(早期+晚期凋亡率),筛选出与亚低温联用时对细胞活力变化率和总体凋亡率均有联合保护作用的药物。(6)验证神经保护剂与亚低温对缺血级联的主要环节的联合保护作用：将皮质神经元随机分成5组：神经保护剂组、HT组、神经保护剂+HT组、OGD/R对照组及正常对照组,每组4瓶细胞。除正常组外各组给予OGD4.5h复糖复氧,然后分别给予神经保护剂、HT、神经保护剂+HT治疗,OGD/R对照组不予任何治疗,正常对照组正常培养,JC-1染色流式细胞仪测定线粒体膜电位,DCF-DA染色多功能酶标仪测定线粒体ROS生成,FLUO-3染色流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度,DAF-FM DA染色流式细胞仪检测细胞内NO水平,及Western Blot测定Caspase3表达。统计分析采用随机数法进行分组,用均数士标准差(x±S)描述统计值。用IBM SPSS (Version20.0,USA)软件分析。析因设计先采用析因分析来分析两因素间交互作用,并绘出交互作用图,然后采用两独立样本的t检验来分析各因素的单独效应；多组间两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐的数据用LSD-t检验进行多重比较,方差不齐的数据用Games-Howell检验进行多重比较。P<0.05认为有统计学意义。研究结果(1)原代皮质神经元胞浆和突触被anti-β-Tubulin Ⅲ染色呈红色荧光,胞核被DAPI染色呈蓝色荧光,体外培养原代皮质神经元纯度为97.31±0.831%(2)随着糖氧剥夺时间的延长,原代皮质神经元TUNEL染色阳性率逐渐增高,OGD1.5h、3h、4.5h、6h分别为9.048±3.128%、25.383±5.492%、45.217±20.778%和74.524±11.199%。OGD1.5h组凋亡率与正常对照(5.117±4.157)没有差异,其他各组间均有差异(F=79.986,P=0.000)。OGD6h尽管凋亡率高达74.52±11.199%,但总细胞数也明显减少,因此选择OGD4.5h作为体外原代皮质神经元重度OGD/R模型的干预时间。(3)亚低温水平和亚低温时程之间存在交互作用,交互作用对细胞凋亡率有影响(F=4.108,P=0.009); OGD/R后细胞凋亡率较正常对照组显着增高,从2.659±1.613%增加至58.227±9.773%(t=19.433,P=0.000)；在OGD/R后给予亚低温治疗,34℃亚低温4.5h凋亡率最低(15.390±3.343%),与其他各组差异有统计学意义(34℃1.5h:38.886±9.982%,3h:25.253±5.769%,6h:42.938±9.266%;33℃1.5h:40.771±11.723%、3h:35.895±7.122%、4.5h:27.752±7.654%、6h:39.825±12.228%)(F=22.374, P=0.000)(方差不齐,采用单因素ANOVA检验Games-Howell法)。原代皮质神经元重度OGD/R模型最佳亚低温治疗水平为34℃,最佳亚低温时间为4.5h。(4)筛选出26个神经保护剂的最佳工作浓度：白蛋白：5%(F=28.805,P=0.000)；阿托伐他汀：0.1μM(F=9.996,P=0.002);氯苯氨丁酸：10μM(F=128.964, P=0.000); BDNF human:25ng/ml(F=13.812, P=0.000);布美他尼：50μM(F=7.220, P=0.006);胞磷胆碱：100mM(F=108.716, P=0.000); CsA:0.01μM(F=4.383, P=0.032);8-OH-DPAT:100μM(F=96.434, P=0.000);去铁敏：100μM (F=17.072, P=0.000);依达拉奉：100μM(F=85.527, P=0.000);格列苯脲：μM(F=34.426,P=0.000);格列齐特：10μM(F=113.337, P=0.000); GM1:1μM(F=10.804, P=0.001); HUK:0.0015PNA/ml(F=20.374, P=0.000); MgSO4:3mM(F=66.204, P=0.000);米诺环素：0.1μM(F=16.638, P=0.000); MK-801:10μM(F=8.469, P=0.003);甲强龙：10μM(F=11.968, P=0.001); Ngb:50nM(F=16.194, P=0.000);尼莫地平：10μM(F=3.281, P=0.066); NXY-059:250mM(F=5.821, P=0.013);孕酮：0.1pM(F=0.565, P=0.580);利鲁唑：100mM(F=8.506, P=0.003);丙酮酸钠：10μM(F=36.500, P=0.000); α-生育酚：1μM(F=79.606, P=0.000); VAS2870:2μM(F=19.489, P=0.000)=(5) OGD/R后神经元的细胞活力显着降低,随着细胞状态、细胞数的不同,细胞活力下降35-70%不等(t=-64.754～-16.003, P=0.000)0联用亚低温与baclofen(F=8.685, P=0.008)、BUM(F=37.521, P=0.000)、CDPC(F=14.148, P=0.001)、DPAT(F=5.576,P=0.028)、依达拉奉(F=17.712,P=0.000)、格列齐特(F=27.411, P=0.000)、GM1(F=51.121, P=0.000)、MP(F=26.277, P=0.000)、尼莫地平(F=6.404,P=0.020)、丙酮酸(F=10.279,P=0.004)对△CV%有影响。单独效应分析：5个药物：BDNF、格列苯脲、]HUK、MK-801、Ngb与亚低温联用可降低ΔCV%,较单用亚低温(BDNF:t=7.043, P=0.000; GBC:t=2.650, P=0.024; HUK:t=3.600, P=0.009; MK-801:t=5.518, P=0.000; Ngb:t=5.509, P=0.000)或单用药物更佳(BDNF:t=5.507, P=0.000; GBC:t=2.553, P=0.044; HUK:t=3.563, P=0.006; MK-801:t=8.853, P=0.000; Ngb:t=7.282, P=0.000)。(6) OGD/R后细胞总凋亡率从12.138±0.658%增加至26.430±1.706%(t=-15.633, P=0.000),5个药与亚低温均对总凋亡率有交互作用,HUK、NGB、GBC与亚低温的交互作用对总凋亡率有影响(F=47.458,15.572,9.504；P=0.000,0.002,0.002)。单独效应分析：HUK、MK-801和Ngb与亚低温联用时可降低总凋亡率至13.108±1.006%、15.508±0.938%和11.138±0.893%,比单用亚低温(24.933±1.822%)(HUK:F=11.360, P=0.000; MK-801:F=9.196, P=0.000; Ngb:F=13.595, P=0.000)或药物(HUK:26.270±2.055; MK801:18.725±1.292%; Ngb:18.175±1.181%)(HUK: F=11.504, P=0.000; MK801:F=4.031, P=0.008;Ngb:F=9.504, P=0.000)更佳。(7) OGD/R后线粒体膜电位下降的细胞比例从正常16.703±0.546%升高到31.880±1.877%(t=15.531, P=0.000)。 MK-801和Ngb与亚低温有交互作用；MK-801或Ngb与亚低温的交互作用对OGD/R后神经元的MMP有影响(F=42.474,8.188;P=0.000,0.014)。单独效应分析：联用HUK, MK-801,或Ngb和亚低温降低MMP至12.848±0.448%,13.183±0.613%和19.443±0.706%,较单用药物(HUK:18.130±0.717%, MK-801:20.973±0.423%, Ngb:32.198±1.235%)(HUK:F=12.495, P=0.000; MK-801: F=20.911, P=0.000; Ngb:F=17.933, P=0.000)或亚低温(27.165±0.737%)为佳(HUK:F=33.213,P=0.000; MK-801:F=29.176, P=0.000; Ngb:F=15.138,P=0.000)。(8) OGD/R后神经元ROS相关ODs值自正常19.639±2.688升高达201.596±3.939(t=-93.452, P=0.000); MK-801和Ngb与亚低温均对ROS有交互作用；联用HUK、MK-801或Ngb与亚低温对ROS生成皆有影响(F=858.166,285.321,973.659; P=0.000)。单独效应分析：联用HUK. MK-801、Ngb和亚低温显着减少ROS依赖性ODs至29.542±2.604,31.712±3.328和33.270±4.458,优于单用药物(HUK:56.63±7.815, MK-801:89.363±11.731, Ngb:69.022±4.667)(F=8.055,11.581,13.569; P=0.000)或亚低温(48.377±5.279)(F=7.839,6.542,5.356; p=0.000)。(9)正常原代皮质神经元细胞内[Ca2+]i依赖性Fluo-3/AM平均荧光强度为1693.000±23.678, OGD/R后增高达3104.250±90.112(t=-30.294, P=0.000); HUK或Ngb与亚低温有交互作用。联合HUK或Ngb与亚低温对[Ca]i浓度依赖性平均荧光强度有影响(F=18.743,45.911；P=0.001,0.000)。单独效应分析：联用HU、MK-801、Ngb和亚低温显着减少Geo Mean到1817.500±51.157,1794.250±26.837和2212.750±23.908,优于单用药物(HUK:2339.250±47.822,MK-801:2561.000±34.186和Ngb:2576.250±73.781)(F=14.901,35.284,9.374; P=0.000)或亚低温(2330.500±22.986)(F=18.294,30.352,7.101; p=0.000)。(10)正常细胞内NO平均荧光强度(Geo Mean)为1146.500±73.831, OGD/R显着增加细胞内NO的生成达1374.250±110.328(t=-3.431,P=0.017)。叁种药物与亚低温对NO相关平均荧光强度均有交互作用；联用叁种药物与亚低温均对NO相关平均荧光强度无影响(HUK:F=0.310, P=0.588; MK-801: F=1.555, P=0.593; Ngb:F=0.302, P=0.236). Ngb (1253.250±100.590)或者Ngb与亚低温联用(1180.500±76.116)均可降低NO生成,联用较单用亚低温(1352.750±82.140)效果为佳(t=3.076,P=0.022),但并不优于单用Ngb(t=1.153, P=0.296)。其余治疗对NO均无影响(P>0.05)。(11)叁种药物与亚低温联用可增加OGD/R后原代皮质神经元Caspase3的表达,较单用亚低温或单用药物更佳。结论联合应用HUK、Ngb、MK-801与亚低温对体外培养OGD/R后的皮质神经元细胞活力及凋亡率有保护作用,并且抑制线粒体凋亡途径的多个环节：减少ROS生成、细胞内钙超载、线粒体膜电位下降以及Caspase-3的激活。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
亚低温培养论文参考文献
[1].高筱雅,潘速跃,黄建欧,胡亚芳,顾勇.体外培养原代皮质神经元糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂[C].中华医学会第十七次全国神经病学学术会议论文汇编（下）.2014
[2].高筱雅.体外培养原代皮质神经元重度糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究[D].南方医科大学.2014
[3].叶启发,袁金忠,明英姿,熊力,牛英.亚低温离体大鼠肝细胞悬浮培养后的功能[J].中华实验外科杂志.2007
[4].张世昌.乳猪肝细胞亚低温培养的初步研究[C].第叁届国际暨全国肝衰竭与人工肝学术会议论文集.2005
[5].赵庆杰,潘欣蓉,苏志强,王德生.亚低温对体外培养皮质神经细胞兴奋损伤后的保护作用[C].中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编.2004
[6].潘欣蓉,赵庆杰,苏志强,王德生.亚低温对兴奋性损伤后的体外培养皮质神经元突触生长素表达的影响[C].中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编.2004
[7].傅泉,江博雄,裘明德.亚低温对培养神经细胞缺氧状态下保护作用的研究[J].中国临床神经科学.2001