导读:本文包含了胞质内注射论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:转基因,水牛,细胞,体细胞,受精卵,胚胎,精子。
胞质内注射论文文献综述
麦然标,纪红美,贺晓燕,石俊松,王青来[1]（2016）在《全细胞胞质内注射法制作猪克隆胚胎的研究》一文中研究指出引言/目的自2000年首次成功生产出体细胞克隆猪以来,猪体细胞克隆技术的研究与应用已有16年,但目前猪的克隆效率只有1%-2%,远低于体内受精胚的65%左右。制约猪克隆效率的因素有很多,很多相关性的研究都没有显着提高猪的克隆效率。在目前猪克隆效率低下的前提下只能通过优化技术操作来满足克隆猪产业化的需求。本研究利用Piezo辅助直接将供体细胞注入卵母细胞内,并且比较了这种方法与电融合法对猪体细胞核移植效率的(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十八届学术研讨会暨中日韩第四届动物繁殖学术交流会论文集》期刊2016-08-18）
刘帅[2]（2015）在《猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究》一文中研究指出卵胞质注射转基因(CI-MGT)具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点,结合体内受精胚胎和高效基因编辑技术,最近被广泛应用于转基因动物生产中。单精子胞质内注射转基因(ICSI-MGT)适于大片段外源基因转移,并能有效解决猪体外受精胚胎多精子受精等问题,特别适用于转基因猪的生产。广西地处高温高湿的亚热带地区,为优化此种环境下猪胚胎和转基因技术体系,本研究在优化猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎培养条件的基础上,系统探讨了体外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相关影响因素,并对CI-MGT体外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生产转基因猪可行性进行了研究。研究结果如下：1.探讨了成熟液和胚胎培养液组分对猪卵母细胞成熟及胚胎发育效果的影响。结果显示,成熟基础液为TCM-199核成熟率和胚胎发育效率显着高于NCSU-37和PZM-3(P<0.05)。以TCM-199为成熟基础液,不加额外能量底物(PMt)的核成熟率和孤雌囊胚发育率分别为74.1土2.4%和29.3+1.3%,显着高于添加0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖(PMtsg)或0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺(PMtsgg, P<0.05)。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG组的核成熟率和胚胎发育效率显着高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I组囊胚率显着高于添加10 ng/mL EGF和不添加组(P<0.05)。对猪卵母细胞体外成熟过程中核相变化研究显示,成熟培养38 h的核成熟率为57%(105/184),40 h为43%(82/189),42 h为48%(75/155),44 h为59%(208/354),46 h为70%(59/84),48 h为62%(51/82),50 h为74%(154/207)。在以PZM-3为基础液的胚胎培养液中添加0.277 mmol/L肌醇(PZMi),其囊胚率显着高于添加0.34 mmol/L柠檬酸钠(PZMc)或0.34 mmol/L柠檬酸钠+0.277 mmol/L肌醇(PZMci, P<0.05);添加0.5 mg/mL透明质酸组的囊胚率显着高于未添加组(P<0.05)；添加3 mg/mL BSA-FAF组的囊胚率显着高于添加BSA-V组(41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P<0.05)。培养液中BSA浓度增加至5 mg/mL或在培养96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差异不显着。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚细胞数高于未添加组,但差异不显着。2.探讨了激活方法对猪卵母细胞孤雌胚胎发育效果的影响。结果显示,卵母细胞经5 μmol/L离子霉素(Ion)激活5 min后,再分别在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP),5μg/mL细胞松弛素B (CB)+10放线菌酮(CHX),5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培养4 h的囊胚率显着高于在10μg/mL CHX培养4 h的囊胚率(29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P<0.05),但四组间囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着差异。当电脉电压为1.25KV/cm时3次电脉冲电激活的囊胚发育率显着高于2次电脉冲(P<0.05),当电脉冲为3次时电场强度为0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率显着低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm组的囊胚率显着高于0.80和1.20 KV/cm组(P<0.05)。卵母细胞电激活后分别用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培养处理4 h的囊胚率(55.4±1.2%和50.4±2.9%)显着高于用2 mmol/L 6-DMAP (37.9±2.4%),5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP (36.9±3.1%)培养处理4 h的囊胚发育率,亦显着高于单纯电激活处理(40.7±1.7%)和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP (30.6±0.8%)培养处理4 h的囊胚发育率(P<0.05。电激活后,用5μg/mLCB培养处理4 h的囊胚率显着高于用5μg/mLCB培养处理4 h(54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P<0.05),与7.5μg/mLCB组差异不显着,但7.5μg/mLCB组的ICM细胞数和ICM/TE均显着高于5 μg/mLCB组(P<0.05)。对胚胎核型进行分析结果表明,电激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培养处理4 h的囊胚细胞二倍体率显着高于单纯电激活处理组(84.6% vs 40.0%,P<0.05)。3.研究了猪卵胞质内注射转基因的影响因素。孤雌激活卵胞质注射(PA-CI)的研究结果显示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制剂对孤雌激活卵的囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着影响,表明可同时注射外源RNA和RNA酶抑制剂。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚阳性率显着高于50 ng/μL和空注组,但囊胚率显着低于其余两组(33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P<0.05)；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率与50 ng/μL注射组和空注组差异不显着,表明注射DNA对胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均显着低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率(P<0.05)。注射EGFP-N1线性化DNA的囊胚阳性率显着高于环状DNA(15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P<0.05),但两者胚胎发育率差异不显着,并且外源RNA注射组的囊胚率普遍高于注射DNA载体。当采用体外受精卵进行胞质内注射时(IVF-CI),精卵孵育后5-18 h注射线性化EGFP-N1载体的囊胚率和囊胚细胞数差异均不显着,但5-6、8-9和11-12 h注射组胚胎阳性率显着高于14-15和17-18 h(12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P<0.05),表明外源DNA在猪雌雄原核形成期(约13 h)前注射的外源基因整合效率较高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA组囊胚率显着高于100 ng/μL,与10、20、30ng/μL和空注组差异不显着,同时40、50和100 ng/pL组阳性率显着高于其余各组(P<0.05)。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率显着低于PA卵(13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P<0.05),但注射IVF卵的胚胎基因突变效率显着高于注射PA卵(25.0% vs3.8%,P<0.05),表明Cas9/sgRNA系统可以通过注射猪IVF卵对猪的基因组进行编辑。4.系统研究了猪单精子胞质内注射转基因的影响因素。结果显示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA与精子共孵育的囊胚率显着高于50和100 ng/μL(33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P<0.05),但20ng/μL孵育组胚胎阳性率显着高于10ng/μL(30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P<0.05)。精子与外源基因孵育5、30和60 min囊胚率显着高于孵育24 h,但30和60 min组阳性率和囊胚阳性率显着高于5 min(P<0.05)。采用不同冷冻液(DPBS、 BTS和mNIM)冷冻精子对ICSI-MGT胚胎发育率无显着影响,但精子孵育液DPBS+EDTA (10 mmol/L EDTA)的囊胚率显着高于DPBS(27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P<0.05), mNIM (10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl)组的囊胚率显着高于DPBS+EDTA组(33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P<0.05),表明孵育液中的EDTA和K+对注射后的胚胎发育有影响。精子超声+冻融处理和NaOH处理的囊胚率显着高于鲜精、A23187、超声、冻融和叁次冻融处理组,超声+冻融和NaOH处理组的胚胎外源基因阳性率亦显着高于鲜精和A23187处理组。此外,卵母细胞激活后注射超声+冻融和NaOH处理精子的囊胚率显着高于激活前注射组(35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P<0.05),表明精子破膜与激活影响ICSI-MGT胚胎的发育。卵母细胞激活后0-30 min注射的囊胚率显着低于60-90 min注射组,但阳性率和囊胚阳性率均显着高于60-90 min注射组。对ICSI后不同时间合子内的GSH含量分析显示,激活后0-30 min注射组的6 h合子GSH含量显着低于60-90 min注射组和孤雌激活组(3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P<0.05),而60-90 min注射组的6 h和12 h合子GSH含量与孤雌组均无显着差异。进一步原核分析发现,0-30 min注射组的雌雄双原核形成率显着高于60-90 min(56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P<0.05),且0-30min注射组精子解聚率显着高于60-90min,表明延长激活以后的注射时间会造成更高的孤雌胚胎产生。采用不同外源基因载体(EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP)的ICSI-MGT囊胚率差异不显着,但显着影响胚胎阳性率,其中EGFP-N1线性化载体阳性率显着高于环状载体(35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P<0.05),而Anti-FMDV RNAi载体阳性率和囊胚阳性率均显着低于其它载体(P<0.05)。将Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6头自然发情受体内,4头未见返情,其中7557号受体流产获得3头胎猪,7645号受体妊娠到期得到4头仔猪,对仔猪耳朵皮肤EGFP和Neo双基因进行PCR鉴定均显示阳性,表明应用优化的ICSI-MGT技术可以获得转基因猪后代。(本文来源于《广西大学》期刊2015-06-01）
张顺[3]（2012）在《单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究》一文中研究指出单精子胞质内注射转基因(Intracytoplasmic Sperm Injection Mediated Gene Transfer, ICSI-MGT)是精子载体转基因中应用最广泛的一种方法,它具有不需要考虑精子的活力、能转移大片段的外源基因和相对于体外受精介导有较高的转基因效率等优点,因此被广泛应用于转基因动物制作研究。本研究以线虫体内克隆获得的n-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因(Fat-1)为目的基因,系统研究了兔ICSI-MGT转基因效率的相关影响因素和精子/DNA结合的分子机制,并对应用ICSI-MGT生产转Fat-1基因兔的可行性进行了探讨。1、研究了兔精子处理方法对ICSI-MGT转基因效率的影响。结果发现,无抗冻剂液氮长期冻存对精子DNA的损伤程度与一次液氮冻融组相比无显着差异(P>0.05),其受精后的合子双原核形成率(71.4% vs 67.5%和77.2%)、卵裂率(76.7% vs 79.5%和80.4%)及囊胚率(39.7% vs 42.0%和40.2%)与一次液氮冻融组及新鲜精子组相比均无显着差异(P>0.05),但其ICSI-MGT后的阳性胚胎率及囊胚阳性率显着高于新鲜精子组(43.8% vs18.6%；56.1% vs 12.8%,P<0.05),而与一次液氮冻融精子组无显着差异(43.8% vs 40.2%；56.1% vs 46.8%,P>0.05)。比较不同来源精子的ICSI-MGT转基因效率时发现,来自附睾的精子与采集的精子相比,其与外源DNA结合的效率差异极为显着(DNaseI消化前：77.5% vs 17.0%；DNaseI消化后：47.6% vs 5.2%,P<0.01),ICSI-MGT后能获得较高的阳性胚胎率和囊胚阳性率(32.4% vs 10.8%；40.2% vs 9.2%,P<0.05)；对二者精液的差异成份——精浆进行分析,发现外源质粒孵育精浆后出现降解现象且降解程度随着其含量的升高而逐步升高,当精子/DNA孵育体系中添加EDTA后能显着抑制孵育外源质粒的降解,同时,EDTA处理后的采集精子用于ICSI-MGT生产转基因胚胎,与未添加EDTA对照组相比能显着提高阳性胚胎率及囊胚阳性率(24.5% vs 10.8%；36.0% vs 9.2%；P<0.05)。上述结果表明：(1)无抗冻剂液氮长期冻存精子可以用于ICSI-MGT操作生产转基因胚胎,为兔精子介导转基因提供了一种方便可靠的精子保存方法；(2)精浆成份存在高活性的脱氧核糖核酸酶能降解外源DNA从而降低ICSI-MGT的转基因效率,添加EDTA能抑制外源DNA的降解进而提高ICSI-MGT的转基因效率。2、探讨了ICSI兔卵母细胞激活与培养对胚胎发育的影响。激活方法对比研究的结果显示,ICSI卵母细胞经5μM Ion激活5 min后,再用2 mM·6-DMAP或2mM 6-DMAP+5μg/mL CHX培养1.5 h,其分裂率高于用5μg/mL CHX培养1.5 h的卵母细胞和未激活对照的卵母细胞,卵母细胞激活后用2 mM 6-DMAP+5μg/mL CHX培养1.5 h的囊胚率(41.3%)和一级胚胎率(65.4%)显着高于其它各组的卵母细胞(P<0.05)；胚胎分级后进行常规体外培养,一级胚胎的囊胚率和囊胚细胞数与体内胚胎差异不显着(P>0.05),显着高于二级、叁级胚胎(P<0.05)。当在培养液中添加不同浓度的细胞凋亡抑制剂1-磷酸-鞘氨醇(S1P)时,添加50 nM或100 nM的S1P能提高囊胚形成率和囊胚质量(P<0.05),100nMS1P组的整二倍体(2n=44)囊胚比例显着高于不添加的对照组(94.7% vs 78.6%,P<0.05)；检测二级碎裂胚胎细胞微丝蛋白分布发现：胚胎经100 nM SIP处理的各阶段细胞微丝蛋白在细胞间隙及内细胞团处呈现集中分布,但未处理培养组的碎裂二级胚胎各阶段细胞微丝蛋白松散、无规则排列,内细胞团处无明显聚集。上述结果表明:(1) ICSI兔卵母细胞的适宜激活处理方法是Ion激活5 min,再用6-DMAP和CHX培养1.5 h；(2)细胞凋亡抑制剂S1P能提高ICSI胚胎的体外培养质量、降低胚胎碎裂程度、维持胚胎细胞染色体的正常倍性并对细胞骨架微丝蛋白的正常分布有调节作用。3、探讨了ICSI-MGT转基因兔胚胎生产的相关影响因素(质粒浓度和构型),并建立了转Fat-1基因的家兔模型。结果发现,随着pPGK1/Fat-1-CMV/EGF质粒浓度的升高,兔精子结合质粒的效率在DNaseI消化前后均呈上升趋势,且ICSI-MGT的阳性胚胎率也随着质粒浓度的升高而提高,但当浓度达到500 ng/μL时,胚胎的分裂率和囊胚率与其他各组相比均显着降低,而30 ng/μL组的囊胚率显着高于50 ng/μL组(49.0% vs 33.3%,P<0.05),且其阳性胚胎率、囊胚阳性率显着高于10 ng/μL和15 ng/μL组(56.3% vs 45.6%和21.2%；55.3% vs 39.0%和33.3%,P<0.05)。对与不同浓度质粒孵育后的精子基因组进行琼脂糖凝胶电泳发现,随着外源质粒浓度的升高精子基因组发生降解而使胚胎发育能力受到影响。在研究线状/环状质粒的不同比例对转基因效率的影响时发现：比例为1：1的线状/环状质粒在精子结合效率和胚胎转基因效率上均显着高于1：0、1：4和0：1组(P<0.05)。将281枚2-8细胞期阳性胚胎分别移植到10只同期发情受体或供体兔自体移植,结果共有两只受体妊娠,生产出7只仔兔(编号1-7)；采用组织切片激光共聚焦扫描显微镜、PCR、RT-PCR、Southern Blotting、 Western Blotting分子生物学方法和气-质联用技术(GC-MS)对仔兔进行转基因鉴定,发现除编号3的仔兔外,其余六只均有pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒的报告基因元件EGFP及目的基因Fat-1的表达,且仔兔肌肉组织n-3多不饱和脂肪酸的相对含量有大幅提高,n-6多不饱和脂肪酸的含量则大幅下降,n-6/n-3 PUFAs的比值由野生型的约17.5±1.4下降到转基因组的0.6士0.1～1.9士0.1左右。上述结果表明：(1)质粒的浓度和线状/环状比例影响兔ICSI-MGT的转基因效率,以浓度为30 ng/μL和1：1的线状/环状比例能获得较好的转基因效率；(2)采用ICSI-MGT方法能获得整合并且表达Fat-1基因的的转基因兔,并且能降低n-6/n-3 PUFAs的比值。4、采用非变性PAGE电泳对DNA/精子蛋白质共孵育复合物和精子自由蛋白质进行分离联合质谱技术初步探讨了精子与外源DNA相互结合的分子机制。结果发现,DNA/精子蛋白质共孵育复合物泳道出现一条蛋白质-DNA结合的滞后带,对该条带进行质谱分析获得7个蛋白质,通过理化性质和蛋白保守区域分析发现其中的IAM38蛋白质均符合DBPs的性质,进一步SMART在线对7个蛋白质的功能结构域进行分析,发现仅IAM38具有若干免疫球蛋白IG结合位点及蛋白质与DNA相互作用的结构功能单元(包括锌指结构、亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构)。Western Blotting结果显示免疫球家族蛋白CD4分子在精子中有分布,但在精浆中并不存在；利用CD4分子单克隆抗体对兔精子CD4分子功能位点进行封闭后再与pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒共孵育,原位杂交结果显示：兔精子经CD4分子抗体封闭后与未封闭组相比不影响其与外源DNA的携带能力(68.3%vs 75.7%,P>0.05),但极显着地降低了外源DNA的内化(7.5% vs 51.4%,P<0.01)。将CD4分子单克隆抗体封闭后的精子进行ICSI-MGT,发现封闭后的兔精子ICSI-MGT胚胎的分裂率和囊胚率与未封闭对照组相比虽然无显着差异(70.5% vs 76.7%； 39.7% vs 32.6%；P>0.05),但阳性胚胎率及囊胚阳性率均极显着低于未封闭组(7.8% vs 43.8%；7.1% vs 56.1%,P<0.01)。上述结果表明：精子结合外源DNA模式为首先外源DNA与精子质膜的跨膜蛋白质IAM38结合,然后二者依赖免疫球蛋白的异嗜性与CD4分子形成DNA/IAM38/CD4复合物完成DNA入核转运。(本文来源于《广西大学》期刊2012-12-01）
陈自洪,崔奎青,孟凡丽,刘玉兵,王丹[4]（2012）在《水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究》一文中研究指出[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22 h后随机分为2组:①在体外受精7～10 h或18～20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显着(P>0.05),且IVF 7～10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显着高于18～20 h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10 h注射的效果优于IVF后18～20 h注射。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2012年19期）
陈自洪,崔奎青,孟凡丽,刘玉兵,王丹[5]（2012）在《水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究(英文)》一文中研究指出[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22h后随机分为2组,①在体外受精7～10或18～20h后向卵胞质内注入约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②则分别注入单个精子与约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显着(P>0.05),且IVF7～10h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显着高于18～20h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10h注射的效果优于IVF后18～20h注射。(本文来源于《Agricultural Science & Technology》期刊2012年06期）
王鹏征[6]（2010）在《全细胞胞质内注射法(WCICI)生产体细胞克隆牛胚胎及质量鉴定的研究》一文中研究指出在体细胞核移植技术中,胞质内全细胞注射法与传统的电融合法相比,具有操作简单、快速等优点,同时也可免去电融合仪这一昂贵的开支,有利于体细胞核移植技术的推广。体细胞核移植技术过程复杂,步骤较多,本研究分析了卵巢保存时间、去核方法和胚胎培养液叁个因素对生产克隆胚胎效率的影响,以期获得优化的核移植方法。胚胎质量鉴定无论在临床还是理论上都有重要意义,本研究以前人报道的方法为基础,结合本实验室的实际情况,初步建立了胚胎发育速度评定、核型分析和区分染色的方法,为进一步提高胚胎质量奠定了基础。主要的研究结果如下：1.卵巢保存对体细胞核移植胚胎早期发育的影响该试验包括两部分,第一部分研究了卵巢保存时间对胚胎发育的影响,设立了2h、9h、21h叁个组,以2h组为对照组。与对照组相比,卵巢20℃下保存9h不会影响卵母细胞成熟率(64.55% vs. 70.41%,P>0.05)以及克隆胚胎的卵裂率(65.92%vs. 66.11%,P>0.05)和囊胚率(34.09% vs. 37.20%,P>0.05)。当卵巢20℃下保存时间达到21h时,成熟率(42.47% vs. 70.41%,P<0.05)、卵裂率(40.44% vs. 66.11%,P<0.05)和囊胚率(13.60% vs. 37.20%,P<0.05)均显着低于对照组和9h组。结果表明,较长时间的卵巢保存会影响牛卵母细胞体外成熟和体细胞核移植胚胎早期发育,而较短时间(9h)的保存不会影响早期胚胎的形成率。第二部分设计了一个对照组和叁个不同保存温度的试验组(4℃,20℃,37℃),对照组采用的是保存2h的卵巢。与对照组相比,37℃下保存明显降低了卵母细胞的成熟率(47.36% vs. 70.41%,P<0.05),而4℃和20℃组与对照组相比,成熟率之间没有显着差异(55.30% vs. 70.41%,64.55% vs. 70.41%,P>0.05)。在卵裂率和囊胚率方面,20℃组显着高于4℃组(65.92% vs. 46.95%,34.09% vs. 25.78%,P<0.05),且与对照组之间没有显着差异；4℃组显着高于37℃组(46.95% vs. 24.46%,27.58%vs. 15.56%,P<0.05)；4℃组和37℃组与对照组均存在显着差异。结果说明较高或较低的温度都不利于卵巢保存,室温或略低于室温的保存温度更适合卵巢的保存。2.去核方法对克隆胚胎早期发育的影响去核方法显着影响体细胞核移植胚胎早期发育,荧光辅助去核法可以显着提高胚胎重构率(83.35% vs. 59.09%,P<0.05)；紫外照射10sec以上,显着降低了胚胎的卵裂率和囊胚率,而照射5sec以下组与盲去法组相比,卵裂率(62.44% vs. 66.93%,P>0.05)和囊胚率(30.63% vs.33.57%,P>0.05)没有显着差异。相比较而言,采用照射5sec以下的荧光辅助去核法更适合本试验研究,因为这种方法不仅简化了操作,而且提高了卵母细胞的利用率。3.胚胎培养液对克隆胚胎早期发育的影响试验随机选取完成激活的重构胚,分别用KSOM和SOF培养,发现囊胚率方面KSOM显着高于SOF组(38.24% vs.30.63%,P<0.05),说明KSOM培养液较SOF更适合体细胞核移植胚胎的早期培养。但是两种培养液的卵裂率没有显着差异(64.21% vs.62.44%,P>0.05)。4.体外胚胎核型分析本研究比较了盲去法和荧光辅助去核法紫外照射小于5sec和紫外照射大于10sec叁种情况对胚胎染色体数目的影响,紫外照射10sec以上组的非正常染色体比例(72.33%)显着高于其它两组(39.17%和42.50%),而其它两组没有显着差异(39.17% vs.42.50%,P<0.05)。试验统计了体细胞核移植胚胎染色体变异的总体情况,发现在非正常的染色体中,混倍体(17.95%)和多倍体(12.82%)的情况多于单倍体(7.69%)。试验以传统的经典遗传学方法为基础,加以改进,成功在本实验室建立起胚胎核型分析的方法。5.胚胎的区分染色将完成激活的胚胎随机分为两组分别用KSOM和mSOF培养液培养后比较细胞数目。两种培养液得到的胚胎滋养层细胞数(59.87 vs.74.83,P<0.01)和总细胞数(81.59 vs.100.16,P<0.01)之间均存在显着差异,但内细胞团细胞数之间没有显着差异(P>0.05)。试验以最近报道的较为高效的区分染色方法为基础,加以改进,在本实验室初步建立了该方法。(本文来源于《华中农业大学》期刊2010-06-01）
杨素芳,陈自洪,韦精卫,陆凤花,石德顺[7]（2009）在《水牛体细胞核移植方法比较及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法核移植效果的影响》一文中研究指出本研究旨在比较水牛2种体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)方法的效果以及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法(Whole-Cell Intracytoplasmic Microinjection,WCICSI)核移植效果的影响。采用水牛胎儿成纤维细胞作为供核,比较了透明带下注核法(Perivitelline Microinjection,PM)和WCICSI核移植效果。另外,试验了不同类型的供体细胞进行全细胞胞质内注射后与激活前的受体胞质的最适宜作用时间。结果,WCICSI构建核移植重构胚的成功率显着高于PM(87.1%vs 81.1%,P<0.05),虽然其重构胚的分裂率极显着低于PM(49.5%vs 71.8%,P<0.01),但囊胚率、核移植的效率无显着差异(P>0.05)。卵丘细胞和胎儿成纤维细胞在注射后3 h激活,重构胚的囊胚发育率最高;颗粒细胞注射后与激活前的最佳时间间隔可在1.5~3 h,但3 h是最佳的作用时间。结果表明,(1)WCICSI可用于水牛体细胞核移植的研究;(2)水牛胞质内注射供体细胞后3 h进行激活,核移植重构胚的发育效果最好。(本文来源于《畜牧兽医学报》期刊2009年12期）
张文龙[8]（2008）在《影响山羊单精子胞质内注射（ICSI）效果主要因素的研究》一文中研究指出本试验研究了影响山羊单精子胞质内注射效果的主要因素，以期在优化ICSI具体处理措施的基础上，降低ICSI过程中机械刺激、生物刺激以及试剂(或药物)对卵母细胞的损伤，提高精核解聚率(受精率)，进而改善ICSI的总体效果。精子操作液中添加8％(g／ml)PVP与5％添加量相比可以保证较高的操作效率(92．50％vs44．62％，P<0．01)，和添加PVP12％相比ICSI受精率显着提高(58．33％vs29．73％，P<0．05)。与内径为6μm和10μm的注射针相比，8μm注射针对精子损伤较小且一次注射成功率和受精率都比较高，适合于山羊ICSI研究使用。山羊卵母细胞体外成熟26h和成熟28h ICSI的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率均极显着(或显着)地高于成熟24h的相应胚胎发育率，适当延长卵母细胞成熟时间有利于提高山羊ICSI的效果。精子操作液中添加肝素后使受精率由原来的46．67％提高到57．17％，精子显微操作液中添加40μg的肝素，对提高山羊ICSI的受精率具有一定的促进作用。ICSI注射微滴中加CB组和未加CB组间的卵裂率差异不显着(78．57％vs72．92％，P>0．05)，两组的囊胚发育率之间均差异不显着(P>0．05)。应用鲜精和冻精进行ICSI，冻精的ICSI受精率显着高于鲜精(52．21％vs 26．44％，P<0．05)。山羊ICSI激活方法的研究，分为对照组(精子注射后，不激活)、试验一组(精子注射后，离子霉素5min+6-DMAP 3h联合激活)和试验二组(精子注射后，离子霉素单独激活15min)叁个试验组进行，结果为：对照组山羊ICSI胚被激活的效率较低(卵裂率仅为7．94％，不能发育到桑椹胚)；试验一组和试验二组的卵裂率(78．40％和82．69％)、桑椹胚率(46．94％和47．67％)以及囊胚率(9．18％和13．95％)均极显着得高于对照组(P<0．01)，两组各相应指标间的差异均不显着(P>0．05)。卵丘细胞的有无及共培养对ICSI胚胎早期发育的影响研究，试验一组(卵母细胞为裸卵且不作单层细胞共培养)、试验二组(卵母细胞为裸卵，进行单层细胞共培养)和试验叁组(卵母细胞带有部分卵丘，不作单层细胞共培养)叁个组卵裂率之间的差异不显着(P>0．05)，试验二组和试验叁组的桑椹胚率(44．86％和46．77％)和囊胚率(19．30％和20．97％)均显着高于裸卵组(桑椹胚率29．09％、囊胚率7．27％)(P<0．05)。高氧环境(20％O_2的空气)与低氧环境(90％N_2+5％CO_2+5％O_2混合气)下ICSI受精胚卵裂率、桑椹胚率无显着差异(P>0.05)，低氧环境下的囊胚率显着高于高氧环境下的囊胚率(19．59％vs7．81％，P<0．05)。(本文来源于《河北农业大学》期刊2008-06-10）
孔庆然,罗一博,田江天,王振坤,张力[9]（2008）在《全细胞胞质内注射法生产猪重构胚的研究(简报)》一文中研究指出自从1997年克隆羊"Dolly"[1]出生以来,体细胞核移植技术得到广泛应用,已经有十余种克隆哺乳动物出生,但克隆效率仍然很低,核移植方法的不够完善是其重要原因之一。传统的核移植方法——电融合法和胞质内注射法虽然都取得了成功,但还存(本文来源于《分子细胞生物学报》期刊2008年01期）
孟凡丽,韦精卫,石德顺,卢晟盛[10]（2004）在《水牛精子在胞质内注射后的早期形态变化》一文中研究指出应用胞质内精子注射 (intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术探讨了水牛卵母细胞胞质与注射精子间的相互作用以及 ICSI精子的形态变化。ICSI后 13h,5 9.4 %的精子头部已膨大 ,且有 18.8%的精子进入解聚状态。雌雄原核发育不同步 ,雄原核在 ICSI后 16 h和 19h的形成率分别为 3.2 %和 4 0 .0 % ;雌原核在 ICSI后 13h已达到 71.9% ,16 h时提高到 90 .3%。经离子霉素与 6 - DMAP联合激活 ,ICSI后 19h产生的胚胎核型以 2 PN+PB1 为主 ,其雌原核形成 (激活 )率为 91.3% ,雄原核形成率为 4 0 .0 % ,5 1.3%为孤雌胚。用 5 mm ol/ L 的 DTT预处理精子 1h,可提高精子的解聚率 (30 .9%比 12 .7% ,P<0 .0 5 ) ,但对雄原核的形成率无显着影响 (33.3%比 32 .7% ,P>0 .0 5 )。结果表明 ,水牛精子 ICSI后的雄原核形成时间晚于卵子雌原核形成时间 ,且其比率低于卵子 ,DTT处理精子能提高其解聚率 ,但对雄原核形成无影响(本文来源于《中国兽医学报》期刊2004年06期）
胞质内注射论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
卵胞质注射转基因(CI-MGT)具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点,结合体内受精胚胎和高效基因编辑技术,最近被广泛应用于转基因动物生产中。单精子胞质内注射转基因(ICSI-MGT)适于大片段外源基因转移,并能有效解决猪体外受精胚胎多精子受精等问题,特别适用于转基因猪的生产。广西地处高温高湿的亚热带地区,为优化此种环境下猪胚胎和转基因技术体系,本研究在优化猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎培养条件的基础上,系统探讨了体外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相关影响因素,并对CI-MGT体外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生产转基因猪可行性进行了研究。研究结果如下：1.探讨了成熟液和胚胎培养液组分对猪卵母细胞成熟及胚胎发育效果的影响。结果显示,成熟基础液为TCM-199核成熟率和胚胎发育效率显着高于NCSU-37和PZM-3(P<0.05)。以TCM-199为成熟基础液,不加额外能量底物(PMt)的核成熟率和孤雌囊胚发育率分别为74.1土2.4%和29.3+1.3%,显着高于添加0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖(PMtsg)或0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺(PMtsgg, P<0.05)。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG组的核成熟率和胚胎发育效率显着高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I组囊胚率显着高于添加10 ng/mL EGF和不添加组(P<0.05)。对猪卵母细胞体外成熟过程中核相变化研究显示,成熟培养38 h的核成熟率为57%(105/184),40 h为43%(82/189),42 h为48%(75/155),44 h为59%(208/354),46 h为70%(59/84),48 h为62%(51/82),50 h为74%(154/207)。在以PZM-3为基础液的胚胎培养液中添加0.277 mmol/L肌醇(PZMi),其囊胚率显着高于添加0.34 mmol/L柠檬酸钠(PZMc)或0.34 mmol/L柠檬酸钠+0.277 mmol/L肌醇(PZMci, P<0.05);添加0.5 mg/mL透明质酸组的囊胚率显着高于未添加组(P<0.05)；添加3 mg/mL BSA-FAF组的囊胚率显着高于添加BSA-V组(41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P<0.05)。培养液中BSA浓度增加至5 mg/mL或在培养96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差异不显着。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚细胞数高于未添加组,但差异不显着。2.探讨了激活方法对猪卵母细胞孤雌胚胎发育效果的影响。结果显示,卵母细胞经5 μmol/L离子霉素(Ion)激活5 min后,再分别在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP),5μg/mL细胞松弛素B (CB)+10放线菌酮(CHX),5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培养4 h的囊胚率显着高于在10μg/mL CHX培养4 h的囊胚率(29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P<0.05),但四组间囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着差异。当电脉电压为1.25KV/cm时3次电脉冲电激活的囊胚发育率显着高于2次电脉冲(P<0.05),当电脉冲为3次时电场强度为0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率显着低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm组的囊胚率显着高于0.80和1.20 KV/cm组(P<0.05)。卵母细胞电激活后分别用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培养处理4 h的囊胚率(55.4±1.2%和50.4±2.9%)显着高于用2 mmol/L 6-DMAP (37.9±2.4%),5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP (36.9±3.1%)培养处理4 h的囊胚发育率,亦显着高于单纯电激活处理(40.7±1.7%)和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP (30.6±0.8%)培养处理4 h的囊胚发育率(P<0.05。电激活后,用5μg/mLCB培养处理4 h的囊胚率显着高于用5μg/mLCB培养处理4 h(54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P<0.05),与7.5μg/mLCB组差异不显着,但7.5μg/mLCB组的ICM细胞数和ICM/TE均显着高于5 μg/mLCB组(P<0.05)。对胚胎核型进行分析结果表明,电激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培养处理4 h的囊胚细胞二倍体率显着高于单纯电激活处理组(84.6% vs 40.0%,P<0.05)。3.研究了猪卵胞质内注射转基因的影响因素。孤雌激活卵胞质注射(PA-CI)的研究结果显示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制剂对孤雌激活卵的囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着影响,表明可同时注射外源RNA和RNA酶抑制剂。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚阳性率显着高于50 ng/μL和空注组,但囊胚率显着低于其余两组(33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P<0.05)；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率与50 ng/μL注射组和空注组差异不显着,表明注射DNA对胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均显着低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率(P<0.05)。注射EGFP-N1线性化DNA的囊胚阳性率显着高于环状DNA(15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P<0.05),但两者胚胎发育率差异不显着,并且外源RNA注射组的囊胚率普遍高于注射DNA载体。当采用体外受精卵进行胞质内注射时(IVF-CI),精卵孵育后5-18 h注射线性化EGFP-N1载体的囊胚率和囊胚细胞数差异均不显着,但5-6、8-9和11-12 h注射组胚胎阳性率显着高于14-15和17-18 h(12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P<0.05),表明外源DNA在猪雌雄原核形成期(约13 h)前注射的外源基因整合效率较高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA组囊胚率显着高于100 ng/μL,与10、20、30ng/μL和空注组差异不显着,同时40、50和100 ng/pL组阳性率显着高于其余各组(P<0.05)。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率显着低于PA卵(13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P<0.05),但注射IVF卵的胚胎基因突变效率显着高于注射PA卵(25.0% vs3.8%,P<0.05),表明Cas9/sgRNA系统可以通过注射猪IVF卵对猪的基因组进行编辑。4.系统研究了猪单精子胞质内注射转基因的影响因素。结果显示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA与精子共孵育的囊胚率显着高于50和100 ng/μL(33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P<0.05),但20ng/μL孵育组胚胎阳性率显着高于10ng/μL(30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P<0.05)。精子与外源基因孵育5、30和60 min囊胚率显着高于孵育24 h,但30和60 min组阳性率和囊胚阳性率显着高于5 min(P<0.05)。采用不同冷冻液(DPBS、 BTS和mNIM)冷冻精子对ICSI-MGT胚胎发育率无显着影响,但精子孵育液DPBS+EDTA (10 mmol/L EDTA)的囊胚率显着高于DPBS(27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P<0.05), mNIM (10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl)组的囊胚率显着高于DPBS+EDTA组(33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P<0.05),表明孵育液中的EDTA和K+对注射后的胚胎发育有影响。精子超声+冻融处理和NaOH处理的囊胚率显着高于鲜精、A23187、超声、冻融和叁次冻融处理组,超声+冻融和NaOH处理组的胚胎外源基因阳性率亦显着高于鲜精和A23187处理组。此外,卵母细胞激活后注射超声+冻融和NaOH处理精子的囊胚率显着高于激活前注射组(35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P<0.05),表明精子破膜与激活影响ICSI-MGT胚胎的发育。卵母细胞激活后0-30 min注射的囊胚率显着低于60-90 min注射组,但阳性率和囊胚阳性率均显着高于60-90 min注射组。对ICSI后不同时间合子内的GSH含量分析显示,激活后0-30 min注射组的6 h合子GSH含量显着低于60-90 min注射组和孤雌激活组(3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P<0.05),而60-90 min注射组的6 h和12 h合子GSH含量与孤雌组均无显着差异。进一步原核分析发现,0-30 min注射组的雌雄双原核形成率显着高于60-90 min(56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P<0.05),且0-30min注射组精子解聚率显着高于60-90min,表明延长激活以后的注射时间会造成更高的孤雌胚胎产生。采用不同外源基因载体(EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP)的ICSI-MGT囊胚率差异不显着,但显着影响胚胎阳性率,其中EGFP-N1线性化载体阳性率显着高于环状载体(35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P<0.05),而Anti-FMDV RNAi载体阳性率和囊胚阳性率均显着低于其它载体(P<0.05)。将Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6头自然发情受体内,4头未见返情,其中7557号受体流产获得3头胎猪,7645号受体妊娠到期得到4头仔猪,对仔猪耳朵皮肤EGFP和Neo双基因进行PCR鉴定均显示阳性,表明应用优化的ICSI-MGT技术可以获得转基因猪后代。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胞质内注射论文参考文献
[1].麦然标,纪红美,贺晓燕,石俊松,王青来.全细胞胞质内注射法制作猪克隆胚胎的研究[C].中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十八届学术研讨会暨中日韩第四届动物繁殖学术交流会论文集.2016
[2].刘帅.猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究[D].广西大学.2015
[3].张顺.单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究[D].广西大学.2012
[4].陈自洪,崔奎青,孟凡丽,刘玉兵,王丹.水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究[J].安徽农业科学.2012
[5].陈自洪,崔奎青,孟凡丽,刘玉兵,王丹.水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究(英文)[J].AgriculturalScience&Technology.2012
[6].王鹏征.全细胞胞质内注射法(WCICI)生产体细胞克隆牛胚胎及质量鉴定的研究[D].华中农业大学.2010
[7].杨素芳,陈自洪,韦精卫,陆凤花,石德顺.水牛体细胞核移植方法比较及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法核移植效果的影响[J].畜牧兽医学报.2009
[8].张文龙.影响山羊单精子胞质内注射（ICSI）效果主要因素的研究[D].河北农业大学.2008
[9].孔庆然,罗一博,田江天,王振坤,张力.全细胞胞质内注射法生产猪重构胚的研究(简报)[J].分子细胞生物学报.2008
[10].孟凡丽,韦精卫,石德顺,卢晟盛.水牛精子在胞质内注射后的早期形态变化[J].中国兽医学报.2004
论文知识图
