导读:本文包含了体外亲和力成熟论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:抗体,亲和力,成熟,全人,肝癌,分子,体外。
体外亲和力成熟论文文献综述
先德群[1]（2018）在《抗TSLP全人源重组抗体亲和力的体外成熟》一文中研究指出目的:胸腺基质细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)于20多年前,被鉴定为小鼠胸腺基质细胞系分泌的一种细胞因子。不久后,相应的人类直系同源基因也被发现。目前,TSLP所介导的信号传导通路已被广泛研究,包括上调多种Th2相关疾病的细胞因子,如:哮喘、遗传过敏性皮炎、超敏反应,甚至有部分癌症也与之相关。所以,TSLP被认为是治疗相关疾病的潜在靶标~([1])。自1975年杂交瘤技术问世以来,人们能制备具有良好特异性的单克隆抗体。但由于此类单抗的鼠源性,在用于治疗人类疾病时,会产生强烈的人抗鼠抗体反应(HAMA)~([2,3]),导致临床应用受到限制。目前的抗体药物领域的研究热点,主要集中于利用基因工程技术,将鼠源抗体进行人源化改造~([4-6])。单克隆抗体药物的发展先后经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体四个阶段~([7])。本实验平台前期构建大库容量全人源抗体文库和噬菌体展示技术,筛选获得了anti-TSLP-scFv(抗胸腺基质细胞生成素全人源单链抗体),很好的解决了免疫原性问题,但通过此技术获得的抗体亲和力较低~([8,9])。本研究通过计算机辅助技术对抗体和抗原进行同源建模,并通过分子对接和分子动力学模拟,预测可以提高抗体亲和力的氨基酸残基,进行定点突变,以促进抗TSLP人源重组抗体的体外亲和力成熟。方法:本研究前期,已通过噬菌体展示技术从全人源抗体文库筛选了特异性好的抗TSLP-scFv(84),并通过基因公司测序,获得了该抗体的DNA序列。1.本研究利用计算机辅助技术构建TSLP和抗TSLP-scFv的同源叁维模型,并使用分子对接技术进行分子动力学及力场模拟,获得合理稳定的对接模型。通过丙氨酸扫描及单点突变,预测出突变后能提高抗体亲和力的氨基酸位点。2.根据突变位点设计特异性引物,采取重迭PCR原理,对目的片段进行单点突变,获得突变后的抗TSLP-scFv的DNA序列。将突变后的序列与原核表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF,感受肽,表达后通过ELISA筛选出亲和力提升的抗TSLP-scFv菌株。3.将亲和力提升的抗体基因插入真核表达载体PCDNA3.1-sp-Fc和PMH_3~(en),转染HEK-293T细胞,表达抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定获得的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。4.通过生物大分子相互作用技术检测重组抗体的亲和力。结果:1.利用计算机Discovery studio4.5系统,建立TSLP抗原和抗TSLP-scFv叁维模型。通过BLAST Search(NCBI Server)搜索到与TSLP和抗TSLP-scFv序列相似度最高的5J11A和4KFZ C(VH)/4HS6 A(VL)作为初始模型。通过ZDOCK对蛋白质进行对接计算,基于CHARMm力场能量,使用RDOCK对ZDOCK寻找到的对接复合物构型进行优化。通过分子动力学模拟,获得最终的对接稳定构象Pose50。通过对接表面氨基酸分析,进行丙氨酸扫描及饱和突变,确定虚拟突变后亲和力提升的氨基酸组合为TRP(109)-ARG,TRP(109)-LYS,TRP(109)-TYR,TRP(109)-LEU,TRP(109)-GLU。2.通过突变位点的特异性引物相互配对,扩增出突变点前片段大小约为300bp,突变点后片段大小约为450bp。重迭延伸PCR连接后的抗TSLP-scFv基因片段大小约为750bp。3.将突变后的抗TSLP-scFv基因序列插入表达载体pLZ16,测序验证重组成功的质粒转化E.coli DH5αF,。通过原核系统表达抗TSLP-scFv,ELISA筛选出突变后的M4亲和力明显提升。4.突变前的84和突变后的M4基因序列,成功重组到真核表达质粒PCDNA3.1-sp-Fc和PMH_3~(en),转染HEK-293T细胞后表达的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白,经SDS-PAGE、Western blot鉴定大小约为67KD。5.生物大分子相互作用技术(BIAcore)测定突变后的M4,亲和力较突变前提高了约10倍。结论:利用计算机辅助技术,成功促进了抗TSLP重组抗体的体外亲和力成熟。(本文来源于《西南医科大学》期刊2018-05-01）
先德群,年四季,叶迎春,徐文峰,袁青[2]（2017）在《抗TSLP全人源单链抗体的体外亲和力成熟》一文中研究指出目的:对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力。方法:本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv叁维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显着提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重迭延伸PCR对氨基酸位点进行突变。将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF,,表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv。结果:DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLPscFv DNA片段大小为1000bp左右。将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右。结论:成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力。(本文来源于《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2017-10-26）
刘媛,林曼曼,张霄,徐重新,焦凌霞[3]（2016）在《基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用》一文中研究指出从天然抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低,在微摩尔水平;同时,经过多次免疫获得的天然抗体也存在100 pmol/L的亲和力极限。然而,以抗体亲和力体内成熟为理论基础的亲和力体外成熟技术,可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程。该技术可以解决库来源抗体亲和力不高、实际应用难的问题,也可以帮助天然抗体突破其亲和力极限。抗体基因体外突变技术可以模拟自体高频突变过程,是抗体亲和力体外成熟的重要手段,常见的抗体基因体外突变技术可以分为易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、DNA改组、突变株、定点突变和链替换等方法。易错PCR可以在抗体基因全长或部分区域随机引入突变,但随着突变率的增加,阳性克隆数量呈指数性递减。DNA改组包括抗体片段随机化切割和重组步骤,可以加快抗体的体外进化速度。突变株法易于构建超大容量的抗体库,但有害突变和突变率难以控制。定点突变的区域通常选择与抗原直接接触的互补决定区(complementary determination region,CDR)或自体突变热点进行操作。链替换通常保留母体抗体的一条重链或轻链,而对另一条链进行随机化组合。这些基因突变方法在提高抗体亲和力中获得了不同程度的应用,但也存在效率不高,且方法选择较为盲目等问题。可是,采用抗体X射线晶体衍射和计算机模拟等方法,却可以帮助预测抗体结合部位,为突变位点的理性设计和方法选择提供有效信息,因而成为亲和力体外成熟技术未来发展的趋势之一。(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2016年01期）
徐磊[4]（2015）在《靶向多亚型IFNα的新表位全人源单抗的体外亲和力成熟》一文中研究指出AIA22是从大容量全合成人单链噬菌体抗体库中通过高通量固相筛方法获得的一个抗多亚型IFNα全人源抗体分子,具有有别于临床在研同靶点抗体(Sifalimumab和AGS-009)的全新抗原表位(IFNAR2结合表位),能够有效中和除IFNa-7以外的全部IFNα亚型,具备与临床在研同靶点抗体完全不同的IFNα亚型中和谱。前期研究证实,AIA22较对照抗体Sifalimumab具有明显的表位优势,主要体现为AIA22在对IFNα-2b等亚型亲和力低于Sifalimumab的情况下表现出明显优于Sifalimumab的中和活性。但是,AIA22对多数亚型IFNα(IFNa-2b、4b除外)的中和活性不及对照抗体Sifalimumab,提示候选抗体分子AIA22有待进一步改造,以提升其对多个亚型IFNα的中和活性。本研究主要依赖基于结构的抗体体外亲和力成熟技术,对AIA22进行定点设计和改造,并评价其结合活性、中和活性、稳定性、代谢特征等分子特性,最终筛选获得对多亚型IFNα亲和力和中和活性明显提高的候选抗体分子,整体中和活性达到甚至超过对照抗体Sifalimumab的水平。首先,我们对AIA22轻重链CDR区进行了丙氨酸扫描,并通过ELISA方法鉴定丙氨酸扫描突变体对IFNa-1b和IFNa-2b的结合活性变化,结果揭示了抗原抗体相互作用的关键信息,为同源模建和分子对接方法构建的抗原-抗体复合物结构模型提供了实验数据支持。基于对复合物结构模型的分析,发现AIA22和IFNa-Ib亲和力低的可能原因是AIA22与IFNa-1b相互作用界面存在明显的结构冲突(重链Y99与IFNα-1b的LoopAB区)。结合丙氨酸扫描的结果,以改变冲突位点局部构象为目的,我们设计了一系列突变体抗体,ELISA鉴定其结合活性的变化,同时对结合活性显着改善的突变位点进行选择组合。采用ELISA和forteBio系统就组合突变体对IFNα-1b和IFNα-2b的亲和力及动力学特性进行鉴定,获得多个对IFNα-1b结合活性有改善对IFNa-2b结合活性不降低的突变体抗体。进一步地,对突变体抗体进行体外中和活性的鉴定,并最终获得对多个IFNa亚型中和活性明显提高的突变体抗体分子L-S34A+H-32G96W(命名为AIAmut)。相比于亲本抗体AIA22, AIAmut对IFNa-1b、2a、2b、4b、5、10、16、17、21的中和活性有不同程度的提高,对IFNα-6、8的中和活性基本保持不变,对IFNa-14中和活性降低明显。整体而言,AIAmut对IFNα中和活性有明显的提升。相比于对照抗体Sifalimumab,突变体抗体AIAmut在保证对IFNa-2b中和活性优势的前提下,对IFNα-4b、5、10、16、17、21的中和活性也达到Sifalimumab水平；对IFNα-1b的中和活性已接近Sifalimumab;对IFNα-6,8,14的中和活性与Sifalimumab仍存在较大差距。在基于结构模建进行分子设计的同时,我们成功结晶了AIA22-Fab/IFNα-2b复合物,并解析获得晶体结构信息。基于复合物晶体结构,以AIAmut为基础,我们设计了一系列突变体抗体分子。首先,我们构建了突变体抗体分子,并利用forteBio系统对突变体进行鉴定,比较突变体抗体分子对IFNα-lb的亲和力与结合特征的变化。对优选的突变体抗体分子,进一步检测其对IFNa-2b的亲和力与结合特征的变化。淘汰对IFNa-2b结合活性明显降低的突变体,最终得到W2S1A7、W2A7、W2A10、W2A11、S1A7、S1A10、S1A11、VV3共计8个候选突变体抗体分子。进一步地,我们以表达水平、稳定性和中和活性等为评价指标对8个候选抗体分子进行优选。稳定性评价方面,以4℃放置样品为标准品,分别以重组IFNα-1b-His、IFNα-2b-His和IFNα-4a-His为目标抗原,比较分析室温和37℃条件下于血清和pH6.5 PBS缓冲液中放置的各突变体抗体的结合活性,进而评价其稳定性。结果表明,除W3和SIA11的结合活性表现明显低于其他突变体及AIAmut外,其他突变体稳定性均好于AIAmut。考虑W3的表达水平明显低于其他突变体,直接淘汰W3。同时,结合各突变体抗体对IFNa-1b和IFNa-2b中和活性的初步评价结果,优选出W2S1A7、W2A7和W2A10叁个突变体抗体分子。与AIAmut相比,叁个突变体抗体分子对IFNα-1b和FNα-2b的中和活性均有提高,特别是对IFNa-1b的中和活性提升明显,达到甚至优于Sifalimumab的水平。就叁个候选抗体分子对各亚型IFNa的中和活性进行全面评价,结果表明,W2S1A7和W2A7对各亚型IFNa整体(除IFNa-14外)的中和活性提升更为明显。具体地,W2S1A7和W2A7对IFNα-2b、4a、21的中和活性优于Sifalimumab;对IFNα-1b、5、8、10、16、17的中和活性与Sifalimumab相当；对IFNa-6的中和活性有明显提高,但与Sifalimumab相比仍然存在较大差距；对IFNa-7仍无中和活性；相比于AIAmut,突变体抗体分子对IFNa-14的中和活性存在明显降低。Babl/C小鼠的体内的代谢特征评价结果表明,W2SIA7和W2A7体内半衰期均不低于120小时。相比之下,W2S1A7最高血药浓度及半衰期均优于W2A7,因此,我们最终确定W2S1A7为候选抗体药物分子。(本文来源于《安徽大学》期刊2015-05-01）
曾大地[5]（2010）在《计算机辅助设计进行抗VEGF抗体体外亲和力成熟》一文中研究指出恶性肿瘤严重威胁人类健康,全球每年有700多万人死于恶性肿瘤,1000多万新增肿瘤患者。在我国,恶性肿瘤已成为城市人口的主要死亡原因,占死亡人口总数的21%。WHO预计,到2020年,全世界肿瘤发病率将是现在的两倍。对于肿瘤的治疗,早期主要采用手术及放、化疗的方法,但是这些方法存在着各自的缺点:手术治疗依赖于早期诊断,而放、化疗的副作用很大。因此迫切需要开发新型抗肿瘤药物,而抗血管生成的治疗性抗体的出现为肿瘤治疗开辟了新途径。新生血管的形成对肿瘤的生长和转移至关重要。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor, VEGF)与其受体VEGFR相互作用,能特异地促进内皮细胞分裂、增殖及迁移,在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。通过阻断VEGF/VEGFR,可以特异性阻断或抑制VEGF/VEGFR所介导的生物学活性,从而抑制肿瘤血管生成,达到治疗恶性肿瘤、抑制肿瘤进展的目的。因此针对VEGF开发治疗肿瘤的抗体成为人们关注热点。目前抗VEGF人源化抗体贝伐单抗(Bevacizumab,商品名Avastin )已成功上市,并产生了巨大的社会效益及经济价值,2009年年销售额达到57.7亿美元,并被认为是最有市场开发前景的治疗性抗体。但是国际上还没有成功应用于临床的全人源抗VEGF抗体。因此,开发以VEGF为靶标的全人源抗体具有广阔应用前景和重大意义。本研究室通过对大容量全合成噬菌体人源抗体库的筛选,获得了近50株人源抗VEGF单链抗体,这为开发具有自主知识产权的抗VEGF治疗性抗体奠定了基础。为了便于研究,本研究将筛选到的两株抗VEGF单链抗体VA6、VK8改造为IgG1全抗体,并将这两株全抗体在FreeStyle~(TM)293细胞中进行了瞬时表达,表达量可达20mg/L,获得的全抗体纯品为以后的实验提供了充足稳定的实验材料。改造的两株全抗体保持了VEGF-A165特异性结合的活性,利用Bia-core方法测定了两株全抗体的亲和力,VA6、VK8亲和力分别为12.7nM和0.77nM。体外活性试验结果显示,两株全抗体都具有一定的体外活性,具有进一步开发为治疗性抗体的潜质。由于VEGF/VEGFR2的亲和力在0.1nM水平,只有亲和力达到或超过这个水平的抗体才能较好地阻断VEGF和VEGFR结合,达到临床应用的要求。VA6、VK8两株抗体的亲和力尚不能达到此水平,因此需要进行体外亲和力成熟以提高这两株抗体的亲和力。本研究对这两株抗体进行了体外亲和力成熟,以期改善其体外、体内生物学活性,同时尝试建立可行的亲和力成熟方法,以便应用于其它抗体的开发研究,为治疗性抗体的研发提供技术支撑。我们以两株抗VEGF单克隆抗体为模版,采用计算机辅助设计的技术路线,根据构建的抗原-抗体复合物结构模型所提供的信息进行全抗体突变体设计,然后进行试验分析验证,寻找亲和力得以改善的突变体。在得到亲和力有所提高的突变体之后,再进行下一轮的突变体设计、分析与验证,如此反复进行,以期获得亲和力显着提高,功能有所改善的突变体。并在此基础上,通过进一步改进和完善,建立起高效的抗体亲和力成熟方法,为治疗性抗体的研发提供技术支持。首先,我们通过同源模建的方法,构建了VA6和VEGF复合物的叁维结构模型,通过对该模型的深入分析,发现该抗体与VEGF的结合表位与VEGF受体1、受体2的结合表位交错重迭。推测该抗体能够抑制VEGF与其受体的结合,从而抑制VEGF的生物学活性。VA6轻链CDR3区第90位赖氨酸、第92位天冬氨酸两个氨基酸残基由于所带电荷性质和对应的VEGF界面上的残基电荷性质相同,存在排斥作用,明显不利于抗原抗体的结合。根据结构模型所获信息,我们设计并构建了一系列突变体。利用FreeStyleTM293-F细胞双载体瞬时表达系统,对所构建的突变体进行了全抗体表达,用Protein A柱进行亲和层析纯化。在对抗体突变体亲和力分析过程中,通过反复尝试,我们建立了一种简便的定性比较抗体相对亲和力的ELISA方法。运用该方法初步分析了所构建突变体的亲和力,结果表明,突变体A6L-K90D_D92I和A6L-K90D_D92V亲和力分别有了不同程度的提高。Bia-core测定这两株突变体的亲和力,分别达到亲本抗体亲和力的1.5倍和2.3倍。这一结果证明所构建的模型准确,该亲和力成熟方法可行有效。在此工作基础上,我们以A6L-K90D_D92V为目标抗体,构建了新的叁维结构模型。通过对该结构的详细分析,确定抗体重链57位的丝氨酸与VEGF上86位组氨酸距离较近,将重链57位氨基酸改变为带负电荷的残基可以增强抗原-抗体之间的作用力。同时在结构模型中分析发现,重链98位氨基酸在CDR3区的loop区顶端,与抗原距离较远,因此决定在该区域引入3个氨基酸,以增加该区域与抗原的作用界面面积。按照第一轮突变体构建与分析策略,构建了突变体并进行了全抗体的表达与分析。结果显示,在将重链57位丝氨酸突变为谷氨酸后,抗体亲和力有所提高(A6H-S57E,与轻链A6L-K90D_D92V匹配),比A6L-K90D_D92V的亲和力高2倍,这样这一轮得到的突变体A6H-S57E亲和力达到亲本抗体的7倍。随后,按照和前两轮相同的策略,对第二轮获得的亲和力最高的突变体进行了新一轮的叁维结构模建和分析。结果显示,该突变体重链52位和54位的丝氨酸空间与VEGF表面相应区域空间结构契合不是十分严密,并且VEGF表面相应区域有氢键受体,所以可以改变这两个位置的氨基酸以增加契合面积,同时增加供体氢原子,以使该区域抗原抗体间形成氢键。根据这些信息设计了20株突变体并进行了亲和力分析,结果显示将52位和54位的丝氨酸都突变为苏氨酸之后抗体亲和力得到了进一步的提高(A6H-S52T_S54T_ S57E,与轻链A6L-K90D_D92V匹配),抗体亲和力达到初始亲本抗体的10倍以上。在获得了VA6高亲和力突变体的工作基础上,我们尝试用同样的方法对另外一株抗体VK8进行体外亲和力成熟,并选择界面残基相互作用能作为衡量突变体亲和力是否可能提高的参数,尝试将突变体设计的过程标准化,以便更高效地获得高亲和力突变体,但是却遇到了困难。按照构建的模型设计的所有突变体亲和力都未见提高。通过分析认为该模型与实际情况存在偏差。随后我们对模型构建策略进行了改进,通过“迭合优化”和“分子对接”两种方法分别获得了多个模型。通过分析这些模型,认为其中的模型5更有可能与真实的抗原-抗体复合物结构相符。通过对这些模型进行综合分析及实验验证,初步确定了正确的模型,并最终获得了亲和力有所提高的突变体。通过上述研究,我们初步确定了构建抗原-抗体复合物结构模型的方法,建立了抗VEGF单克隆抗体VA6、VK8的叁维结构模型,并以此为依据,通过计算机辅助设计构建了大量突变体,最终获得了这两株抗VEGF单克隆抗体的高亲和力突变体。高亲和力突变体的获得,为进一步将VA6、VK8开发成治疗性抗体提供了有效的技术手段,而计算机辅助设计进行抗体体外亲和力成熟方法的建立,为开发人源治疗性抗体提供了技术支持。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2010-05-15）
陶俊[6]（2007）在《人源性bFGF Fab抗体体外亲和力成熟的研究》一文中研究指出目的：在本室构建的bFGF抗体库的基础上，采用定点突变和CDR移步的方法构建突变的bFGF噬菌体抗体库，进多轮筛选获得亲和力提高的Fab抗体。方法：通过重迭PCR法对重链的CDR3区的八个位点进行NNS(N=A，T，C，GS=GC)突变，回收突变片断，进行SpeⅠ／XhoⅠ双酶切后连接到连有轻链的Pcomb3H载体中，将构建的重组噬菌粒载体电转化XL1-Blue，以辅助噬菌体VCSM13超感染，构建突变库。用bFGF包被酶标板，对抗体库进行4轮固相筛选，获得亲和力提高的bFGF Fab抗体。结果：将突变的Fd段插入到含有轻链的pComb3H载体中构建人Fab抗体突变库，库容约为2.5×10~6辅助噬菌体超感染后建立了人Fab噬菌体抗体库，滴度为6.5×10~(11)pfu／mL，经过3轮“吸附—洗脱—扩增”的淘选富集，携带有抗bFGF特异性抗体的噬菌体得到了有效的富集；挑选50个克隆进行挽救，经phage-ELISA检测，获得2个具有高bFGF特异性和高亲和力的Fab噬菌体抗体克隆，可溶性表达，测定亲和力常数，有1株亲和力提高了2.5倍。结论：利用定点随机突变和热点突变相结合的方法构建突变库，从中筛选到亲和力提高的Fab抗体，Fab抗体亲和力成熟改造提供有效的途径。(本文来源于《暨南大学》期刊2007-05-01）
卢筱华[7]（2006）在《抗肝癌单链抗体的体外亲和力成熟研究》一文中研究指出第一部分 抗肝癌噬菌体单链抗体突变库的构建和筛选 目的：体外模拟抗体体内成熟过程，构建抗肝癌噬菌体单链抗体突变库，并从中筛选出与肝癌细胞特异性结合的单链抗体。 方法：采用错配PCR和DNA改组技术依次对原始抗肝癌单链抗体A4-16重链可变区和轻链可变区分别进行突变构建抗肝癌噬菌体单链抗体突变库；利用噬菌体展示技术对突变库进行4轮富集筛淘及ELISA鉴定；以ELISA方法测定所获阳性克隆的特异性。 结果：成功构建了抗肝癌噬菌体单链抗体突变库，目的基因插入率为91％，实际库容量为4.5×10~7；经过4轮富集筛淘及ELISA鉴定后获得4株阳性克隆M1、M2、M3、M4；对阳性克隆特异性分析发现，M1、M2、M3、M4表达的噬菌体抗体均与叁种肝癌细胞结合，而与正常肝细胞、肠癌细胞、胃癌细胞和胰腺癌细胞不结合。 结论：(1)错配PCR结合DNA改组技术是进行抗体体外亲和力成熟的一种有效且简便的手段；(2)经筛选获得的4株阳性克隆M1、M2、M3、M4与原始克隆A4-16同样具有良好的抗原结合特异性。 第二部分 抗肝癌噬菌体抗体相对亲和力测定和氨基酸序列分析 目的：比较阳性克隆M1、M2、M3、M4与原始克隆A4-16噬菌体抗体的相对亲和力，并且分析阳性克隆中突变的氨基酸序列；将所有发生在CDR区的突变进行组合后获得的新突变体DM的亲和力进行初步评价。 方法：以硫氰酸盐洗脱法测定4株阳性克隆M1、M2、M3、M4和原始克隆A4-16表达的噬菌体抗体相对亲和力；选取高亲和力的阳性克隆进行基因序列测定并确定序(本文来源于《暨南大学》期刊2006-04-01）
卢筱华,杨冬华,周旻,汤绍辉[8]（2006）在《抗肝癌单链抗体体外亲和力成熟的改造及意义》一文中研究指出目的从体外模拟抗体的体内成熟过程,以获得高亲和力抗肝癌单链抗体。方法采用错配聚合酶链反应(PCR)法随机突变抗肝癌单链抗体重链和轻链可变区,构建抗肝癌噬菌体抗体次级突变库,利用噬菌体展示技术从中筛选出高亲和力单链抗体突变株。结果抗肝癌噬菌体抗体次级突变库容为4．5× 10~7,经过3轮富集筛选和酶联免疫吸附法鉴定获得2株突变株M90、M116,不仅保留原始克隆的特异性,而且相对亲和力指数分别为原始克隆的1．7倍和2倍。结论错配PCR结合噬菌体展示技术是提高单链抗体亲和力的一种有效且简便的手段。(本文来源于《中华肝脏病杂志》期刊2006年03期）
孙志伟,王双,杜威世,俞炜源[9]（2004）在《抗肝癌人源化单链抗体hscFv_(25)的体外亲和力成熟》一文中研究指出目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力. 方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定. 结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性. 结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.(本文来源于《世界华人消化杂志》期刊2004年11期）
林周,黎燕,沈倍奋[10]（2004）在《体外抗体亲和力成熟的几种策略》一文中研究指出抗体在疾病诊断、治疗和预防方面发挥着举足轻重的作用。随着抗体工程技术的不断发展 ,抗体已经成为生物制药领域中的热点。而抗体工程发展所面临的两大难点问题之一就是如何提高基因工程抗体的亲和力。本文综述了有关基因工程抗体体外抗体亲和力成熟方面的最新进展。(本文来源于《军事医学科学院院刊》期刊2004年03期）
体外亲和力成熟论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力。方法:本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv叁维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显着提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重迭延伸PCR对氨基酸位点进行突变。将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF,,表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv。结果:DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLPscFv DNA片段大小为1000bp左右。将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右。结论:成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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