猪源多杀性巴氏杆菌保护性抗原基因体外重组表达及免疫效果研究

论文摘要

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.multocida）是导致中国生猪产业中主要的一种细菌性疾病,主要引起猪肺炎,萎缩性鼻炎。由于P.multocida血清型众多,且各血清型之间的交叉保护尚不明确,因此尚需对P.multocida的抗原类型、免疫机制等进行更深入的研究。本次课题选用OmpA、OmpH、plpP和plpE四个保护性抗原作为研究对象,体外重组表达并配制成亚单位疫苗,以小鼠为实验动物进行免疫攻毒保护试验,为进一步探索、开发猪源多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗研提供资料积累。1、本试验采用PCR方法,以本实验室保存的PmA8.1菌株DNA为模板克隆了OmpA、OmpH、plpP和plpE四个保护性抗原基因,并构建至pET-28（a）载体中,获得了pET28-OmpA、pET28-OmpH、pET28-plpE和pET28-plpP四个重组表达质粒,将体外表达重组蛋白用铝胶佐剂、弗氏佐剂和ISA201佐剂分别配制成亚单位疫苗接种免疫小鼠进行攻毒实验,结果显示,四个重组质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经诱导表达OmpA、OmpH、plpE均为包涵体表达,plpP无表达。OmpA疫苗组中,ISA201-OmpA攻毒保护率达到了50%;AL-OmpA和弗氏-OmpA的攻毒保护率为16.6%;OmpH疫苗组中,除AL-OmpH的攻毒保护率有16.6%外,其余两个佐剂组的保护率为0;plpE疫苗组中,ISA201-plpE攻毒保护率为100%,其余两个佐剂组的保护率均为90%。2、构建OmpA、OmpH、plpP和plpE四个保护性抗原与大肠杆菌不耐热肠毒素B型亚基（LTB）融合表达载体,将纯化的表达蛋白与佐剂ISA201配制成疫苗接种免疫小鼠,攻毒结果表明,LTB能提高OmpH与plpE蛋白的免疫保护效果,LTB-OmpH融合蛋白的保护率为16.6%,单独构建的OmpH保护率为0。LTB-OmpA融合蛋白保护率为16.6%,与抗原OmpA相比,保护率降低。融合表达的plpP蛋白保护率为33.3%。融合表达的OmpA、OmpH和plpP联合免疫的保护率为16.6%,与LTB-OmpA、LTB-OmpH单独免疫的保护率相当。LTB-plpE融合蛋白的保护率为100%,6只小鼠中仅3只小鼠出现发病症状。综上,本次试验保护性效果最好的抗原是plpE,由ISA201佐剂配制的LTB-plpE与plpE亚单位疫苗对抵抗PmA8.1菌株的保护效果是100%,两者相比,经LTB-plpE免疫过的小鼠比plpE免疫过的小鼠,发病率明显降低。其次是OmpA,单独构建的OmpA与ISA201佐剂配制成疫苗具有50%的保护效果。

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摘要

Abstract

第一章综述

1.1 多杀性巴氏杆菌的生物学特性、危害及国内流调

1.1.1 多杀性巴氏杆菌的血清型分类

1.1.2 多杀性巴氏杆菌的危害

1.1.3 猪源多杀性巴氏杆菌国内的流行情况

1.2 多杀性巴氏杆菌的毒力因子

1.2.1 外膜蛋白

1.2.2 毒素

1.2.3 荚膜

1.2.4 脂多糖

1.3 多杀性巴氏杆菌保护性抗原

1.4 多杀性巴氏杆菌疫苗的研究

1.4.1 灭活苗

1.4.2 弱毒疫苗

1.4.3 亚单位疫苗

第二章 OmpA、OmpH、plpE、plp P四个保护性抗原载体构建及原核表达

2.1 试验材料

2.1.1 质粒载体及菌株

2.1.2 试验试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 Pm保护性抗原克隆引物设计及PCR扩增

2.2.2 OmpH、PlpP重组质粒的构建

2.2.3 感受态试剂的制备

2.2.4 DH5-α细胞感受态的制备

2.2.5 重组质粒转入DH5-α细胞感受态

2.2.6 PlpP、OmpH、plpE阳性转化子的鉴定

2.2.7 将重组质粒转入BL21 细胞感受态中

2.2.8 四个重组菌的诱导表达

2.2.9 包涵体的洗涤

2.2.10 包涵体的纯化

2.2.11 包涵体的复性

2.2.12 BCA法蛋白浓度的测定

2.2.13 疫苗的配制

2.3 试验结果

2.3.1 Pm保护性抗原PCR扩增结果

2.3.2 重组质粒构建与阳性转化子鉴定结果

2.3.3 重组质粒测序结果

2.3.4 四个重组菌的诱导表达

2.3.5 包涵体蛋白的洗涤

2.3.6 包涵体蛋白的纯化

2.3.7 BCA法蛋白浓度测定结果

2.3.8 亚单位疫苗的配制

2.4 讨论与分析

2.4.1 关于克隆引物设计相关的问题

2.4.2 包涵体蛋白的洗涤、纯化及复性

第三章不同佐剂Pm重组蛋白对小鼠的保护作用

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.2.1 PmA8.1 株细菌生长曲线

3.2.2 攻毒预实验

3.2.3 小鼠免疫程序的制定

3.2.4 腹腔注射攻毒试验方法

3.3 试验结果

3.3.1 PmA8.1 菌株培养各时间段OD值

3.3.2 细菌平板划线计数

3.3.3 实际攻毒剂量与预实验攻毒结果

3.3.4 预实验小鼠死亡情况

3.3.5 腹腔攻毒试验结果

3.4 讨论与分析

第四章 OmpA、OmpH、plpE、plp P与大肠杆菌LTB基因融合表达及免疫效果研究

4.1 试验材料

4.1.1 质粒载体及菌株

4.1.2 试验试剂及试验动物

4.1.3 主要仪器设备

4.2 试验方法

4.2.1 四个重组菌的培养与质粒提取

4.2.2 pET28-plpE、pET28-ompA和 p ET28-omp H质粒PCR扩增

4.2.3 亚单位疫苗的配制

4.2.4 小鼠免疫程序的制定

4.2.5 腹腔注射攻毒试验方法

4.3 试验结果

4.3.1 OmpA、OmpH、plpE、plpP阳性转化子鉴定

4.3.2 四个重组菌的诱导表达

4.3.3 包涵体洗涤结果

4.3.4 包涵体的纯化

4.3.5 亚单位疫苗的配制

4.3.6 腹腔攻毒试验结果

4.4 讨论与分析

全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨成凯

导师: 苏建明,余兴龙,王俊辉

关键词: 多杀性巴氏杆菌,保护性抗原,亚单位疫苗,融合表达

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 湖南农业大学

分类号: S852.4

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000146

总页数: 55

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