石永英[1]2003年在《大鼠血管球囊损伤后血管平滑肌细胞的增殖和凋亡与雷帕霉素的干预》文中提出背景：介入治疗是目前国内外广泛开展的冠心病非外科治疗的重要方法。其中经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)有效、简便、安全，是目前应用最多的介入治疗方法之一。近年来，在近百个国家和地区采用该方法治疗冠心病的病例已超过了同期外科搭桥病例数。然而，PTCA后冠状动脉再狭窄(Restenosis，RS)的比例较高，严重影响了PTCA的远期疗效。引起广大临床和基础科研工作者的极大关注，并进行了大量研究。实验室资料显示球囊扩张后再狭窄与血管弹性回缩、血栓的形成和机化，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)过度增生及细胞外基质的聚集等有关。其中血管平滑肌细胞的过度增殖可能是再狭窄形成的主要原因。对血管进行球囊扩张后，血管内皮和中膜平滑肌细胞受到牵拉、损伤，在修复过程中在一系列生长因子的刺激作用下，VSMC过度增殖、并向内膜方向迁移。因而抑制VSMC过度增殖以防治再狭窄成为广大医务工作者关注和研究的课题。实验研究显示_P27蛋白和雷帕霉素等有较强的抑制细胞增殖的作用。 _p27蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependnt 助兴大尝医笋朦硕生~研羌生.早业讼戈.kinase inhibitor， CKI)，通过抑制周期蛋白(cydin)和周期蛋白依赖性激酶(eyelin dependllt kinase，CDK)来调节细胞周期。P 27基因的蛋白表达形式有l2]:P27kiP，，P27Ick，P27巧c2等，其中P27饰，是最常见的蛋白表达形式。P 27蛋白的高表达可显着抑制血管平滑肌细胞增殖，有望成为治疗PTCA后再狭窄的新手段。 雷帕霉素扭apamycin)是一种已应用于器官移植后抗排斥反应的新型免疫抑制剂，可通过不同途径调节细胞周期而抑制细胞增殖。资料显示雷帕霉素有抑制P27蛋白降解的作用，但在对VSMC的增殖与凋亡之间的关系尚无一致意见。 细胞凋亡是指细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身程序而结束自己生命的过程。动脉球囊扩张后再狭窄过程中，可见有平滑肌细胞的凋亡，但凋亡出现的时间和凋亡的程度目前尚无一致意见。 目的:本研究拟通过经皮球囊血管内成形术(percutaneoustranslulninal angioplasty， PTA)建立大鼠腹主动脉球囊损伤模型，研究P27蛋白水平与血管平滑肌细胞增殖程度的关系及国产雷帕霉素的干预作用。 方法:雄性SPrague一Dawley(SD)大鼠150只，分笼饲养于标准实验房(22℃)，给予规律光照(12h:12h)，自由饮食，随机分假手术组(n=20)、单纯球囊损伤组(n=40)、梭甲基纤维素组(n=40)和雷帕霉素给药组(n科0)4组。假手术组单纯分离并结扎颈总动脉;单纯球囊组、梭甲基纤维素对照组和雷帕霉素组球囊过度扩张损伤腹主动脉;梭甲基纤维素组术后注射梭甲基纤维素钠液稀o.25m叭g，雷帕霉素组术后注射雷帕霉素0.25m叭g。术中术后动物死亡10只。各组于术后3天、7天、14天、21天及28天处死动物，取腹主动脉检测观察:1、常规制片，HE染色观 触兴大尝茵尝朦硕士研兑生‘较企讼戈.察组织学结构。2、免疫组化法测定。一肌球蛋白和PCNA(ProliferatingeeU nuclear antigen)检测大鼠血管平滑肌细胞增殖情况。3、westem一blot法、流式细胞计数(now cytome甸，FcM)检测大鼠血管平滑肌细胞增殖、凋亡情况及P27蛋白表达情况。 结果:1大鼠血管经球囊损伤后内皮细胞剥脱，内弹力板破坏、断裂，7天时平滑肌细胞明显增殖，14天时增殖达到高峰并向内皮细胞层迁移、增殖，术后28天细胞仍有增殖;雷帕霉素组新生内膜面积比对照组减少36.4%(0.14士o.o3nunZ vs 0.23士o.o6nnnZ at 14 days，P<0.02)，内膜z中膜之比少28.9%(17.7士3.37%vs 28.86士10.25%at 14 days，p<0.01)。 2、l)细胞周期:14天时对照组G0一Gl期细胞数占总细胞数68.35士6.32%，雷帕霉素给药组G0一Gl期细胞数占总细胞数82.55士7，51%，雷帕霉素组vSMCGO一G，期细胞数明显多于对照组(P<0 .01)。2)CDKZ和cydinE:术后不同时间段各雷帕霉素给药组CDKZ，cycli五E表达均下降，14天时表达明显低于对照组33.76士2.85 vs 22.83士2.10，和28.32士1.35 vs 18.32士2.10(P<0 .01)。3)术后3天、7天、14天、21天和28天雷帕霉素组P27肠‘表达均高于对照组(P<0.01)，其中14天时P27兀p，最高67.4士2.5vs 33.6士2.7。4)对照组和雷帕霉素组术后3天细胞凋亡率分别为9.1士1.1%vs 14.2士2.1%，雷帕霉素组比对照组增高24.5士2.6%少<0.01);至7天时逐渐下降，14天、21天、28天时凋亡数降低。 3、雷帕霉素组血胆固醇升高1.28士0.42(术前)vs 1.”士0.47(术后28天)，肾功能、外周血白细胞计数无改变。 结论: 1、球囊过度扩张可损伤动脉血管，损伤后动脉血管平滑肌细胞开始增殖;损伤后早期可见血管平滑肌细胞凋亡，其后有较低水平的细胞凋肋义才学茵尝脂硕士研穷全笋.必落戈.亡。 2、损伤后血管平滑肌细胞碑7蛋白的表
张颖倩[2]2016年在《尼可地尔抑制大鼠颈动脉球囊拉伤后内膜增生及促进内皮化的研究》文中研究说明目的：建立大鼠颈动脉球囊拉伤模型、糖尿病大鼠模型,并体外培养血管内皮细胞及血管平滑肌细胞,从动物-细胞-分子水平验证尼可地尔抑制大鼠颈动脉球囊拉伤后内膜增生并促进再内皮化的作用,为减少冠脉介入术后相关并发症提供新的理论依据。方法：腹腔注STZ建立糖尿病大鼠模型并行颈动脉球囊拉伤,分组：①假手术组(8只);②球囊拉伤组(10只);③尼可地尔组(10只);④尼可地尔-5HD共作用组(10只)。20只大鼠经血管外膜转染siRNA:NC siRNA组(10只);εPKC siRNA组(10只)。PCNA免疫组化染色分析细胞增殖；CD68免疫组化染色分析血管内炎性细胞浸润。培养原代VSMCs并分组：①对照组;②高糖组;③尼可地尔组;④尼可地尔-5-HD共处理组。VSMCs转染NC siRNA或εPKC siRNA,并检测细胞增殖与迁移。建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型,大鼠分为5组：①假手术组(10只);②球囊拉伤组(10只);③雷帕霉素组(20只);④雷帕霉素-尼可地尔共作用组(10只);⑤雷帕霉素-NAC共作用组(10只)。伊文思蓝染色及CD31免疫荧光染色检测血管再内皮化程度。DHE染色检测血管冰冻切片ROS水平。培养原代CMECs并分组：①对照组;②雷帕霉素组;③雷帕霉素-尼可地尔共处理组。于CMECs中转染XOsiRNA,Akt siRNA及NC siRNA。FCM检测Annexin V-FITC/PI染色细胞。酶标仪检测caspase 3活性。MTT法及BrdU试剂盒检测细胞增殖。划痕试验检测细胞迁移。FCM检测细胞内DHE荧光强度。Western blot检测血管中XO、εPKC蛋白及细胞水平XO、Akt、p-Akt、ePKC蛋白表达。qRT-PCR检测eNOS mRNA的表达。结果：糖尿病大鼠球囊损伤后14d新生内膜显着增生,尼可地尔组内膜增生减少,5-HD与尼可地尔共处理阻断了尼可地尔抑制内膜增生的作用。与球囊拉伤组糖尿病大鼠相比,尼可地尔组血管内膜中CD68、PCNA阳性细胞均减少。尼可地尔-5-HD共处理组大鼠血管新生内膜中PCNA、CD68阳性细胞较尼可地尔组增加。球囊拉伤组糖尿病大鼠颈动脉εPKC蛋白转位增加,尼可地尔抑制了εPKC蛋白转位,5-HD阻断了尼可地尔对颈动脉εPKC蛋白转位的抑制作用。经血管外膜转染εPKC siRNA后,内膜增生被抑制,其中CD68、PCNA阳性细胞均减少。高糖培养24h后,VSMCs增殖和迁移较对照组显着。尼可地尔抑制了高糖诱发的VSMCs细胞增殖和迁移,尼可地尔-5-HD共处理组VSMCs增殖和迁移较尼可地尔组增强。与转染NC siRNA的VSMCs相比,转染εPKC siRNA的VSMCs细胞增殖和迁移也明显下降。雷帕霉素组大鼠再内皮化被抑制,尼可地尔可逆转雷帕霉素造成的再内皮化延迟。球囊拉伤组大鼠动脉ROS上升,雷帕霉素组大鼠动脉ROS进一步上升,尼可地尔-雷帕霉素共处理使血管中ROS下降。NAC抗氧化应激后,大鼠颈动脉再内皮化面积增加。球囊拉伤血管中XO蛋白升高,雷帕霉素使拉伤的颈动脉中XO蛋白进一步升高,雷帕霉素-尼可地尔共处理组大鼠颈动脉中XO蛋白下降。另外,雷帕霉素-尼可地尔共处理组大鼠颈动脉eNOS mRNA表达水平较雷帕霉素组上升。细胞实验发现,雷帕霉素诱导CMECs凋亡和ROS升高,雷帕霉素-尼可地尔共处理组CMECs凋亡率、caspase 3活性及ROS均较之下降。雷帕霉素干预后,转染XO siRNA的CMECs凋亡率、caspase 3舌性及ROS均较转染NC siRNA的CMECs降低。雷帕霉素抑制了CMECs增殖和迁移,而雷帕霉素-尼可地尔共处理使细胞增殖及迁移较之增强。雷帕霉素干预后,转染XO siRNA的CMECs迁移及增殖均较转染NC siRNA的CMECs增强。雷帕霉素抑制CMECs内Akt磷酸化,雷帕霉素-尼可地尔共处理组细胞Akt磷酸化水平升高。CMECs中转染Akt siRNA后eNOS mRNA表达被抑制。结论：1.尼可地尔抑制糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,并抑制细胞增殖和炎性细胞浸润。尼可地尔也抑制了高糖诱发的VSMCs增殖和迁移。2.尼可地尔开放mitoK+ ATP通道来抑制εPKC通路激活,并通过该机制抑制糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生、减少细胞增殖和炎性细胞浸润。3.尼可地尔促进动脉球囊拉伤后再内皮化进程,其与雷帕霉素共作用弥补了雷帕霉素在抑制内膜增生的同时也抑制了再内皮化的不足。4.在球囊损伤血管及CMECs中,雷帕霉素诱导了XO蛋白升高并促进ROS生成。5.尼可地尔抑制了血管及CMECs中XO的升高,减少了XO来源的ROS：尼可地尔同时促进了被雷帕霉素抑制的Akt/eNOS表达：从而减轻雷帕霉素诱导的CMECs凋亡和氧化应激,促进了CMECs的增殖和迁移,并促进了再内皮化。
蒋路平[3]2007年在《阿托伐他汀及雷帕霉素对HO-1表达和血管平滑肌细胞增殖的影响研究》文中研究指明背景血红素氧化酶-1 (Heme oxygenase-1，HO-1)是血红素代谢的起始酶和限速酶，具有抗炎、抗氧化和抗细胞增殖的作用。研究表明，HO-1可抑制血管平滑肌细胞增殖。阿托伐他汀是目前最有效的他汀类制剂之一，除具有明显的降脂作用外，还可以抑制血管平滑肌细胞增殖。阿托伐他汀抑制血管平滑肌细胞增殖的机制尚不是很明确。阿托伐他汀是否通过诱导HO-1表达而抑制血管平滑肌细胞增殖尚未见报道。目的研究阿托伐他汀对血管平滑肌细胞增殖和血红素氧化酶(HO-1)表达的影响，观察阿托伐他汀＋信号通道阻滞剂对血管平滑肌细胞HO-1mRNA表达的影响，以探讨阿托伐他汀诱导的HO-1在抗血管平滑肌细胞增殖中的作用及阿托伐他汀诱导HO-1表达的信号机制。方法1、酶消化法分离大鼠胸主动脉的血管平滑肌细胞，进行形态学观察，并运用免疫细胞化学法进行细胞鉴定。2、取其4-6代细胞用于实验，IGF-I刺激血管平滑肌细胞增殖，以不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μmol／L)的阿托伐他汀、10μmol／L阿托伐他汀＋锌原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)进行干预。3、在10μmol／L阿托伐他汀干预的基础上分别加入LY294002(PI3K信号通道阻滞剂)、SB203580(P38信号通道阻滞剂)、PD98059(ERK信号通道阻滞剂)。4、采用台盼兰染色活细胞计数、四唑盐(MTT)比色法观察细胞的增殖。免疫细胞化学方法观察细胞HO-1的表达。逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)半定量分析细胞HO-1mRNA的表达。结果1、IGF-Ⅰ可促进血管平滑肌细胞增殖，与空白组比较，IGF-Ⅰ组细胞计数明显增加(P＜0.01)，随着阿托伐他汀浓度的提高，血管平滑肌细胞计数逐渐减少(P＜0.01)，加入ZnPPⅨ(特异性HO-1阻滞剂)后血管平滑肌细胞增殖恢复。2、空白组和IGF-Ⅰ组血管平滑肌细胞有少量的HO-1表达，随着阿托伐他汀浓度的增加，HO-1的表达增强，呈剂量依赖性。与空白组和IGF-1组比较，0.01μmol／L组HO-1增加不明显，0.1μmol／L组HO-1开始有较明显增加、10μmol／L组HO-1表达达高峰(P＜0.01)。3、10μmol／L阿托伐他汀干预的基础上，加入PD98059，HO-1mRNA表达无明显减少(P＞0.05)；加入LY294002、SB203580后，HO-1mRNA表达明显减少(P＜0.01)，两者合用时HO-1mRNA表达更低。结论1、阿托伐他汀可抑制血管平滑肌细胞的增殖。2、阿托伐他汀可诱导HO-1的表达。3、诱导HO-1表达是阿托伐他汀抑制血管平滑肌细胞增殖的机制之一。4、阿托伐他汀主要通过p38、PI3K信号途径诱导HO-1的表达。背景血管平滑肌细胞增殖引起的血管内膜增生是介入治疗术后再狭窄的主要原因，HO-1可抑制血管平滑肌细胞增殖。雷帕霉素是一种新型的免疫抑制剂，目前广泛应用于药物支架的药物涂层，可通过抑制血管平滑肌细胞增殖而防治再狭窄，雷帕霉素抑制血管平滑肌细胞增殖的机制不是很明确。其抑制血管平滑肌细胞增生是否与HO-1有关值得研究。其与阿托伐他汀联合使用对HO-1的影响尚未见报道，有待深入研究。目的研究雷帕霉素对HO-1表达及血管平滑肌细胞增殖的影响，以探讨雷帕霉素诱导的HO-1在抗血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法培养的4-6代血管平滑肌细胞，以IGF-1刺激细胞增殖，分别加入不同浓度的雷帕霉素(0、0.01、0.1、1、10μmol／L)、雷帕霉素＋／－阿托伐他汀＋／－ZnPPⅨ(均为10μmol／L)进行干预。采用台盼兰染色活细胞计数、四唑盐(MTT)比色法观察细胞的增殖。免疫细胞化学方法观察细胞HO-1的表达。逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)半定量分析HO-1mRNA的表达。结果1、IGF-Ⅰ可促进血管平滑肌细胞增殖，随着雷帕霉素浓度的提高，血管平滑肌细胞计数逐渐减少，与IGF-Ⅰ组比较，0.01μmol／L组细胞计数无显着差异(P＞0.05)，0.1、1、10μmol／L组细胞计数减少(P＜0.01)；联合使用阿托伐他汀时血管平滑肌细胞计数更少，与10μmol／L组比较，阿托伐他汀和雷帕霉素联合治疗组细胞计数显着减少(P＜0.01)；加入ZnPPⅨ后血管平滑肌细胞增殖恢复。2、空白组和IGF-Ⅰ血管平滑肌细胞的HO-1有少量表达，随着雷帕霉素浓度的增加，HO-1的表达增强，呈剂量依赖性。与空白组和IGF-1组比较，0.01μmol／L组HO-1增加不明显(P＞0.05)；0.1μmol／L组HO-1开始有较明显增加、10μmol／L组HO-1表达达高峰(P＜0.01)，联合使用阿托伐他汀时HO-1表达更强(P＜0.01)。结论：1、雷帕霉素可抑制血管平滑肌细胞增殖。2、雷帕霉素可诱导HO-1的表达。3、诱导HO-1表达是雷帕霉素抑制血管平滑肌细胞增殖的机制之一。4、雷帕霉素和阿托伐他汀联合使用具有更好的诱导HO-1表达和抑制VSMC增殖的作用。背景经皮腔内冠状动脉成形术(Percautaneous luminalcoronary angioplasty，PTCA)是目前冠心病的主要治疗手段，术后仍有不少患者出现再狭窄，是介入心脏病学的难题之一。损伤血管平滑肌细胞增殖，内膜增生是再狭窄形成的主要原因。研究显示，HO-1可以抑制损伤血管的平滑肌细胞增殖，抑制血管内膜增生。阿托伐他汀和雷帕霉素都可以在一定程度上防止再狭窄的发生，他们是否通过诱导血管壁HO-1的表达而抑制血管内膜增生、防治再狭窄尚未见报道，有待于深入研究。目的研究大鼠颈动脉球囊扩张损伤后HO-1的表达及阿托伐他汀和雷帕霉素对球囊损伤后HO-1表达和内膜增生的影响。探讨HO-1在阿托伐他汀和雷帕霉素防治再狭窄中的作用。方法48只健康雄性SD大鼠，随机分成正常对照组、手术未干预组、阿托伐他汀组、雷帕霉素组、阿托伐他汀＋雷帕霉素组、阿托伐他汀＋ZnPPⅨ组、雷帕霉素＋ZnPPⅨ组、阿托伐他汀＋雷帕霉素＋ZnPPⅨ组。球囊损伤左侧颈总动脉，右侧颈总动脉作为对照。28天后处死动物，HE染色观察内膜及中膜增生情况，计算内膜和中膜面积及其比值。免疫组织化学法及RT-PCR观察HO-1的表达。结果与正常对照组血管比较，损伤组对侧血管内膜无明显增生(P＞0.05)，损伤侧血管内膜增生明显(P＜0.01)。与手术未干预组比较，雷帕霉素组、阿托他汀组、阿托伐他汀＋雷帕霉素组的损伤侧内膜横截面面积及内膜与中膜横截面面积比值明显减少(P＜0.01)；阿托伐他汀＋ZnPPⅨ组、雷帕霉素＋ZnPPⅨ组、阿托伐他汀＋雷帕霉素＋ZnPPⅨ组则无显着性差异(P＞0.05)。与正常对照组血管比较，手术未干预组HO-1升高(P＜0.01)；与手术未干预组比较，雷帕霉素组、阿托他汀组、阿托伐他汀＋雷帕霉素组的HO-1的表达明显升高(P＜0.01)；与雷帕霉素组、阿托他汀组比较，阿托伐他汀＋雷帕霉素组诱导HO-1表达作用更显着(P＜0.01)。结论球囊扩张损伤大鼠颈总动脉模型可作为研究血管再狭窄的较为理想的动物模型。阿托伐他汀和雷帕霉素可以防治大鼠颈动脉损伤后血管内膜增生及再狭窄的形成，诱导HO-1表达为其作用机制之一。阿托伐他汀和雷帕霉素在诱导HO-1的表达和防止再狭窄形成方面有协同作用。
刘海涛[4]2010年在《雷帕霉素抑制内皮细胞增殖和迁移：PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路的作用》文中认为研究背景冠状动脉介入治疗发展到今天,药物洗脱支架已经取得令人瞩目的效果。相对于金属裸支架治疗而言,药物洗脱支架在减少血管成形术后再狭窄方面有着不可比拟的优势。但随着其大规模的临床应用,药物洗脱支架术后支架内血栓又引起了人们的关注。与裸支架相比,药物洗脱支架降低了术后再狭窄率却没有改变甚至增加了支架内血栓的发生。尤其是晚期支架内血栓形成更加导致人们对药物洗脱支架应用的疑虑。随着研究的不断深入,人们发现,支架内血栓形成与支架表面的内皮化程度密切相关,即内皮化越完全,支架内血栓发生的机率越低。实验中发现,祼支架术后28天内可完全内皮化,而药物洗脱支架在6个月时还显示内膜愈合不完全,表面有纤维蛋白沉积及炎症细胞附着,易发生支架内血栓。而多数研究认为,引起药物支架表面内皮化不完全的主要原因是支架表面的涂层药物。雷帕霉素(西罗莫司)是一种大环内酯类免疫抑制剂。由于该药有免疫抑制、抗炎和抗细胞增殖作用,所以人们将其涂层于金属支架表面,通过支架植入后药物在病变部位的局部释放,抑制血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)的迁移和增殖,最终减少术后再狭窄率。雷帕霉素主要是与胞浆蛋白--FK506结合蛋白12(FKBP-12)结合形成FKBP12/雷帕霉素复合物,再与胞内特定的细胞周期调节蛋白--哺乳动物雷帕霉素靶分子(Mammalian target of rapamycin, mTOR)结合,并抑制其活性,从而干预多个G1期向S期过渡的周期调控蛋白,最终诱导细胞周期停滞于G1期的晚期。鉴于细胞普遍表达细胞周期调控蛋白,可以想象,雷帕霉素不但影响VSMCs的增殖和迁移,同样影响内皮细胞的增殖和迁移及内皮祖细胞在局部的定位及附着,而这两种细胞对内皮修复是至关重要。这也可能是药物洗脱支架术后,支架表面内皮化延迟的原因。研究目的1.动物在体实验观察植入祼金属支架和药物洗脱支架28天后,局部血管段内皮愈合和血小板黏附情况。2.体外细胞实验观察雷帕霉素对内皮细胞增殖和迁移的影响;对内皮祖细胞凋亡的影响。同时在体实验观察雷帕霉素对循环中VEGF表达的影响。3.研究PI3K/Akt及mTOR/p70S6K信号通路是否参与雷帕霉素对内皮细胞增殖和迁移的抑制作用,并明确PI3K/Akt与mTOR/p70S6K信号蛋白在其中的作用和两者的相互关系。实验方法1.六只18-22 kg雄性杂种犬在左胸廓内动脉远端及近端分别植入Cypher雷帕霉素药物洗脱支架和Bx sonic裸金属支架。术前及术后给予双联抗血小板治疗;术后1个月,处死杂种犬,解剖离取支架植入处血管段并固定;纵切后电镜扫描观察支架表面血管覆盖情况及是否有血小板黏附或微血栓形成。2.原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞及内皮祖细胞,加入不同浓度的雷帕霉素(0.1、1、10和100 ng/ml)或等体积的10%甲醇孵育24、48或72小时。MTT法检测内皮细胞及内皮祖细胞增殖;划痕法及Tranwell小室法观察内皮细胞迁移;流式细胞术检查内皮细胞及内皮祖细胞凋亡。3. SD雄性大鼠(100-150 g)给予雷帕霉素(0.05、0.10、0.15和0.20 mg/kg/d)或者10%甲醇(0.1 ml/kg/d)连续腹腔注射5天,尾静脉采血,ELISA法检测大鼠血循环中VEGF水平。4.雷帕霉素(10 ng/ml)孵育微血管内皮细胞24小时后,Western blot法观察FKBP-12、mTOR及p70 S6激酶磷酸化水平,并与用同等浓度甲醇孵育的对照组进行比较。5.原代培养的微血管内皮细胞分组为:对照组;VEGF (20 ng/ml)组;VEGF (20 ng/ml)+Wortmannin (100 nM)组及VEGF (20 ng/ml)+LY294002 (20μM)组。各组细胞培养24小时后,观察内皮细胞的增殖和迁移。同时Western blot法检测mTOR和p70 S激酶的表达水平和磷酸化水平。6.原代培养的微血管内皮细胞分组为:对照组;VEGF (20 ng/ml)组;VEGF (20 ng/ml)+Wortmannin (100 nM);VEGF (20 ng/ml)+LY294002 (20μM)组;雷帕霉素(10 ng/ml)组。各组内皮细胞培养4小时后,裂解细胞,Western blot法观察Akt和p-Akt表达水平。实验结果1.犬胸廓内动脉金属裸支架及药物支架植入30天后的电镜扫描发现:与金属裸支架相比,药物支架表面内皮化不完全;部分药物支架暴露于管腔;局部表面有血小板黏附形成。2.孵育24小时后,10 ng/ml及100 ng/ml的雷帕霉素明显抑制内皮细胞增殖(71.5%±6.4% vs. Control, P < 0.01;57.0%±9.0% vs. Control, P < 0.001);48小时后,1 ng/ml的雷帕霉素也明显抑制内皮细胞增殖(55.3%±13.4% vs. Control,P < 0.01);0.1 ng/ml组于72小时后明显抑制内皮细胞增殖(26.3%±11.9 % vs. Control,P < 0.01)。孵育24小时后,雷帕霉素明显抑制内皮细胞的迁移,1 ng/ml组是对照组的75.5%±7.0%(P < 0.05);10 ng/ml组是对照组的65.2%±4.3%(P < 0.001);而100 ng/ml组是对照组的39.5%±8.0%(P < 0.001)。和对照组相比,0.1、1、10和100 ng/ml的雷帕霉素组中内皮祖细胞的增殖分别为98.7%±8.9%(P > 0.05)、84.9%±6.7%(P < 0.001)、77.2%±6.1%(P < 0.001)及69.0%±4.1% (P < 0.001)。雷帕霉素也诱导内皮祖细胞的凋亡,正常内皮祖细胞组的凋亡率为4.2‰±0.5‰,而1、10和100 ng/ml的雷帕霉素组中,内皮祖细胞的凋亡率分别为:10.8‰±0.8‰、14.4‰±1.0‰及18.6‰±1.2‰(P < 0.001)。3. SD大鼠腹腔给药5天后与对照组相比,高浓度的雷帕霉素(0.15和0.2 mg/kg/d)明显抑制循环中VEGF的表达(P < 0.05及P < 0.01),但较低浓度的雷帕霉素(0.05和0.10 mg/kg/d)没有抑制作用。4. Western blot法分析见雷帕霉素(10 ng/ml)孵育24小时后抑制内皮细胞中mTOR的磷酸化水平,但FKBP-12磷酸化水平未有改变,而且内皮细胞中p70 S6激酶的磷酸化也被雷帕霉素抑制。5. VEGF作用4小时后,内皮细胞中mTOR和p70 S6K蛋白磷酸化水平明显增加,但PI3K/Akt的特异性抑制剂Wortmannin或LY294002可完全阻断VEGF的这一作用。6. VEGF明显促进内皮细胞迁移(188.0%±5.5% vs.对照组, P < 0.001);而VEGF+LY294002或者VEGF+Wortmannin组与对照组比较,内皮细胞的迁移无差别(89.3%±11.3%及83.7%±6.8% vs.对照组, P > 0.05)。同样观察到VEGF明显促进内皮细胞增殖(175.7%±8.9% vs.对照组, P < 0.001);而VEGF+LY294002或者VEGF+Wortmannin组与对照组比较则无变化(82.8%±10.9%及99.0%±5.9% vs.对照组, P > 0.05)。7. Wortmannin和LY294002都可抑制内皮细胞中Akt蛋白的磷酸化。但雷帕霉素孵育4小时后,Akt的磷酸化水平增高。结论1.雷帕霉素洗脱支架植入术后28天,支架表面内皮化不完全。其原因可能为雷帕霉素抑制内皮细胞的增殖和迁移、诱导内皮祖细胞的凋亡、并且减少局部血管中VEGF的表达,从而延缓药物洗脱支架后再内皮化进程。2.雷帕霉素通过抑制mTOR/p70 S6K蛋白的激活进而抑制内皮细胞的增殖和迁移;PI3K /Akt信号蛋白是激活mTOR/p70 S6K蛋白所必需的,并且是上游信号蛋白。3. PI3K /Akt信号蛋白和mTOR/p70 S6K信号蛋白并非是单纯的线性关系,在雷帕霉素抑制mTOR/p70 S6K蛋白的过程中,PI3K和mTOR之间存在反馈调节,Akt可能是反馈调节的中间分子。
石永英, 张元春, 许端敏, 袁文金, 陈畅[5]2007年在《大鼠血管球囊损伤后血管平滑肌细胞的增殖与凋亡》文中进行了进一步梳理目的研究经皮穿刺血管内成形术(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)后大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖程度与凋亡表达情况,及国产雷帕霉素(Rapamycin)对血管平滑肌细胞增殖与表达的影响。方法流式细胞计数法测定细胞周期、CDK2、cyclinE蛋白的表达及细胞凋亡在大鼠再狭窄血管平滑肌细胞及对照组的表达水平,采用SPSS10.0统计软件分析结果。结果雷帕霉素干预后减轻血管狭窄程度(P<0.01)。结论球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖时可伴有细胞凋亡,早期血管平滑肌细胞较高的凋亡率可能影响细胞增殖。
苗立夫[6]2004年在《血管腔内局部应用雷帕霉素纳米粒子防治球囊损伤后冠状动脉再狭窄的实验研究》文中提出经皮冠状动脉腔内血管成形术(Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)及支架置入术是当前治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病最为有效的重要手段之一，但术后6个月内再狭窄的发生率高达30％～50％，是限制其远期临床疗效、增加医疗费用的主要原因。再狭窄的发生机制尚不明确，近年的研究表明再狭窄是局部血管对介入治疗所造成损伤的一种修复反应，是由炎性细胞参与、多种细胞因子和生长因子所介导的局部血管重建和再塑；是一系列基因异常表达所引起的血管结构和功能改变。细胞基质分泌／清除失衡、积聚以及血管中层平滑肌细胞过度迁移、增殖所形成的新生内膜增殖性阻塞是其主要成因。 应用系统给药方法对再狭窄进行防治，常受限于超生理剂量所带来的全身毒副作用和血管内药物分布、代谢低效能。多数药物在离体实验和动物模型中显效，但应用于临床防治再狭窄时效果却不尽如人意。难以在血管局部达到有效的作用浓度，以及药物在局部维持有效作用浓度的时间较短是其重要原因之一。应运而生的局部给药能够将高浓度的治疗剂直接运送至血管成形部位，既能提高给药效率，又能避免系统给药的上述弊端。现有的临床试验证实了局部给药具有良好的安全性和可行性，但临床
雷建军[7]2009年在《雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞迁移及SDF-1a表达的影响》文中研究说明目的:探讨雷帕霉素抗血管内再狭窄作用及其与基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)表达的相关性。方法:①动物实验:20只12周龄SD大鼠行颈总动脉球囊拉伤,建立血管内膜增生的动物模型,随机分为对照组(服用等体积的生理盐水)和雷帕霉素处理组(口服雷帕霉素),4周后处死动物。HE染色观测血管病变,免疫组化检测增生内膜中SDF-1α的表达,小室迁移系统观察SDF-1α对平滑肌细胞迁移的影响,酶联免疫吸附试验检测血清SDF-1α水平。②细胞实验:原代培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),MTT法检测不同浓度的雷帕霉素(0、1、10、100ng/ml)对VSMC增殖的影响,transwell小室法检测不同浓度的雷帕霉素(0、1、10、100ng/ml)对VSMC迁移的影响,RT-PCR和Western blot分别检测不同浓度的雷帕霉素(0、1、10、100ng/ml)对VSMC SDF-1αmRNA和蛋白表达的影响。结果:球囊拉伤明显诱导血管内膜增生,增生内膜中有明显的SDF-1α的表达,雷帕霉素能显着下调增生内膜和血清中SDF-1α的表达,且SDF-1α能浓度依赖性地诱导平滑肌细胞的迁移;MTT法测定结果表明1、10、100ng/ml的雷帕霉素都能显着抑制VSMC增殖(p<0.05或p<0.01);transwell小室法检测结果表明1、10、100ng/ml的雷帕霉素都能显着抑制VSMC迁移(p<0.05或p<0.01),且呈浓度依赖性;RT-PCR和Western blot检测结果表明,1、10、100ng/ml的雷帕霉素都能显着抑制VSMC SDF-1αmRNA和蛋白表达(p<0.05或p<0.01),且浓度依赖性明显。结论:①雷帕霉素能抑制大鼠颈总动脉拉伤引起的内膜增生;②雷帕霉素抑制大鼠颈总动脉拉伤新生内膜和血清中SDF-1α的表达;③雷帕霉素浓度依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的迁移和增殖;④雷帕霉素浓度依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞SDF-1α表达。
李虹[8]2004年在《预防血管介入治疗后再狭窄的实验性研究》文中认为第一部分 雷帕霉素预防再狭窄的实验性研究目的：观察肌肉注射雷帕霉素对血管介入治疗后再狭窄的影响，为其临床应用提供实验依据；同时，探讨雷帕霉素防止再狭窄的可能机制。并且观察其与抗血小板药物--氯吡格雷和他汀类药物—辛伐他汀联合应用的疗效比较。方法：采用雄性新西兰白兔，给予高脂高胆固醇饮食喂养6周后，行右侧髂动脉内膜损伤术复制成再狭窄模型。术后雷帕霉素组给予肌注雷帕霉素4周，联合组除给予肌注雷帕霉素外，并给予口服氯吡格雷和辛伐他汀的干预。雷帕霉素组和联合组又随机分别分为2个亚组：低剂量组和高剂量组。４周后使用免疫组化方法检测血管壁增殖细胞核抗原（PCNA）表达阳性细胞，即增殖细胞；以及核因子κB（NF-κB）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达；用计算机图像分析法观察血管组织形态学的变化，并对免疫组化结果进行定量分析。结果：1.雷帕霉素组与单纯损伤组相比：(1)表示内膜增殖程度的指标如：内膜厚度（IT）、内膜厚度/中膜厚度（IT/MT）、内膜面积（IA）、内膜面积/中膜面积（IA/MA）和管腔面积（LA）均显着减少(P<0.05)，且随注射剂量的增大，上述指标的改变具有显着性差异(P<0.05)；(2) 血管壁增殖细胞PCNA及NF-κB、ICAM-1的表达均显着降低(P<0.05)，且降低程度随剂量的增大而增强(P<0.05)；2.联合组和雷帕霉素组相比：(1)表示内膜增殖程度的指标IT、IT/MT、IA、IA/MA、LA均显着减少(P<0.05)，且随注射剂量的增大,上述指标的改变具有显着性差异(P<0.05)；(2) 血管壁增殖细胞PCNA及NF-κB、ICAM-1的表达均显着降低(P<0.05)，降低程度随剂量的增大而增强(P<0.05)。结论：1.给予高脂高胆固醇饮食6周后形成高胆固醇血症；2.髂动脉内膜损伤术可产生再狭窄样反应；3.雷帕霉素可防止再狭窄的形成，在一定范围内注射剂量与新生内膜增殖程度有相关性；4.联合应用辛伐他汀和氯吡格雷进行干预比单用雷帕霉素效果更加明显。
龙波[9]2004年在《叁氧化二砷对兔髂动脉球囊损伤术后内膜增殖的影响及其机理的研究》文中提出目的:探讨叁氧化二砷预防兔髂动脉球囊损伤术后内膜增殖作用的效果,初步探讨叁氧化二砷预防兔髂动脉球囊损伤术后内膜增殖作用的机制,为以后的进一步研究提供动物实验理论依据。 材料和方法:新西兰大耳白兔36只,随机分为实验组和对照组,每组18只,按取材时间(第7、14和28天),再随机分为3个亚组,每组6只。实验组腹腔注射10%叁氧化二砷2.5mg/kg/d,对照组注射等量生理盐水,3天后行髂动脉球囊扩张术,术后7天、14天和28天分别处死动物取损伤血管做常规HE染色、原位细胞凋亡检测、免疫组织化学染色与计算机图像分析,以及肝脏、肾脏组织的病理学检测。 结果:血管形态学结果显示:与对照组相比,7天、14天和28天实验组血管内膜面积分别减少24%、19%与46%(P均<0.01),中膜面积分别减少12%(P<0.05)、15%(P<0.05)与24%(P<0.01),内膜增殖指数分别减少15%(P<0.01)、8%(P<0.05)与19%(P<0.01)。原位细胞凋亡检测结果提示:实验组内膜凋亡指数于14天时达到高峰,与28天组相比无统计学意义(P>0.05),中膜凋亡指数随时间逐渐增加,于28天达到高峰,14天与28天组间差异无统计学意义(P>0.05);对照组内膜凋亡指数在14天达到高峰,与28天组相比有统计学意义(P<0.05),中膜
毕铭霞[10]2011年在《经外膜缓释雷帕霉素抑制兔移植血管内膜增生的实验研究》文中研究表明目的：建立兔肾下腹主动脉移植血管模型,并经血管外膜给予雷帕霉素,研究移植血管病理学形态改变及α-actin、vWf、PCNA、p27kip1在移植血管中的表达及其与血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的关系,探讨雷帕霉素抑制移植血管再狭窄的作用机制,及经血管外膜给药的可行性。方法：健康雄性新西兰大耳白兔36只,体重2.5-3.0kg,随机分为A、B、C、D、E、F6组,每组6只,分别构建去活性同种异体腹主动脉移植模型及PTFE人造血管腹主动脉移植模型,血管吻合完成后各组给予不同处理。A组：去活性同种异体腹主动脉移植组,移植血管不给予任何处理；B组：去活性同种异体腹主动脉移植,在移植血管外膜及吻合口周围涂抹配制好的20%pluronic F-127多聚凝胶0.5ml；C组：去活性同种异体腹主动脉移植,在移植血管外膜及吻合口周围涂抹携带雷帕霉素0.5mg的pluronic F-127多聚凝胶0.5ml；D组：PTFE人造血管腹主动脉移植组,移植血管不给予任何处理；E组：PTFE人造血管腹主动脉移植,在移植血管外膜及吻合口周围涂抹配制好的20%pluronic F-127多聚凝胶0.5ml；F组：PTFE人造血管腹主动脉移植,在移植血管外膜及吻合口周围涂抹携带雷帕霉素0.5mg的pluronic F-127多聚凝胶0.5ml。术后4周获取移植血管,组织形态学方法观察移植血管内膜增生情况,计算机图像分析系统测量移植血管内膜及中膜厚度,并计算内膜增生程度(内膜／中膜),免疫组化SP法检测移植血管α-actin、vWf、PCNA和p27kipl的表达。采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示。结果：1.成功构建去活性同种异体腹主动脉移植模型及PTFE人造血管腹主动脉移植模型。2.术后1月,组织形态学观察及计算机图像分析发现,A组、B组较C组内膜增生明显,D组、E组较F组内膜增生明显,差异有显着性(P<0.05)。3.弹力纤维染色(Weigert氏间苯二酚品红染色法)：去活性移植血管术后4周仍可见完整的弹力纤维染色,移植血管弹力纤维及其它各层结构保存完整。4α-actin免疫组化观察结果：增生的血管内膜均可见α-actin阳性表达,类似于血管平滑肌α-actin阳性表达,证实增生的血管内膜于最表层细胞层下表达平滑肌活性。5.vWf免疫组化观察结果：移植后血管内膜不同程度增生,最表层细胞呈单层排列,可见vWf阳性着色,证实增生的内膜最表层为单层排列的血管内皮细胞。6. PCNA、p27kip1免疫组化观察结果：均为胞核着色,阳性细胞呈棕黄色。各组移植血管增生的内膜均可见不同程度的阳性表达。7.α-actin和PCNA的表达,C组与F组分别较A、B组与D、E组明显降低,差异有显着性(P<0.05)。p27kipl的表达,C组与F组分别较A、B组与D、E组明显增多,差异有显着性(P<0.05)。A组与B组、D组与E组之间各组数据比较无显着差异性(P>0.05)。结论：1.经甲醛处理的去活性同种异体血管可有效保存血管的组织结构,并有效去除血管的抗原性。2.血管内膜增生是造成血管移植术后再狭窄的主要因素。增生的血管内膜主要成分表达平滑肌活性,而抑制内膜的过度增生即抑制平滑肌的过度增殖是保持血管长期通畅的最关键因素。3.采用pluronic F-127多聚凝胶携带雷帕霉素涂抹移植血管外膜可有效抑制移植血管平滑肌细胞增殖。4.雷帕霉素抑制移植血管再狭窄的机制与其上调移植血管组织中p27kipl的表达、细胞增殖周期受抑有关。5.经移植血管外膜给药的途径是可行和有效的。
参考文献：
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[2]. 尼可地尔抑制大鼠颈动脉球囊拉伤后内膜增生及促进内皮化的研究[D]. 张颖倩. 中国人民解放军医学院. 2016
[3]. 阿托伐他汀及雷帕霉素对HO-1表达和血管平滑肌细胞增殖的影响研究[D]. 蒋路平. 中南大学. 2007
[4]. 雷帕霉素抑制内皮细胞增殖和迁移：PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路的作用[D]. 刘海涛. 第四军医大学. 2010
[5]. 大鼠血管球囊损伤后血管平滑肌细胞的增殖与凋亡[J]. 石永英, 张元春, 许端敏, 袁文金, 陈畅. 广东医学. 2007
[6]. 血管腔内局部应用雷帕霉素纳米粒子防治球囊损伤后冠状动脉再狭窄的实验研究[D]. 苗立夫. 中国协和医科大学. 2004
[7]. 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞迁移及SDF-1a表达的影响[D]. 雷建军. 南华大学. 2009
[8]. 预防血管介入治疗后再狭窄的实验性研究[D]. 李虹. 山西医科大学. 2004
[9]. 叁氧化二砷对兔髂动脉球囊损伤术后内膜增殖的影响及其机理的研究[D]. 龙波. 四川大学. 2004
[10]. 经外膜缓释雷帕霉素抑制兔移植血管内膜增生的实验研究[D]. 毕铭霞. 山东大学. 2011
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