近共振增强的高分辨受激拉曼显微成像及应用研究

近共振增强的高分辨受激拉曼显微成像及应用研究

论文摘要

无标记光学显微成像技术已成为生物医学研究的重要组成部分。然而,由于光学衍射极限的限制,能应用于细胞或组织的超高分辨成像技术仍面临巨大挑战。基于荧光标记的显微成像技术可以通过对外源标记分子的操控,间接实现包括蛋白质、核酸在内的多种生物分子的特异性超分辨成像。但是荧光标记分子通常较大,会干扰对细胞性质的研究。当前,能够直接探测固有生物分子,产生图像对比度的无标记高分辨显微成像技术有了飞速的发展。例如自发拉曼光谱成像技术已经开始广泛应用于生物系统的生化分析和成像,但是自发拉曼的采集速度相对较慢,分辨率以及灵敏度都有待进一步提高。随着技术的发展,受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering,SRS)显微成像技术逐渐成熟,该技术对生物体的成像速度更快,灵敏度更高。然而,SRS作为一种无标记分子振动成像技术,其空间分辨率一直被限制在300纳米左右。因此,能够突破180纳米传统空间分辨极限的无标记超高分辨光学成像一直是成像领域开拓的重要方向。本文将探讨横向分辨率接近130纳米的近共振增强无标记受激拉曼散射显微成像技术,其高分辨率图像的对比度直接来源于低浓度的内源性生物分子。通过双波长倍频技术,本文首次实现了基于可见光波段的SRS成像系统。相比于近红外SRS,可见光SRS过程中,分子被泵浦光所激发到的虚态更加接近上一级电子激发态,因此,该过程中的拉曼散射截面更大,成像灵敏度相比传统SRS显微镜提高了约23倍。此外,我们通过在光路中引入一根0.3米长的单模保偏光纤,实现了基于光谱聚焦技术的超光谱SRS显微成像,使小范围内的化学分析成为可能。不仅如此,光纤的引入还保证了泵浦光和斯托克斯光具有绝对的共线性,稳定性以及较好的高斯光模式输出,为高分辨成像提供了保证。最后,基于空间分辨率和成像灵敏度的提高,本文展示了超精细的单细胞三维成像以及大范围未经染色处理的鼠脑组织切片的高分辨成像结果。除此之外,我们还利用高分辨超光谱SRS显微镜观察到了鞘磷脂在脑组织中的分布情况。本文的研究进一步推进了SRS成像技术的发展,为分辨率~130纳米的无标记高分辨生物医学成像提供了新的平台。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 选题背景及意义
  •   1.2 拉曼成像原理
  •     1.2.1 传统拉曼散射成像
  •     1.2.2 受激拉曼散射成像
  •   1.3 受激拉曼显微成像的研究进展
  •     1.3.1 早期受激拉曼散射成像
  •     1.3.2 受激拉曼光谱成像
  •   1.4 本文的研究内容
  • 2 高分辨近共振显微镜原理
  •   2.1 高分辨显微成像
  •     2.1.1 分辨率与分辨能力
  •     2.1.2 超分辨显微镜研究进展
  •     2.1.3 高分辨SRS显微镜设计思路
  •   2.2 近共振拉曼显微成像
  •     2.2.1 共振拉曼显微成像
  •     2.2.2 近共振SRS原理
  •   2.3 本章小结
  • 3 基于可见光的受激拉曼显微镜设计
  •   3.1 基于BBO晶体的倍频系统
  •   3.2 基于光纤的光谱聚焦技术
  •   3.3 基于科勒原理的照明模块
  •   3.4 近共振高分辨SRS显微成像系统装置
  •   3.5 近共振高分辨SRS显微镜测试
  •   3.6 本章小结
  • 4 高分辨的高光谱受激拉曼显微镜在生物中的应用
  •   4.1 对多种细胞生存状态的研究
  •   4.2 脑组织中的无标记精细成像
  •   4.3 脑组织中鞘磷脂分布的研究
  •   4.4 细胞活性测试
  •   4.5 成像深度测试
  •   4.6 实验样本制备
  •     4.6.1 简单样本制备
  •     4.6.2 细胞培养及样本制备
  •     4.6.3 小鼠心脏灌流实验及脑组织样本制备
  •   4.7 本章小结
  • 5 总结与展望
  • 参考文献
  • 在校期间发表的论文、科研成果
  • 致谢
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 毕亚丽

    导师: 张国平,王平

    关键词: 受激拉曼散射,高分辨,近共振,光谱聚焦技术

    来源: 华中师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技,信息科技

    专业: 生物学,生物医学工程,计算机软件及计算机应用

    单位: 华中师范大学

    分类号: R318;TP391.41

    总页数: 63

    文件大小: 6432K

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