A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

论文摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的急性高度接触性动物传染病,主要感染猪、牛与羊等偶蹄动物,造成了严重的经济损失和社会影响。防控FMD仍然是每年我国动物防疫工作的首要任务。目前,我国对FMD主要采取疫苗免疫为主的综合性防控措施,其中灭活疫苗应用最为广泛,但灭活疫苗在生产与使用过程中存在病毒逃逸的安全风险,需要开发新型疫苗来应对未来FMD的防控问题。其中表位疫苗是最具有潜力的FMD新型疫苗之一。2013年A型FMDV SEA/97-G2亚型毒株传入我国后,造成了巨大的经济损失,为了进一步探明当前A型FMDV衣壳蛋白的主要抗原表位区及其免疫原性,原核表达了A型FMDV衣壳蛋白的主要抗原表位区并进行了免疫效果评价,以期为A型FMDV表位疫苗的研究提供线索。根据已鉴定的FMDV A型毒株的主要抗原位点,结合基因序列比对结果,选择了当前A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区:包括A/QH/CHA/2013的VP2 7081位、118140位,VP1G-H环131157位、C末端188212位;A/WH/CHA/09 FMDV VP1 4348位,VP3 5572位;以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,用于构建免疫原分子。通过柔性Linker将各表位基因串联,在串联基因的3’端融合了6个His标签,构建了含多个抗原表位基因的原核表达载体pET28a-ANX2和pET28a-ANX3,其中pET28a-ANX2采用了氨基酸反向串联的方式;通过SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定目的蛋白ANX2和ANX3的表达。将ANX2和ANX3表位蛋白大量表达和纯化后,与CpG-ODNs和ISA201乳化后免疫小鼠和猪,对目的蛋白诱导宿主体液免疫和细胞免疫应答水平进行了鉴定,并在免疫后28日用流行毒株对免疫猪进行了攻毒试验,评价疫苗的保护效力。研究结果表明,表位重组蛋白ANX2和ANX3表达形成包涵体,蛋白分子质量分别约为41kDa和39 kDa,Western blot鉴定均能与A型FMDV阳性血清特异性反应;免疫小鼠和猪后能产生抗A型FMDV抗体,细胞因子IFN-γ和IL-4也有明显升高,攻毒后对猪有一定的保护作用;ANX2的免疫原性略高于ANX3,证明氨基酸反向串联方式的串联更有利于重组蛋白展示抗原表位,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了数据。

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摘要

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英文缩略表

第一章文献综述

1.1 FMDV基因组结构

1.1.1 FMDV5'UTR和3'UTR

1.1.2 FMDV结构蛋白

1.1.3 FMDV非结构蛋白

1.2 流行病学

1.3 FMD表位疫苗研究进展

1.3.1 FMDV的抗原表位

1.3.1.1 O型FMDV的抗原位点

1.3.1.2 A型 FMDV的抗原位点

1.3.1.3 C型 FMDV的抗原位点

1.3.1.4 Asia1型FMDV的抗原位点

1.3.2 表位疫苗的设计与优化

1.3.2.1 加入辅助T细胞表位

1.3.2.2 加入间隔序列（Linker）

1.3.2.3 加入佐剂

1.3.3 表位疫苗的应用

1.4 本实验的研究目的及意义

第二章 FMDV重组质粒PET-28a-ANX2、PET-28a-ANX3 的构建和鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 质粒载体和细胞

2.1.2 主要材料和试剂

2.1.3 主要溶液和培养基的配制

2.1.4 主要的仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 设计和合成多表位基因

2.2.2 质粒的转化及提取

2.2.3 表达载体的构建

2.2.4 重组质粒pET-28a-ANX2、pET-28a-ANX3 的酶切鉴定

2.3 结果

2.3.1 表位基因的序列比对

2.3.2 设计和合成多表位基因

2.3.3 重组质粒pET-28a-ANX2、pET-28a-ANX3 的酶切鉴定

2.4 讨论

第三章重组多表位基因在原核中的表达

3.1 实验材料

3.1.1 主要材料和试剂

3.1.2 主要溶液和培养基的配制

3.1.3 主要的仪器设备

3.2 试验方法

3.2.1 重组载体的的诱导表达

3.2.2 Western Blot鉴定

3.2.3 大量包涵体制备

3.2.4 蛋白质纯化

3.2.5 蛋白质的复性和浓缩

3.3 实验结果

3.3.1 多表位蛋白表达的SDS-PAGE检测

3.3.2 多表位蛋白的纯化结果

3.3.3 多表位蛋白表达的Western blot的检测

3.4 讨论

第四章表位蛋白ANX2和ANX3 的免疫效果评估

4.1 实验材料

4.1.1 主要材料和试剂

4.1.2 主要溶液和培养基的配制

4.1.3 主要的仪器设备

4.2 试验方法

4.2.1 动物免疫实验

4.2.2 ELISA检测

4.2.3 小鼠和猪免疫血清中和试验

4.2.4 小鼠淋巴细胞的制备和细胞因子的检测

4.2.5 猪攻毒实验

4.2.6 数据分析

4.3 实验结果

4.3.1 多表位蛋白ANX2和ANX3 免疫血清中抗FMDV抗体的ELISA检测

4.3.2 小鼠和猪免疫血清中和试验

4.3.3 多表位蛋白ANX2和ANX3 小鼠的淋巴细胞增值实验细胞因子检测

4.3.4 多表位蛋白ANX2和ANX3 免疫猪后血清中的细胞因子检测

4.3.5 多表位蛋白ANX2和ANX3 免疫猪后的攻毒保护结果

4.4 讨论

第五章全文结论

参考文献

致谢

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汪肖肖

导师: 刘在新

关键词: 型口蹄疫病毒,表位疫苗,体液免疫,细胞免疫

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划项目,院创新团队

分类号: S852.4

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