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LSD1在DNA损伤修复通路中的作用

2020-12-08阅读(266)

LSD1在DNA损伤修复通路中的作用

论文摘要

组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传调控方式。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（lysine specific demethylase 1,LSD1）是一种核内黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的单胺氧化酶,初步的研究发现LSD1与基因转录密切相关,它可以特异性去除组蛋白3赖氨酸4（H3K4）的单甲基化和二甲基化以及组蛋白3赖氨酸9（H3K9）的单甲基化和二甲基化。研究表明,LSD1在广泛的生理过程中发挥着重要作用,包括细胞增殖、脂肪生成、DNA损伤修复、精子形成和胚胎发育等。近些年的研究还发现LSD1在DNA损伤修复中发挥着重要的作用,LSD1参与了DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）,其在S/G2晚期在损伤部位促进γH2AX泛素化,LSD1促进了DNA损伤部位的H3K4me2去甲基化,LSD1与RNF168直接相互作用,其向DNA损伤位点的募集依赖于RNF168。此外酪蛋白激酶2（CK2）于体外和体内在S131和S137处磷酸化LSD1,而野生型p53诱导的磷酸酶1（WIP1）在体外和体内使S131和S137处的LSD1去磷酸化,CK2介导的LSD1磷酸化增加其与RNF168的结合,RNF168和53BP1之间的相互作用,以及依赖RNF168的53BP1 K63处的多泛素化,并且促进LSD1和53BP1直接募集到DNA损伤位点。本研究中,我们通过激光诱导DNA损伤和免疫荧光染色的方法确定LSD1可以参与到DNA损伤应答中。通过免疫共沉淀的方法发现LSD1可以与E3泛素连接酶RNF20、RNF40相互作用的蛋白,而先前的报道中并没有涉及三种蛋白存在于共同的信号通路之中。为了确定LSD1与RNF20、RNF40相互作用的关键区域,我们构建了SFB-LSD1、PHAP-RNF20、PHAP-RNF40野生型及一系列缺失突变体质粒,通过瞬时转染293T细胞以及免疫共沉淀明确了LSD1的近TOWER结构域（a.a.428-527）是LSD1与RNF20、RNF40相互作用的关键区域,RNF20近Coiled-coil区域（a.a.508-703）和RNF40近Coiled-coil区域（a.a.558-760）是RNF20、RNF40与LSD1相互作用的关键区域。为了进一步研究LSD1/RNF20/RNF40复合体在DNA损伤修复通路中的作用,我们通过CRISPR/Cas9的技术,成功构建了HCT116 RNF20-/-细胞株与HCT116 RNF40-/-细胞株,这为进一步探索在缺失RNF20或RNF40的情况下LSD1功能的变化打下基础。通过siRNA分别敲低LSD1和RNF20,发现敲低之后并不会影响相互的表达,但敲低LSD1 H3K4单甲基化、二甲基化、三甲基化以及H2BK120ub1等是否会产生影响需要更多的研究来证明。综上所述,我们初步验证了LSD1、RNF20、RNF40相互作用的机制,为深入研究三者如何协同参与DNA损伤修复及各自发挥的功能打下了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 研究背景与意义
  •   1.2 国内外研究进展
  •     1.2.1 DNA损伤应答简介
  •     1.2.2 LSD1的结构
  •     1.2.3 LSD1的功能
  •     1.2.4 LSD1在DNA损伤应答的研究
  •     1.2.5 LSD1在DNA损伤应答中的其他研究
  •     1.2.6 RNF20/RNF40在DNA损伤应答中的研究
  •     1.2.7 LSD1与肿瘤的关系
  • 第2章 LSD1在细胞受到DNA损伤后会募集到损伤位点
  •   2.1 前言
  •   2.2 材料与仪器
  •     2.2.1 实验材料与试剂
  •     2.2.2 实验耗材与仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 细胞培养
  •     2.3.2 激光诱导活细胞DNA损伤
  •     2.3.3 免疫荧光染色
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 LSD1会募集到激光诱导的损伤位点
  •   2.5 本章小结
  • 第3章 LSD1与RNF20/RNF40相互作用
  •   3.1 前言
  •   3.2 材料与仪器
  •     3.2.1 实验材料与试剂
  •     3.2.2 实验耗材与仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 构建SFB-LSD1质粒
  •     3.3.2 CoIP验证LSD1与RNF20/RNF40内源性的相互作用
  •     3.3.3 CoIP验证LSD1与RNF20/RNF40外源性的相互作用
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 构建SFB-LSD1质粒
  •     3.4.2 LSD1与RNF20/RNF40内源性相互作用
  •     3.4.3 LSD1与RNF20/RNF40外源性相互作用
  •   3.5 本章小结
  • 第4章 验证LSD1与RNF20/RNF40相互作用关键区域
  •   4.1 前言
  •   4.2 实验材料与仪器
  •     4.2.1 实验材料与试剂
  •     4.2.2 实验耗材与仪器
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 SFB-LSD1、PHAP-RNF20、PHAP-RNF40突变体质粒的构建
  •     4.3.2 CoIP验证LSD1与RNF20/RNF40 相互作用关键区域
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 构建SFB-LSD1、PHAP-RNF20、PHAP-RNF40突变体质粒.
  •     4.4.2 LSD1 缺失D5 片段后将不能与内源性的RNF20、RNF40相互作用
  •     4.4.3 RNF20 缺失D5、D6片段后将不能与内源性的LSD1相互作用
  •     4.4.4 RNF40 缺失D9、D10片段后不能与内源性的LSD1相互作用
  •   4.5 本章小结
  • 第5章 敲低LSD1、RNF20互不影响蛋白的表达
  •   5.1 前言
  •   5.2 实验材料与仪器
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 siRNA设计
  •     5.3.2 siRNA敲低目的基因
  •     5.3.3 提取组蛋白
  •     5.3.4 Western Blot检测
  •   5.4 实验结果
  •     5.4.1 siLSD1和siRNF20可以敲低目的蛋白的表达量
  •     5.4.2 siLSD1和siRNF20敲低后不会互相影响
  •     5.4.3 组蛋白的变化
  •   5.5 本章小结
  • 第6章 通过CRISPR/Cas 构建基因敲除细胞株
  •   6.1 前言
  •   6.2 实验材料与仪器
  •   6.3 实验方法
  •     6.3.1 构建PX459-RNF20、PX459-RNF40质粒
  •     6.3.2 构建敲除细胞株
  •   6.4 实验结果
  • -/-细胞株与HCT116 RNF40-/-细胞株'>    6.4.1 成功构建HCT116 RNF20-/-细胞株与HCT116 RNF40-/-细胞株
  •   6.5 本章小结
  • 第7章 讨论与展望
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 单飞飞

    导师: 张峰

    关键词: 损伤应答,去甲基化,蛋白相互作用

    来源: 上海师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 上海师范大学

    分类号: Q754

    总页数: 59

    文件大小: 2905K

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