导读:本文包含了保守序列论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:关节,保守,蛋白,下颌,杆菌,紊乱,突变。
保守序列论文文献综述
陈秋旭[1]（2019）在《LINC00628通过其保守序列与VEGFA启动子的相互作用抑制肝癌细胞迁移和侵袭》一文中研究指出目的探索lncRNA-LINC00628在HCC发生发展中的作用及相关机制。方法1.RT-qPCR检测LINC00628在HCC患者癌与癌旁组织中的表达是否有差异,并进一步检测正常肝细胞系和多种肝癌细胞系中LINC00628的表达水平。2.构建LINC00628过表达及干扰载体,并利用克隆形成、MTS、Transwell小室实验和划痕实验等体外实验检测LINC00628对HCC细胞生物学功能的影响。3.利用RT-qPCR和Western blot技术寻找LINC00628的靶基因,并构建靶基因过表达载体,采用划痕实验和Transwell小室实验检测靶基因对HCC迁移和侵袭功能的影响。4.构建不同长度的VEGFA启动子片段载体,并利用双荧光素酶报告基因实验检测LINC00628对VEGFA启动子的影响。5.通过生物信息学网站分析LINC00628的保守序列,并构建LINC00628保守序列过表达载体,再采用Transwell实验及划痕实验检测该保守序列对HCC细胞迁移侵袭功能的影响。6.利用Western blot检测LINC00628保守序列对VEGFA蛋白水平的影响,双荧光素酶报告基因实验检测该保守序列对VEGFA启动子的影响。7.建立LINC00628过表达的裸鼠肝转移瘤模型,通过HE染色、RT-qPCR、免疫组化染色及Western blot实验在体内验证LINC00628对肝癌细胞转移和相关分子的影响。结果1.LINC00628在临床HCC癌组织标本和肝癌细胞系中呈低表达。2.LINC00628能抑制HCC细胞的迁移侵袭。3.LINC00628能够下调VEGFA的表达。4.过表达VEGFA促进HCC细胞迁移和侵袭。5.LINC00628能够抑制VEGFA的启动子活性。6.LINC00628的保守序列能够抑制HCC细胞的迁移侵袭能力。7.LINC00628的保守序列能够抑制VEGFA的表达,过表达保守序列同样能抑制VEGFA启动子活性。8.过表达LINC00628能促进裸鼠体内肝癌细胞的转移并降低VEGFA的表达。结论LINC00628通过其保守序列与VEGFA启动子的相互作用,从而发挥抑制肝癌细胞迁移和侵袭的作用。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2019-05-01）
赵娇娇[2]（2019）在《近红外荧光蛋白PAiRFP1中PHY域保守序列PRXSF氨基酸功能研究》一文中研究指出PAiRFP1(photoactivatable near-infrared fluorescent protein 1)是在根癌农杆菌细菌光敏色素Agp2的基础上,通过定向进化的手段筛选得到的光激活近红外荧光蛋白。这类光激活近红外荧光蛋白应用到肿瘤的活体成像中,尤其是早期成像时比永久性荧光蛋白更具有优势,这是因为通过光激活前后的荧光强度差减可以提高成像信噪比,实现弱信号的更精确定位。这种光激活行为与PAiRFP1中含有PHY区域密切相关。一方面PHY区域是实现吸收远红光的Pfr态(far red abosorbing state)?吸收红光的Pr态(red absorbing state)光转换、光激活必须的;另一方面,我们希望提高Pr的荧光量子产率,就需要抑制Pr?Pfr的暗恢复(热转换过程),这两个看似矛盾的方面是如何受氨基酸调控的呢?虽然PAiRFP1的晶体结构尚未解析,但氨基酸序列比对显示在PHY区域中PRXSF序列高度保守,同源建模结果显示PRXSF位于BV(biliverdin)结合口袋附近,F187,F192,Y251在BV与PRXSF作用的氢键疏水网络中可能发挥了作用。针对上述位点,本论文通过定点突变,结合光谱学手段研究了上述氨基酸的功能,发现(1)在PRXSF保守区域,只有P459,S462,F463对于发挥光激活是必须的,而当R460和K461突变后,光激活行为仍然保留。通过在460和461位引入不同性质的氨基酸残基,可以进一步改善光激活前后的荧光对照。本论文中构建的R460A、R460S、K461A、K461Q这四个突变体,它们的摩尔消光系数、荧光量子产率、分子亮度、光激活前后的荧光增加倍数等都比PAiRFP1有所提高。(2)BV结合口袋附近起关键作用的F187、F192和Y251突变也导致光激活行为削弱甚至消失。在此基础上,我们通过检测BV组装过程、暗恢复动力学、盐酸胍诱导的去折迭、以及蛋白质内源荧光、FTIR等初步探讨了PAiRFP1光激活行为的结构依据,相关结果为后续深入研究奠定了基础。(本文来源于《电子科技大学》期刊2019-04-01）
李燕,杨致荣,高建华[3]（2018）在《谷子PT2基因保守序列的克隆与分析》一文中研究指出谷子是重要的杂粮作物之一,具有很高的营养价值,因此,对谷子的研究和推广成为当前研究的热点。其中,培育高产优质的谷子新品种是谷子研究的重要方向。从改善谷子产量性状的角度出发,对一个与谷子籽粒多种性状相关的基因PT2(Panicle Traits 2)进行了分析。结果表明,该基因在水稻中能够调控籽粒形状、大小和落粒性等性状。根据水稻PT2基因编码的氨基酸序列(Os GRF4),通过生物信息学的方法,在谷子基因组中筛选出潜在的对应基因(Seita.1G287100)。然后预测了该基因的启动子潜在元件,结果发现,其启动子存在多种环境响应元件,暗示该基因参与多种代谢的调控。m RNA检测结果也显示,该基因在谷子苗和穗均有表达。最后,分析了43种谷子品系和3种狗尾草资源中PT2基因的保守性,结果发现,该基因在谷子和狗尾草中的序列基本一致,只有一个导致氨基酸改变(T190A)的SNP。通过生物信息学的方法,确定了谷子和狗尾草的PT2基因。但是谷子和狗尾草中的PT2基因及其启动子的高度保守性,暗示2种植物籽粒相关性状的差异由其他基因决定。(本文来源于《山西农业科学》期刊2018年06期）
郐子昱[4]（2018）在《基于流感病毒H3亚型保守序列重组Ferritin免疫原性分析及保护活性的初步研究》一文中研究指出流行性感冒是由流感病毒引起的传染病,其特点是流行突然、迅速蔓延、波及面广且具有一定的季节性,也被成为季节性流感。流感病毒分为A、B、C叁型,甲型和乙型流行范围最广,其中甲型流感病毒(IAV)分类根据其包膜糖蛋白红细胞凝集素(H1~H18)与神经氨酸酶(N1~N11)的差异。WHO报告显示每年流感会感染世界5-10%人口,发病人口在300-500万人,导致二十万人至五十万人死亡。H3亚型流感病毒是造成季节性流感的主要亚型之一,存在着成为大流行毒株或为大流行毒株提供基因的可能性,是流感防治的重点。其中预防流感的最有效的措施是接种流感疫苗。流感病毒HA蛋白具有HA1球状头部区结构域与HA2颈部区结构域,其中HA1头部球状区可以与宿主表面受体唾液酸受体结合,HA2颈部区可以在低pH(5-6)条件作用下,发生构象变化,拉近与细胞膜距离,促使细胞膜与病毒之间膜融合。HA蛋白作为流感病毒功能蛋白成为研究的热点。HA蛋白HA1头部区的氨基酸序列高频突变性以及糖基化修饰的保护作用是疫苗设计的难点。其HA2颈部区结构相对保守,但是由于暴露时间短,免疫原性差,无法诱导较强免疫反应,也是疫苗设计的难点之一。构建具有HA叁聚体结构的重组蛋白,模拟流感病毒感染时的天然构像一直是研究的热点。同时随着针对HA2广谱中和抗体的发现,利用HA2全长或HA2保守区表位作为免疫原诱导广谱中和抗体的方式得了关注。基于此本实验组通过保守序列分析得到了一段保守的HA2表位:DLWSYNAELLVALENQ。由于该表位分子量小,将其连接于诺如病毒P颗粒免疫小鼠,得到了具有中和活性的抗体,该免疫原可以诱导针对HA2颈部区抗体,阻止HA2结构变化,抑制膜融合。由于诺如病毒在人体中可能存在预存免疫,同时为了进一步验证该表位可靠性,本课选择新的载体连接HA2表位进行实验。研究表明Ferritin蛋白可以自组装形成直径为12nm的24聚体,其N段可以插入外源基因,在插入HA蛋白后可以使蛋白形成叁聚体构象。但是Ferriitn对于多肽的递呈能力尚不清楚。基于上述分析,我们期望获得保守的HA,HA2,HA2(90-105)蛋白序列连接Ferritin载体,形成有叁聚体构象的免疫原。同时验证HA2(90-105)表位的可靠性以及Ferritin载体对短肽的递呈能力。我们分析了1920-2017年的H3亚型的HA蛋白序列,得到了保守的HA全长,HA2全长序列。将叁段序列用SSG linker分别连接Ferritin蛋白,便于形成叁聚体构象以及暴露表位与Ferritin外。为研究糖基化对HA蛋白的影响,我们采用哺乳细胞与E.coil两种表达体系进行表达。其中HA全长(762aa),HA2全长(412aa),在两种表达体系中,均无蛋白表达,通过序列分析认为可能表达体系选用错误。HA2(90-105)在哺乳动物细胞表达体系中有少量表达,在E.coli表达体系中可以大量表达,经过蛋白纯化,粒径分析,电镜观察进行结构表征,得到具有12nm直径的球形结构免疫原进行免疫,期望可以获得针对流感病毒HA2保守序列的具有广谱中和活性抗体。我们使用弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂免疫,以不同剂量的重组蛋白,免疫BALB/c雌鼠,间隔两周,免疫四次。以PBS,Ferritin蛋白作为阴性对照,H3N2病毒作为阳性对照。检测免后血清与HA2表位特异性抗体水平,弗氏佐剂免疫组针对表位特异性抗体效价约为10~4,不同剂量产生抗体效价相似,说明重组蛋白具有一定免疫原性且与剂量无关。铝佐剂组效价随剂量升高而减少,且低于弗氏佐剂组,病毒对照组未产生特异性抗体。免后血清对H3N2 HA蛋白具有一定的结合能力,弗氏佐剂组高于铝佐剂组。弗氏佐剂组免后血清与H3N2病毒抗体效价约为10~5,铝佐剂效价低于弗氏佐剂组。四次免疫后,使用H3N2病毒进行加强免疫,弗氏佐剂组HA2表位特异性抗体水平明显升高,抗体效价升高约为10~3倍。铝佐剂组抗体水平虽有升高,但是低于弗氏佐剂组。结果说明,弗氏佐剂可以更好的增强重组蛋白免疫原性。由于HA2(90-105)表位处于HA2颈部结构域,所诱导抗体无法结合HA1头部区,所以免疫血清理论上不会出现血凝抑制现象,实验结果一致。抗体分型实验发现,免疫血清IgG1,IgG2a,IgG2b均有显着提升,说明重组蛋白主要诱导是体液免疫,但是IgM水平没有明显升高,体液免疫水平并不理想。体外微中和实验结果表明,弗氏佐剂组免疫后血清与相比,免疫前血清对H3亚型中和活力明显提高,弗氏佐剂100μg组ID 50为863.7,比免前血清ID50高6.16倍,具有较好的中和活性。氢氧化铝佐剂100μg组比免前血清ID50仅高1.21倍。结果显示,弗氏佐剂免疫小鼠可以获得具有中和能力的血清,氢氧化铝佐剂不能诱导小鼠产生中和抗体。结合Elisa实验结果,氢氧化铝佐剂无法有效地增强重组蛋白免疫原性,导致血清中和活力中和较弱。小鼠免疫重组蛋白后,采用H3N2病毒进行攻毒。每24h测量小鼠体重。PBS组体重下降38%,Ferritin组下降33%,弗氏佐剂组体重下降不足5%,铝佐剂组体重约10%-20%。说明免疫重组蛋白对小鼠具有一定保护能力。综上,以Ferritin为载体的HA2(90-015)表位重组免疫原对H3N2具有一定的中和能力。HA2(90-105)表位是潜在的广谱中和疫苗候选表位。Ferritin对于HA2(90-105)的递呈较弱,其递呈表位抗原的能力还有待进一步研究。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
邓力,张清彬,张颖,何霞[5]（2018）在《保守序列治疗方法治疗颞下颌关节急性不可复性关节盘前移位的临床研究》一文中研究指出颞下颌关节盘不可复性前移位是指患者在张口位及闭口位时关节盘均位于髁状突横嵴前方。临床表现为张口受限和疼痛。根据病程可分为急性和慢性。急性不可复性关节盘前移位大部分都是单纯关节盘前移位,很少伴有器质性改变。因此及时治疗急性颞下颌关节盘不可复性前移位,恢复正常的盘-髁关系,避免慢性化发展十分重要。急性不可复性盘前移位主要采取保守治疗的方法,但采取单纯的手法复位、再定位咬合板或其他保守(本文来源于《实用医学杂志》期刊2018年03期）
张颖,张清彬,刘亚蕊,邓力,何霞[6]（2017）在《保守序列方法治疗颞下颌关节不可复性盘前移位的临床研究》一文中研究指出目的:探讨保守序列方法(关节上腔单针灌洗+透明质酸钠凝胶注射+理疗+手法复位+口腔操)治疗颞下颌关节不可复性盘前移位的临床效果。方法:选取2013年4月~2014年4月在我院颞下颌关节科治疗的颞下颌关节不可复性盘前移位患者300例作为研究对象,其中,男性110例,女性190例,年龄16~85岁。将患者分为两组进行治疗,第一组200名,采用保守序列治疗方法即关节上腔单针灌洗+透明质酸钠凝胶注射+理疗+手法复位+口腔操,第二组100名,采用单纯透明质酸钠凝胶关节上腔注射法。利用MMO(最大张口度)及VAS(视觉类比量表)评价治疗前后患者张口度及颞下颌关节疼痛值的变化。结果:第一组总有效率95.5%(191/200),治疗前MMO 22.90±3.18、VAS 5.81±0.32;治疗后3个月MMO 37.05±4.43、VAS 1.29±0.19;治疗后6个月MMO 36.29±4.08、VAS 1.37±0.22;治疗后12个月MMO 35.76±3.87、VAS 1.52±0.28。第二组总有效率78%(78/100),治疗前MMO 23.12±4.02、VAS 6.11±0.67;治疗后3个月MMO 36.11±4.02、VAS 1.89±0.21;治疗后6个月MMO 35.49±3.78、VAS 2.21±0.32;治疗后12个月MMO 31.53±4.87、VAS 3.88±0.51。经统计学处理,两组逐一比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:保守序列治疗方法对治疗颞下颌关节不可复性盘前移位无论近期还是远期都有良好的治疗效果。(本文来源于《2017东亚国际口腔修复会议论文集》期刊2017-10-19）
张颖,张清彬,刘亚蕊,邓力,何霞[7]（2016）在《保守序列方法治疗颞下颌关节不可复性盘前移位的临床研究》一文中研究指出目的:观察保守序列方法治疗颞下颌关节不可复性盘前移位的临床效果。方法:纳入颞下颌关节不可复性盘前移位患者300例,其中,男性110例,女性190例,年龄16~85岁。第1组200名,采用保守序列治疗方法,即关节上腔单针灌洗+透明质酸钠凝胶注射+理疗+手法复位+口腔操,第2组100名,采用单纯透明质酸钠凝胶关节上腔注射法。利用MMO(最大张口度,mm)及VAS(视觉类比量表)评价治疗前后患者张口度及颞下颌关节疼痛值的变化。结果:第1组总有效率95.5%(191/200),治疗前MMO为(22.90±3.18)、VAS为(5.81±0.32);治疗后3个月MMO为(37.05±4.43)、VAS为(1.29±0.19);治疗后6个月MMO为(36.29±4.08)、VAS为(1.37±0.22);治疗后12个月MMO为(35.76±3.87)、VAS为(1.52±0.28)。第2组总有效率78%(78/100),治疗前MMO为(23.12±4.02)、VAS为(6.11±0.67);治疗后3个月MMO为(36.11±4.02)、VAS为(1.89±0.21);治疗后6个月MMO为(35.49±3.78)、VAS为(2.21±0.32);治疗后12个月MMO为(31.53±4.87)、VAS为(3.88±0.51)。2组逐项比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:保守序列治疗方法对治疗颞下颌关节不可复性盘前移位无论近期还是远期都有良好的治疗效果。(本文来源于《实用口腔医学杂志》期刊2016年05期）
杨沙[8]（2016）在《非B细胞来源Igκ保守序列特异性抗体应用的初步研究与ECDI交联的人脾淋巴细胞诱导供者特异性耐受实验体系的初步建立》一文中研究指出传统免疫球蛋白(Ig)是由B淋巴细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所分泌的重要的免疫分子,两种表现形式分别为分泌型与膜型。分泌型Ig主要是以抗体形式存在体液中,特异性结合相应的抗原发挥多种免疫功能,因此,在特异性体液免疫中发挥重要作用；膜型Ig是以B细胞抗原受体(BCR)的形式存在B细胞表面,对于细胞活化、抗原识别、分化及程序性细胞死亡中起重要作用。目前的免疫学理论认为在正常的机体内,免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中选择性进行重组,而该基因在其它体细胞中处于胚系状态,是B淋巴细胞的特征性产物。但是,关于非B淋巴细胞产生Ig分子的现象逐渐被国内外学者认可。2003年北京大学邱晓彦教授首次发现上皮来源肿瘤细胞(非淋巴性肿瘤)及部分增生正常上皮细胞可产生Ig。邱晓彦教授课题组进一步研究发现该Ig可能具有生长因子样活性,对肿瘤生长以及增殖有重要的作用,并且发现癌细胞产生的Ig分子基因表达调控机制以及结构与来源B淋巴细胞的Ig典型特征完全不同。B淋巴细胞可产生多种不同特异性的Ig来应对多种抗原。理论认为,Ig是以可变区(V区)结合相应抗原,因而V区的多样性是保证应对、识别或结合理论所有抗原的基础。免疫球蛋白Ig由胚系基因编码,而基因片段需要基因重排成为功能性编码基因。Ig可变区的多样性来源于B淋巴细胞中基因组发生重排组合以及连接与抗原刺激后诱发的B淋巴细胞高频突变。传统免疫学理论认为,Ig只在B淋巴细胞发育过程中选择性重排。邱晓彦教授课题组研究发现乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌等上皮来源肿瘤细胞及部分正常上皮细胞内Ig存在功能性基因重排。不同类型的肿瘤细胞表达完全相同的可变区序列,同一个体以及不同个体肿瘤细胞来源的Ig序列表达高度同源,研究发现在B细胞表达的Ig数据库均未发现这些序列,提示Ig为非B淋巴细胞产生,来源于肿瘤细胞。肿瘤来源的Ig基因转录本具有独特基因结构,在不同类型的肿瘤细胞,尤其是轻链在所有检测病例均表达极为相似的重排模式(个别碱基的替换)或同一结构保守序列,即Vκ4-1-Jκ3型Ig转录本(专利申请号为200510107833.9)。考虑到Vκ4-1-Jκ3型Igs最初发现于肿瘤,因此可能成为肿瘤研究、诊断乃至治疗的靶点,关键在于获得针对Vκ4-1-Jκ3结构特异性抗体。作为与北京大学邱晓彦教授的合作课题,课题组前期利用生物信息学方法分析预测了Vκ4-1-Jκ3型Ig两个特异性的B细胞识别表位,设计合成叁个短肽,分别为QF20(QAEDVAVYYCQQYYDTPVTF), AL13(序列ASINCKSSQRVSL), AL13B (TQSPDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG,即AL13的延长序列),并获赠邱晓彦教授课题组提供的原核表达Vκ4-1-Jκ3型Ig融合蛋白(GST-Vκ4-1-Jκ3)。以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠获得系列单克隆抗体。获得的抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特异性表位抗体,为研究非B淋巴细胞、组织液以及血液中可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig表达提供强有效工具。本项研究主要目的是对抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特异性表位单抗的鉴定以及建立双单抗夹心ELISA检测体系及其应用。我们用ELISA鉴定抗体的特异性,这部分工作主要是在课题组前期抗Vκ4-1-Jκ3型Ig单抗制备工作的继续。Vκ4-1-Jκ3型Ig最早发现于上皮来源肿瘤细胞,拟建立双单抗夹心ELISA检测体系,检测可溶性(分泌型)Vκ4-1-Jκ3型Igκ,观察正常人与肿瘤病人血清中的Vκ4-1-Jκ3型Ig表达总量是否存在差异。一、双单抗夹心ELISA检测Vκ4-1-Jκ3型Ig体系建立与应用抗Vκ4-1-Jκ3单抗特异性的鉴定Vκ4-1-Jκ3型Ig早期发现来源于上皮性肿瘤,基本结构与正常Ig相同。课题组前期采用原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠获得了单克隆抗体4E9与1A3;用合成肽AL13B-KLH免疫小鼠获得单克隆抗体6G5、5D3与3H9.2。采用辛酸硫酸铵沉淀法纯化单抗,ELISA鉴定纯化后的单抗以及生物素标记单抗的特异性。结果显示抗Vκ41-Jκ3型Ig单抗能特异性地与原核重组蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3结合,且与人IgG与鼠IgG并无交叉反应。因此5种抗Vκ4-1-Jκ3型Ig单抗与生物素标记单抗均可用于后续双单抗夹心ELISA体系的建立。双单抗夹心ELISA检测Vκ4-1-Jκ3型Ig体系建立本章工作的主要目的是建立双单抗夹心ELISA检测体系,并以此检测正常人与肿瘤患者可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig水平及表达规律。本课题组前期工作建立单多抗夹心ELISA检测体系(1A3-标准血清-HRP-IgA,1A3-标准血清-HRP-IgG和1A3-标血清-HRP-IgM)检测显示正常人血清与肿瘤患者血清Vκ4-1-Jκ3型Ig含量有明显差别,表现为肿瘤患者血清中可溶性Vκ4-1-Jκ3型IgA与IgG含量显着高于正常人;而Vκ4-1-Jκ3型IgM明显低于正常人。在此基础上,我们尝试建立双单抗夹心ELISA体系检测可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig,结果显示双单抗夹心ELISA体系可特异性结合标准品融合重组蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3,不能结合正常人血清与肿瘤血清Vκ4-1-Jκ3型Ig,未检测血清与肿瘤病人血清Vκ4-1-Jκ3型Ig总量表达存在有差异。因此不能用此体系检测肿瘤血清与正常血清Vκ4-1-Jκ3型Ig总量。ECDI即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimide),是一种易潮湿、水溶性的化学药物,广泛应用于肽的合成。ECDI与肽和蛋白的偶联主要是通过激活游离的羧基,促使激活的羧基与亚胺形成共价肽。1979年Miller等首次提出ECDI联合抗原递呈细胞APC具有诱导耐受的潜力并证实ECDI-APC会诱使效应T细胞无能以及抗原特异性无反应性。ECDI偶联抗原在某些在某些自身免疫性疾病如多发性硬化,自身免疫性糖尿病,实验性自身免疫性脑脊髓炎可诱导自身免疫耐受。最近二十年来,器官移植患者短期存活率明显延长,但10年以后长期存活率仍不失很理想。移植排斥反应和术后长期服用免疫抑制药物(无抗原特异性)所致副作用是导致这一局面的主要原因。因此,如何在移植患者体内诱导供者特异性免疫耐受,从而最终避免排斥反应,停用,甚至不用免疫抑制药物是移植学研究的重要目标之一。诱导供者特异性免疫耐受的策略之一是在移植前将供者抗原暴露于受体。此类暴露方法的最关键之处是确定暴露的具体条件,以确保诱导受体耐受而不是引起受体致敏。这种类似于“幼儿计划免疫接种”的方法自从1980年代以来进行了多次实验,终因产生致敏和促血栓形成等多种因素被排除在临床应用之外。近期,有学者通过应用一种ECDI把自身免疫疾病相关的肽或蛋白交联到脾细胞,并输注至自身免疫疾病动物模型,成功在实验性自身免疫性脑炎(EAE)和自身免疫性糖尿病(T1D)模型诱导抗原耐受。Xunrong Luo首次把这种策略转换到移植耐受领域,通过输注ECDI处理的供者脾细胞(ECDI-SPs),在MHC完全错配的小鼠胰岛移植中成功诱导胰岛移植物的无限期存活。该研究方案基于完全不用免疫抑制剂,不需要短暂细胞删除、抗体介导的共刺激信号阻断、或移植前应用免疫抑制药物等措施。进一步研究显示ECDI-SPs输注通过多种机制来影响宿主异基因反应,包括克隆清除、无能和免疫调节,这些机制通过协同作用来诱导高效的移植免疫耐受。除在小鼠同种异体和异种异体的胰岛细胞移植模型中观察到ECDI-SPs可诱导长期移植耐受,并且,在输注前删除B细胞可有效诱导出异种胰岛移植物的无限期存活。研究还显示ECDI-SPs可显着延长在MHC完全错配的心脏移植物的存活,并且,短期应用雷帕霉素(rapamycin)可诱导受体心脏移植物无限期存活。目前工作拟在前期研究工作的基础上,通过体外混合淋巴细胞实验,与输注人类脾淋巴细胞至NOD-SCID小鼠(即重症联合免疫缺陷小鼠,T和B细胞缺陷)建立人源化小鼠模型进行ECDI-SPs体内实验阐明ECDI-SPs诱导下人淋巴细胞各亚群异基因反应性的动态变化规律和机制；研究模拟同种异基因移植环境下,人类ECDI-SPs诱导人淋巴细胞抗原特异性免疫耐受的效果,深入探讨针对供者特异性免疫耐受机制。一、ECDI-SPs诱导供者特异性耐受体系的建立初步研究人类ECDI-SPs诱导异基因T淋巴细胞各亚群的活化、增殖、凋亡的动态变化规律主要采用混合淋巴细胞实验进行流式检测观察ECDI-SPs在体外对受者淋巴细胞的影响,包括增殖,抑制增殖与凋亡的变化规律。研究结果显示ECDI-SPs诱导方案显示可特异性抑制T细胞亚群的增殖。ECDI可诱导其处理的人脾淋巴细胞的凋亡。初步建立NOD-SCID小鼠体内实验模型输注人脾淋巴细胞至NOD-SCID小鼠体内观察一个月内小鼠体内人脾淋巴细胞的存在情况。研究显示,NOD-SCID小鼠采用脂质体清除巨噬细胞以及300cGy照射等预处理后,腹腔注射3×107人脾淋巴细胞在不同时间点均可检测到人脾淋巴细胞的存在,初步建立了NOD-SCID小鼠体内实验模型。后期可在此基础上进行优化,进行体内实验。(本文来源于《南方医科大学》期刊2016-04-01）
杨植[9]（2015）在《含结核特异CDR3保守序列TCR基因的构建及其修饰T细胞抗结核活性研究》一文中研究指出背景结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的传染性疾病。全球约1/3的人口感染MTB,其中约5-10%罹患活动性结核病,每年约900万例新增活动性肺结核报告。近年来,由于耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株的流行、人类免疫缺陷病毒(HIV)与MTB伴发感染,使结核病成为死亡人数最高的传染病。传统结核病的治疗仍以基于抗生素的化疗为主,但由于疗程长、副作用大、以及耐药性等问题,导致结核病患者久治不愈、治疗效果欠佳。MTB属于胞内寄生菌,体液免疫难以对其发挥作用,抗结核感染的免疫机制主要是细胞免疫,作用最关键的是特异性CD4+Th和CD8+CTL。T细胞过继免疫治疗可以作为对结核免疫缺陷患者和耐药患者有效的治疗方法。T细胞过继免疫治疗是体外培养、扩增、并利用抗原特异T细胞表面受体(TCR)基因修饰T细胞,赋予T细胞抗原识别特异性,回输体内从而使机体获得大量效应T细胞,以发挥清除MTB作用。本研究所已证实MTB抗原特异TCR基因修饰的CD4+、CD8+T细胞在具有良好的抗结核活性。然而,自体T细胞过继免疫治疗适用范围窄,需针对病例个体进行结核特异性抗原刺激T细胞、筛选抗原特异T细胞,建立并筛选T细胞克隆、抗原特异性TCR构建、基因修饰T细胞等过程,其筛选的TCR基因不具有广泛适用性,仅针对个体适用,且周期长。有研究表明流感病毒、人类疱疹病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和巨细胞病毒(CMV)等病毒感染的病例间可观察到TCR的偏好取用,即限制性取用特定α链可变区基因(Vα)、p链可变区基因(Vβ)或互补决定区3(CDR3)区序列,具有保守的TCR基因。这些保守TCR基因具有高活性及敏感性,对抑制病毒复制起到重要作用。在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,分别与负载灭活H37Rv菌株的DC共培养,检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖与IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌水平,TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ、 TNF-α、GrB分泌水平,及其对靶细胞的杀伤作用,证实含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰的T细胞具有一定的抗结核活性。目的找到结核特异CDR3保守序列,构建含保守序列的TCR,研究其修饰患者T细胞的体外抗结核活性,为下一步动物实验奠定基础,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗提供依据。方法1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列①采用淋巴细胞分离液分离结核患者和健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC);②分别磁珠分选出CD4+、CD8+T细胞,提取CD4+和CD8+T细胞mRNA,逆转录为cDNA；③CDR3谱型分析检测CDR3谱型,并选择在CD4+、CD8+T细胞中,呈单克隆扩增的抗原特异TCR α、β基因家族测序分析,分析病例间结核特异CDR3保守序列及优势表达的V基因家族、J基因片段；④利用CDR3谱型复杂性评分系统对结核患者和健康志愿者进行评分,并比较差异；⑤利用相对复杂性评分系统分析结核患者间CDR3区基因多样性差异。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的重组逆转录病毒表达载体①获取高频使用V基因片段,以及C基因片段的序列,构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,分析TCR a链和β链排列组合而成的异二聚体结构的稳定性,确定需构建的TCR基因：②根据人α链和β链基因家族可变区(variable region, V)和恒定区(constant region, C)基因序列设计引物,扩增含结核特异CDR3保守序列的TCR的α链和p链全长基因；③采用本实验室已经构建好的最小突变C区(其中C区9个氨基酸位点替换)替换α链和β链全长基因的C区：④利用重组PCR技术,将已最小突变TCRα链和β链基因通过自剪切多肽2A连接,并克隆至pGEM-T载体测序鉴定；⑤将测序正确的TCR全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；⑥采用磷酸钙转染法,包装逆转录病毒,超速离心法浓缩病毒；⑦重组病毒转染NIH3T3细胞,流式细胞术测定感染性滴度,计算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞总数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(ml)。3.含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰T细胞的抗结核活性IL-2和抗CD3单抗活化T细胞后,以MOI=10将重组病毒pMX-β-2A-α-IRES-GFP转染T细胞,通过流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比。按一定效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰T细胞与负载灭活H37Rv菌株的DC混合培养,以未转染和空载体转染的T细胞为阴性对照,以鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)为非特异性抗原对照；酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测一定时间TCR基因修饰CD4+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、IL-4分泌水平,利用WST-8法检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖：ELISA检测一定时间TCR基因修饰CD8+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、GrB分泌水平,利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)技术,检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载MTB的DC的杀伤活性。4.统计学分析利用配对T检验方法比较健康志愿者与结核患者CD4+、CD8+T细胞亚群的CDR3谱型复杂性评分：利用单因素方差分析比较3组结核患者病例组组间相对复杂性评分；利用多个独立样本非参数检验评估患者年龄、型别、卡介苗接种史、结核菌素皮肤试验、结核病史或接触史、吸烟状况、结核病种类间差异；利用斯皮尔曼相关性分析检测相对复杂性评分和疾病严重程度以及其他临床指标的相关性。CD4+T、CD8+T细胞的细胞因子分泌水平的差异、CD8+T杀伤率应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch校正,各组间两两比较方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett's T3法,采用析因设计资料的方差分析CD4+T细胞增殖水平。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据分析。结果1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列检测86例结核患者CDR3谱型,对单克隆增生T细胞进行TCR基因测序,结果显示：86例病例中V基因片段高频使用Va7 (43.02%). Va9 (48.84%)、Vα17 (50%)、Vα32(41.86%)、Vβ19(86.5%)、Vβ24 (62.79%)基因家族。分析其CDR3区基因序列,结果显示：J基因片段中Jα34, Jα57, Jβ2-1出现频率较高；Vα链和Vβ链CDR3区存在保守序列,其中TCR Vα链CDR3区中存在GGGGNKLI. GGGNEQYF. APDTGSGAF保守序列,TCR Vβ链中存在GGGNKLI、TNKUI、 SADKLI保守序列。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的逆转录病毒表达载体从GeneBank中获取高频使用V、J基因片段、以及C基因片段的序列,将CDR3保守序列与V、J、C基因片段拼接成全长α、β链基因序列,并对α、β链随机搭配组合形成的TCR进行构象预测,选出稳定性较佳的TCR Vβ19. Va7双链。成功扩增出经最小突变的含有结核特异CDR3保守序列的TCRβ及a链全长基因,经TA克隆后测序,Vβ19、Va7基因序列与预期的V区序列完全一致,C区的基因序列与预期相符。利用自剪切多肽2A,通过重组PCR,扩增出T细胞的hVp 19mCβ-2 A-hVa7mC融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒表达载体pMX-hVp19mCβ-2A-hVa7mCa-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将其与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-29 3,48h后取病毒上清,浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,检测病毒感染滴度。3.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD4+T细胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h,ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-y分泌水平显着高于UnTd+DC组(P<0.001),略高于另外叁组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IFN-y分泌水平显着高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,2例患者Td+MTB组的TNF-a分泌水平均显着高于其他各组(P<0.001)。按E：T=15,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h, ELISA检测上清中IL-4的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IL-4分泌水平显着低于UnTd+DC组、EmTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.001),略低于UnTd+MTB组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IL-4分泌水平显着低于其他各组(P<0.05)。②检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,测定第7天各组CD4+T细胞的增殖水平。结果显示,患者1的Td+MTB组增殖水平显着高于UnTd+DC组和UnTd+MTB组(P<0.05),略高于其它两组但差异不显着；患者2各组间增殖水平无统计学差异(P>0.05),但Td+MTB组T细胞增殖水平略高于其它各组。4.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h, ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于Td+OVA组(P<0.05),略高于其它叁组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含保守CDR3序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显着；患者2的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中GrB的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组GrB分泌水平显着高于其他各组(P<0.001);患者2的Td+MTB组GrB分泌水平显着高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显着。②检测TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤活性按E：T=30,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,检测各组CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用。结果显示,患者1的Td+MTB组的杀伤率显着高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和EmTd+MTB组(P<0.05),略高于Td+OVA组但差异不显着；患者2的Td+MTB组的杀伤率显着高于其他各组(P<0.05)。结论在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,证实其具有一定的体外抗结核活性,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗奠定了基础。(本文来源于《南方医科大学》期刊2015-05-27）
王璐[10]（2015）在《苛求芽孢杆菌尿酸酶保守序列突变对其性质的影响》一文中研究指出苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶含322个残基,四聚体为活性形式。此尿酸酶在pH 7.4和37℃时半衰期约为23天,比真菌尿酸酶热稳定性高近10倍。分析晶体结构发现,此尿酸酶N端前9位残基和C端296到302位残基以反向β-折迭方式聚拢成二聚体并维持亚基界面上的活性中心,其中N端有碱性和酸性的残基而C端主要是酸性的残基。本项目基于尿酸酶构象分析、序列比对和定点突变,探索保守序列在酶热稳定性和活性中的作用,为其分子改造奠定基础。1.苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列对其性质的影响野生型N端序列为AERTMFYGKGDV;据其晶体结构,分析附近静电作用网络设计改变其静电网络的N端突变体。比较发现N端残基突变后Ki、Km、最适温度和最适pH变化较小,但比活性和热稳定性变化不同。野生型尿酸酶比活达约11.5kU/g,前叁个氨基酸的突变ARR、QQR、RQR、VQR的比活分别为6.3kU/g、7.0kU/g、8.6kU/g、 9.3kU/g,非变性PAGE电泳发现均为四聚体,RER突变体比活提高到13.5kU/g。这些突变体在37℃时热稳定性与野生酶基本一致,4℃pH9.2时稳定性略有下降。但突变体RESRESRER、REGREGRER、 SSSSSRER比活性下降到4.3kU/g、2.7kU/g、4.8kU/g,经非变性PAGE电泳发现仍为四聚体,且热稳定性在37℃pH 7.4变化显着,分别为1.3d,0.75d,16d。最特别的是突变体Y7F,其比活能保留27%,但在37℃中性条件热失活加速1000倍。2.苛求芽孢杆菌尿酸酶C端序列对其性质的影响对C端305位以后残基突变或者截断或延长C端考察性质改变。突变体D307R、去307都没有活性,突变体去314、R310E、R311R、 E318R、Y319F、L322R分别为3.2kU/g.4.4kU/g、3.6kU/g、3.3kU/g、 2.9kU/g、3.6kU/g,均为四聚体；中性条件下37℃热稳定性明显下降但碱性条件稳定性变化小。突变体L322SNSNSN、L322DSNSNSN、 L322DSNSNSNHHHHHH表达之后经DEAE-纤维素、制备型电泳纯化后最高比活保留66%,且热稳定性基本不变。无论C端还是N端加入His标签后比活性都会下降,但热稳定性影响不大,用Ni2+-NTA纯化效果与DEAE-纤维素接近,但效率高很多。3.苛求芽孢杆菌尿酸酶中间保守区突变对其性质的影响。序列比对发现在此尿酸酶中间也有保守序列。其中A68L、T69V、 D70L、K73E、F179L、D185N、S243A、I244F、Q245I、H246E均无活性,非变性PAGE电泳观察表达产物主要为二聚体；F179L为四聚体却仍无活性。突变体D70N、S71A、T188V、T189V、E192Q、Y249F、 F298L、Q299I、F301L的活性分别为0.55kU/g、0.34kU/g、 0.65kU/g、 0.53kU/g、1.85kU/g、4.71kU/g、1.97kU/、0.93kU/g、2.59kU/g;突变体D70N为二聚体,但有活性。在37℃和4℃及pH 7.4和pH 9.2时,这些突变体热稳定性均显着下降,其中D70N、T188V、E192Q热失活半衰期只为原来的0.1%。4.苛求芽孢杆菌尿酸酶亚基之间离子键改变对其性质的影响在此尿酸酶四聚体晶体结构中,每个二聚体中每个亚基的R140、 E142、E291、R293与另一个二聚体中对应相邻亚基的E142、R140、R293和E291形成四对离子键；据此两个二聚体间形成八对离子键。突变体R140E、R140Q、E142R、E291Q、E291R中,E142为四聚体无活性,其余活性为1.3kU/g、1.6kU/g、13.3kU/g、0.1kU/g; E291Q活性较高但稳定性最差。突变体N141C、P292C能形成二硫键,但不能提高稳定性。这7个突变体与氧嗪酸钾结合,在相应条件下的热稳定性都可以显着提高,最强的增强效应达到数百倍。5.苛求芽孢杆菌尿酸酶序列和性质关系此尿酸酶及其突变体解聚失活后,抑制剂氧嗪酸和黄嘌呤及底物尿酸可诱导聚合再组装成活性四聚体。此尿酸酶C端有独特构象且C端参与形成的静电网络、保守序列间氢键都是活性和稳定性所必须；四聚体内部相邻亚基之间的离子键也是维持活性四聚体的关键。在低温下,此尿酸酶初期非常稳定,但构象变化积累到一定程度后活性快速指数衰减,呈现明显的两阶段失活过程。总体而言,此尿酸酶有优异热稳定性,可能是此尿酸酶长期进化效应积累所致。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2015-05-01）
保守序列论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
PAiRFP1(photoactivatable near-infrared fluorescent protein 1)是在根癌农杆菌细菌光敏色素Agp2的基础上,通过定向进化的手段筛选得到的光激活近红外荧光蛋白。这类光激活近红外荧光蛋白应用到肿瘤的活体成像中,尤其是早期成像时比永久性荧光蛋白更具有优势,这是因为通过光激活前后的荧光强度差减可以提高成像信噪比,实现弱信号的更精确定位。这种光激活行为与PAiRFP1中含有PHY区域密切相关。一方面PHY区域是实现吸收远红光的Pfr态(far red abosorbing state)?吸收红光的Pr态(red absorbing state)光转换、光激活必须的;另一方面,我们希望提高Pr的荧光量子产率,就需要抑制Pr?Pfr的暗恢复(热转换过程),这两个看似矛盾的方面是如何受氨基酸调控的呢?虽然PAiRFP1的晶体结构尚未解析,但氨基酸序列比对显示在PHY区域中PRXSF序列高度保守,同源建模结果显示PRXSF位于BV(biliverdin)结合口袋附近,F187,F192,Y251在BV与PRXSF作用的氢键疏水网络中可能发挥了作用。针对上述位点,本论文通过定点突变,结合光谱学手段研究了上述氨基酸的功能,发现(1)在PRXSF保守区域,只有P459,S462,F463对于发挥光激活是必须的,而当R460和K461突变后,光激活行为仍然保留。通过在460和461位引入不同性质的氨基酸残基,可以进一步改善光激活前后的荧光对照。本论文中构建的R460A、R460S、K461A、K461Q这四个突变体,它们的摩尔消光系数、荧光量子产率、分子亮度、光激活前后的荧光增加倍数等都比PAiRFP1有所提高。(2)BV结合口袋附近起关键作用的F187、F192和Y251突变也导致光激活行为削弱甚至消失。在此基础上,我们通过检测BV组装过程、暗恢复动力学、盐酸胍诱导的去折迭、以及蛋白质内源荧光、FTIR等初步探讨了PAiRFP1光激活行为的结构依据,相关结果为后续深入研究奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
保守序列论文参考文献
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