申佩弘[1]2003年在《水稻种子蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的特异表达》文中研究表明本研究首先利用PCR法获得了水稻种子专一性表达启动子(醇溶蛋白启动子与谷蛋白启动子)，将两启动子插入到植物表达载体pBI121上35S启动子的位置，构建了醇溶蛋白启动子与谷蛋白启动子驱动下的gus基因植物表达载体：随后用ipt基因取代gus基因，分别构建了醇溶蛋白启动子与谷蛋白启动子以及CaMV35S启动子驱动下的ipt基因的植物表达载体。将上述嵌合基因经过叁亲结合法，把重组质粒及原始载体pBI121导入根癌农杆菌(LBA4404)中，获得了分别含有上述六种质粒的农杆菌菌株，用于普通烟草的转化。将含外源基因的根癌农杆菌菌液与烟草幼叶共培养，并进一步继代和抗生素筛选获得相应的抗性植株。Gus组织染色表明Pp与Pg均有种子特异表达活性。通过PCR测序分析，证实外源ipt基因已经整合到烟草植株的基因组中。利用ELISA检测转基因植株种子中的iPAs(异戊烯基腺苷与异戊烯基腺嘌呤)的含量发现，转基因烟草种子中的iPAs的含分别增加了4.17和2.43倍。通过对种子重量分析发现转基因种子的重量与对照相比分别提高了12.14％和7.8％。
卢碧霞[2]2006年在《转金属硫蛋白基因水稻的特异表达及其对重金属抗性的研究》文中进行了进一步梳理哺乳动物金属硫蛋白(Metallothioneins简称MTs)是一类低分子量,富含半胱氨酸的金属结合蛋白。由于其具有重金属解毒的功能,我们将小鼠金属硫蛋白基因(mMT)克隆在绿色组织特异表达启动子和组成型启动子35S的下游,构建了植物表达载体pCAMBIO1301RSmMT﹑pCAMBIO1301ASmMT和pCAMBIO130135SmMT,并将其导入农杆菌AGL0中,用农杆菌侵染法转化水稻,通过水稻植株的再生和抗生素筛选,成功的得到了转基因水稻植株。以mMT cDNA为探针对T_0和T_1代转基因水稻进行了Southern blot检测,证明外源基因确实整合到水稻基因组内并稳定传递到后代;以mMT cDNA为探针进行Northern blot杂交,检测到不同启动子引导的金属硫蛋白在转基因水稻的不同组织中的表达。35S组成型启动子引导的mMT在转基因水稻的根部和叶部都有mMT的表达;而绿色组织表达启动子引导的MT只在转基因水稻的叶部检测到MT的表达,在根部没有检测到MT的表达。Western blot结果证明了外源基因在蛋白质水平上的表达。为了探讨水稻金属硫蛋白(rMT)在重金属结合方面的功能﹑RNAi抑制基因表达的功效及与小鼠金属硫蛋白的功能关系,我们又克隆了水稻金属硫蛋白的叁个基因并将其融合,构建了水稻金属硫蛋白RNA干涉表达载体pJRrMT1a﹑pJRMT2a﹑pJRrMT3a和pJRrMT123a,导入农杆菌GV3101中,用农杆菌侵染法转化水稻,通过愈伤组织的形成,芽﹑根的形成,用抗生素筛选,成功的得到了转基因水稻植株,通过对转基因水稻株系的T_0和T_1代PCR和Southern blot检测,证明外源基因确实整合到水稻基因组内并稳定地传递到后代;以水稻金属硫蛋白基因全长设计引物,以水稻ACT1作为内源参照,进行半定量RT-PCR,检测到转基因水稻mRNA有不同程度的降解。通过对不同表达系统转基因水稻T_1代株系抗生素筛选分析表明,转基因水稻植株的抗生素抗性在后代中得到了保持。不同转基因株系在含有相应抗生素的水溶液中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。对转mMT基因水稻T_1代株系抗重金属分析表明,转mMT基因水稻的T_1和对照中花11对Cd~(2+)的抗性有明显差异,在含有不同浓度Cd~(2+) ( 0～1.0mmol/L)的水溶液中转mMT基因植株生长正常,表现出了对Cd~(2+)的高度抗耐性。而对照株在Cd~(2+) 0.3mmol/L的浓度下即受到毒害。原子吸收光谱测定Cd~(2+)在转mMT基因水稻不同组织中的分布表明,特异启动子引导的mMT转基因水稻中叶部和茎中Cd~(2+)含量明显高于根部,而35S引导的mMT转基因水稻Cd~(2+)的含量主要在根部,叶部和茎中含量很少。Southern blot、
刘振宁[3]2016年在《植物双组分信号系统调控雌配子体发育的研究及其相关基因家族在白菜中的鉴定、进化和表达分析》文中研究指明被子植物具有雌、雄两种配子体,其生活周期是二倍体孢子体和单倍体配子体世代交替的过程,其中,雌配子体(胚囊)在植物花粉管引导、受精和受精后的种子发育等生殖过程扮演着关键角色。雌配子体的发育是非常重要的发育事件之一,在基础理论研究和农业育种工作中具有重要意义,一直是植物生殖发育生物学研究的热点。研究表明,双组分信号系统(Two-component system, TCS)介导的磷酸化传递是植物调节细胞内信号转导的主要机制之一。被子植物具有包括组氨酸激酶(Histidine kinase, HK)、组氨酸磷酸转移蛋白(Histidine phosphotransferprotein,HP)和反应调节因子(Response regulator, RR)的多步磷酸化传递的双组分信号系统。目前对植物双组分信号系统功能的研究主要集中在逆境胁迫和营养生长方面,对生殖发育尤其是TCS对雌配子体发育和细胞命运分化的作用还知之甚少。为进一步揭示植物双组分信号系统与雌配子体发育和细胞命运决定的关系,本研究对模式植物拟南芥胚囊发育过程中的双组分信号进行了检测,并分析了参与双组分信号转导的组氨酸激酶基因在胚囊中的表达模式,重点研究了细胞分裂素受体对功能大孢子形成的调控以及CKI1 (cytokinin-indepenndent 1)基因与雌配子体细胞命运决定的关系。同时,为深入研究白菜中的双组分信号系统,基于白菜全基因组对白菜IPTs (isopentenyl transferases)和(CKXs (cytokinin oxidase/dehydrogenases)基因家族、TCS基因以及CRFs (cytokinin response factors)基因家族进行了鉴定,并对上述基因家族的基因组信息、蛋白特征、进化和表达模式等方面进行了研究,为今后开展其功能的分析奠定了基础。主要研究结果如下：(1)利用TCSnpro::NLS-3XeGFP marker对拟南芥胚囊发育过程中双组分信号的动态分布进行了观察,结果表明,双组分信号从胚囊发育的功能大孢子时期到成熟期在雌配子细胞中均存在,暗示双组分信号系统在雌配子体发育过程中具有重要的功能。对所有能够参与双组分信号转导的7个组氨酸激酶基因在胚囊发育过程中启动子活性的分析结果表明,除AHK2外,在胚囊中AHK1、 AHK3、AHK4、AHK5、CKI1和ETRl均检测到表达信号,且CKI1表达相对较高。对ahk2 ahk3 ahk4叁突变体的观察结果表明,AHK2,AHK3和AHK4在调控功能大孢子发育时存在功能冗余。(2)拟南芥ckil-9/+突变体表现出雌配子体的败育表型。对胚珠DIC观察表明,突变体胚囊中两个极核往往不能正常融合,还伴随着未发生降解退化的叁个反足细胞核从胚囊合点端向珠孔端的迁移。构建了雌配子体细胞特异表达的单1narker和双marker,并将上述marker通过拟南芥浸花转化法转入ckil-9,/+突变体中,结果表明,突变体胚囊中反足细胞和中央细胞的细胞命运彻底丢失,叁个反足细胞和两个未融合的极核表现为卵细胞或者助细胞的细胞命运。对CKI1蛋白在胚囊发育过程中的定位分析表明,CKIl从胚囊发育的FG4时期开始表现出合点端的极性定位,这种极性定位可能是通过基因转录后的调节机制实现的。利用ES1启动子在胚囊中过表达CKIl基因,结果显示,CKI1在卵细胞和助细胞中的异位表达能够将卵细胞和助细胞的细胞命运转变成中央细胞的细胞命运。基于上述结果提出了雌配子体细胞命运决定的两种模型。(3)对,IHPI～AHP5在成熟胚囊中启动子活性的分析结果表明,AHP1基因在中央细胞和助细胞中表达,AHP3基因在中央细胞中特异表达,AHP2和AHP5基因在中央细胞、卵细胞、助细胞和反足细胞中均有表达,而AHP4基因在胚囊中不表达。随后构建了ahp多突变体并对多突变体的种子发育和胚囊发育进行了研究,结果显示,ahp2-2 ahp3 ahp5-2/+叁突变体表现出与ckil-9/+相似的表型,AHP2、AHP3和AHP5共同作用于CKIl基因的下游调控雌配子体的发育。(4)对植物HK家族蛋白氨基酸序列的比对发现,CKI1在HK结构域和HATPase结构域中分别存在着氨基酸序列为SHD和GLGLG的特异motif,可以作为判定CKI1的重要依据。通过overlap extension PCR技术对CKI1结构域的替换研究了CKI1的结构域与CKI1基因功能的关系,结果表明,CKI1的HK结构域和HATPase结构域而非Rec结构域影响CKI1基因的功能。另外,CKI1蛋白亚细胞定位的研究结果显示,CKI1的N-端区域决定着CKI1蛋白在内质网上的定位。(5)对不同长度的CKI1启动子的研究表明,CKIl的核心启动子元件位于第一个内含子中。利用酵母单杂技术对CKI1上游转录调控因子进行了筛选和鉴定,最终筛选获得了7个在中央细胞中表达的转录因子基因。(6)在白菜基因组中分别鉴定到了13个IPTs基因和12个CKXs基因,并对其基因组信息和蛋白特征做了分析。多序列比对、保守结构域和系统进化分析结果表明,白菜IPTs和CKXs都可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和IV四个亚组。选取白菜、拟南芥和琴叶拟南芥叁个十字花科植物中的IPTs和CKXs做了基因组层面的比较分析,发现其基因存在片段重复和串联重复现象,并通过计算直系同源基因和旁系同源基因的Ks和Ka值对基因的进化模式做了分析。结果显示,白菜中旁系同源基因的Ks值明显比白菜、拟南芥和琴叶拟南芥中直系同源基因的Ks值要小,同时,白菜在大约26～33MYA与拟南芥分离开。另外,通过qRT-PCR技术对白菜IPTs和CKXs在不同器官中表达模式的分析,筛选出了一些器官特异表达的基因。对白菜IPTs和CKXs在干旱胁迫和盐胁迫条件下以及对外源细胞分裂素和脱落酸响应模式开展研究,获得了一些参与非生物胁迫和激素调控网络的候选基因。(7)对白菜中的双组分信号元件进行了鉴定,共找到了85个TCS基因成员,包括20个HK基因、8个HPs和57个RRs,并对其基因组信息和蛋白特征做了分析。多序列比对、保守结构域和系统进化分析结果表明,HKs可以分为细胞分裂素受体亚家族、AHKl亚家族、AHK5亚家族、CKI1亚家族、乙烯受体亚家族和光敏色素亚家族。RRs可以分为Type-A RR、Type-B RR、Type-C RR和pseudo-RR四大类。我们分析和比较了白菜和拟南芥中TCS基因的片段重复和串联重复现象,并通过计算直系同源基因和旁系同源基因的Ks和Ka值对基因的进化模式做了分析。另外,通过qRT-PCR技术对白菜TCSs在不同器官中的表达模式做了分析,筛选获得了一些器官特异表达的基因。此外,还研究了白菜TCSs对干旱胁迫和盐胁迫的响应特征,以及对外源细胞分裂素、生长素和脱落酸的响应特征。(8)在白菜基因组中鉴定出了281个AP2/ERF超级基因家族成员,并对其保守结构域和进化树进行了分析,结果表明,白菜AP2/ERF超级家族可以分为AP2家族、RAV家族和ERF家族,其中ERF家族又可以进一步分为IREB亚家族和ERF亚家族,包括Ⅰ～Ⅺ 13个小组。对小组Ⅵ和VI-L中的21个CRFs做了重点研究。白菜CRFs可以分为Ⅰ～Ⅴ5个分支,编码A、B和C叁种类型的蛋白。利用qRT-PCR技术对白菜CRFs在不同器官中表达模式开展研究,结果表明,CRFs在不同器官中是遍在表达的,但不同部位的表达量存在一定差异。通过研究CRFs对干旱胁迫和盐胁迫的响应模式以及对外源细胞分裂素和脱落酸的响应模式,筛选获得了一批参与非生物胁迫和激素调控网络的候选基因。研究结果能使我们从一个新的视角理解植物的雌配子体的发育过程,同时也为充分理解经济作物有性生殖的分子机制,完善芸薹属蔬菜作物的生殖生物学研究基础,有效调控作物育性,实现优质高产、高效繁殖提供新的理论依据和技术支持。
张宇[4]2007年在《大豆贮藏蛋白基因启动子的克隆与功能分析》文中认为目前，基因工程中存在的主要问题之一是外源基因的表达水平、表达部位等问题，因此，作为调控基因表达关键元件之一的启动子的研究便成为基因工程研究的关键。根据启动子的转录模式可将其分为叁类：组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异性启动子(tissue-specific promoter)和诱导型启动子(inducible promoter)叁种。迄今为止，植物表达载体中应用最广泛的是CaMV 35S组成型启动子，它导致外源基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达，不但造成能源的浪费还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。这就使人们越发注重特异表达启动子的研究和应用，特异性启动子指导外源基因定向地在人们预定的时间和空间(组织或器官)表达，不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，并且使外源基因的表达处于人们的控制之下，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。利用具有特异性表达特性的启动子被认为是实现对目标基因高表达的重要途径，也是培育高效、安全转基因作物的首选。11S球蛋白是大豆种子中主要的贮藏蛋白，由多基因家族编码，迄今为止已有七个大豆球蛋白基因被克隆、测序，分别是Gy1至Gy7。大豆种子贮藏蛋白具有种子特异性时序表达的功能，在种子成熟的中后期瞬时性的大量合成并贮存于种子蛋白体中。这种种子特异性时序表达的功能主要取决于种子贮藏蛋白基因上游调控序列，所以贮藏蛋白基因启动子成为了研究高等植物基因特异性表达调控的首选材料。我们以大豆品种“吉农T7018”的基因组DNA为模板，根据已发表11S球蛋白G7亚基(Gy7)基因(GenBankAF319776)序列，设计一对引物，通过PCR扩增得到Gy7基因的启动子序列。将其克隆到pMD18-T Vector上，经大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，挑取白斑碱裂解法提取质粒，进行PCR检测和限制性内切酶酶切鉴定，鉴定后的菌株送交大连宝生物公司测序，并进行BLAST分析。测序结果表明所克隆的片段长为963bp，与预期设计的大小一致，该片段与已发表的11S球蛋白基因启动子序列的相似性为45.2％，但所含的启动子序列元件的数量和距离上很相似，均具有有典型的TATA盒和CAAT盒，以及种子特异表达所必须的调控元件。用该启动子取代植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子，与GUS基因编码区连接，获得了由该启动子驱动GUS报告基因的新型植物表达载体pGy-GUS。通过液氮冻融法将重组质粒pGy-GUS、质粒pBI121分别转化到农杆菌LBA4404中，采用叶盘法转化烟草品种NC89。在含有Kan和Cef抗生素的MS选择培养基上进行筛选培养，结果获得6株转pGy-GUS基因植株。对6株转基因苗进行PCR检测，以未转基因的植株作为阴性对照，结果6株再生苗扩增出与目的片段大小一致的条带。对PCR检测呈阳性的转基因植株进行Southern杂交检测，杂交结果显示有4株有明显杂交信号，说明目的基因已成功整合到烟草基因组中。为了验证所扩增的启动子是否具有种子特异性表达的功能，我们对转pGy-GUS、pBI121质粒烟草的根、茎、叶、种子分别进行GUS组织化学分析。结果表明，转pGy-GUS质粒烟草的根、茎、叶未显色，而种子显蓝色，表现出明显的种子特异性；而转pBI121质粒烟草的根、茎、叶、种子均显蓝色，由此初步得出结论：由该启动子序列引导的GUS基因能在种子中表达，而在其它组织中未表达，证实该启动子具有种子特异性表达的功能。本论文的完成为贮藏蛋白基因表达调控机制的研究提供理论依据，还可以在植物的特定部位或发育阶段生产有用蛋白质或其他代谢产物，以实现对外源基因表达的定时、定点、定量叁维精确调控。
刘莉[5]2008年在《水稻叶片衰老特异性启动子的克隆和利用及剑叶早期衰老上升表达基因的鉴定》文中认为水稻是人类最重要的粮食作物之一。虽然目前杂交水稻的推广很大程度上解决了世界人民的粮食问题,但是一些优良品种尤其是一些籼型品种在中后期衰老快,限制了更多有机物的形成和积累,不利于结实率和千粒重等产量相关性状的提高。解决这个问题的关键是了解叶片衰老的机制,创造延缓水稻叶片衰老的途径,进而提高有机物在籽粒中的积累。利用衰老特异性启动子驱动细胞分裂素基因表达、抑制衰老上升基因表达或者过量表达衰老下降基因都有可能实现持绿性水稻的目标。本实验针对这个问题,克隆鉴定了水稻来源的衰老特异性启动子,并用该启动子驱动农杆菌来源的细胞分裂素合成酶基因转化籼稻和粳稻,筛选持绿性家系,并且构建了中花11剑叶的早期衰老上升表达文库,主要结果如下:1.克隆水稻启动子P_(SAG39),通过报告基因GUS融合表达载体转化水稻鉴定其时空组织特异性表达谱。经过组织化学鉴定发现其在叶、茎、根、花、颖壳及未成熟种子的种皮、愈伤组织中表达,在成熟种子及胚乳中不表达,而且在叶片衰老晚期表达量达到高峰,揭示该启动子是叶片衰老特异性,而且可以应用于基因工程育种改良研究。2.鉴于启动子序列预测出多种激素响应相关的顺式作用位点,本实验用瞬时表达体系检测激素和冷胁迫对一系列5'端缺失启动子的表达情况,并且研究了缺失启动子的衰老特异性表达谱,确定P_(SAG39)启动子的衰老相关的顺式作用位点存在的区段。通过凝胶阻滞实验鉴定了可能对衰老上升表达起作用的顺式因子。揭示顺式作用位点HBOXCONSENSUSPVCHS和WRKY71OS与叶片衰老特异表达有关。3.在粳稻中成功转化了P_(SAG39):IPT表达系统,繁殖并筛选了单拷贝插入的转基因纯合家系,5个以牡丹江8~#为受体:MT1、MT2、MT3、MT4、MT5:3个以中花11为受体:ZT1、ZT2、ZT3。4.研究转P_(SAG39):IPT表达系统的阳性转基因水稻的叶片持绿性变化,发现持绿性增强,且这个表型与外源基因IPT的表达量共分离。5.调查了转化植株表达的细胞分裂素在光照下对幼苗生长及抽穗期产生的影响,P_(SAG39):IPT的转基因植株表达细胞分裂素在一定光照条件下(14小时或24小时)影响了种子刚萌发时芽的生长,但是不会影响茎杆的继续伸长。在长日照条件下,转基因中花11植株表达细胞分裂素刺激了OsMADS50的表达,从而提前开花。6.探明结实期间碳氮代谢水平是否发生变化,通过分析纯合家系ZT1可溶性糖含量和全氮含量发现,糖及氮素水平的改变引起叶片的库源转换发生变化从而引发叶片衰老。7.完成纯合家系的随机区组试验,每个小区设置叁个重复,调查转基因植株的持绿性和其他农艺性状。转基因阳性株系ZT1、ZT2的生物学产量相对其阴性株系降低约8-10%,千粒重增加约5-9%。8.以绿色叶片为driver,早期衰老叶片为tester,用抑制差减杂交法完成水稻剑叶早期衰老特异基因文库的构建,以driver和tester的总RNA为探针分别进行文库克隆的Macroarray杂交,筛选出815个差异表达的ESTs。通过生物信息学分析(阳性克隆聚类及GO分析),一共确定了533个单基因,其中183个有GO注释,涉及大分子物质代谢、调控蛋白质合成、能量代谢、调节基因、解毒、病原性和逆境、细胞骨架构成和花发育。121个与已报导过的持绿相关QTLs共线性,其余是功能未知的新基因。9.从文库中随机挑选50个阳性克隆的Northern杂交验证了差减杂交的效率和准确度,达到60%以上。对几个未知功能的基因进行定量PCR实验,发现它们不仅在自然衰老早期上升表达,而且不同程度的受到激素的诱导。这些基因为阐明衰老机制提供了一定基础。
许文志[6]2015年在《柳枝稷根及维管束组织特异性启动子的分离鉴定》文中研究说明柳枝稷(Panicum virgatum L.)是原产北美及中美洲部分地区的C4暖季型多年生草本植物,因其具有:生物质产量高、基因组信息资源丰富、水肥利用率高、抗性强、能适应边际性土壤等优势使之成为木质纤维素类能源植物的模式植物之一。截止目前,已经有RNAi、基因超表达等多种基因工程手段被用于柳枝稷的遗传改良。在现有的技术条件下,柳枝稷的遗传改良工程离不开高效稳定的再生体系,以及可以驱动外源基因表达或调控柳枝稷基因表达模式的启动子。现阶段柳枝稷遗传转化最常用的组成型启动子虽然可以驱动目的基因在转化植株中表达,但会过度消耗细胞内的物质和能量,引起植株矮化等一些负面效应。因此寻找柳枝稷自身有效的组织性启动子很有必要。本研究以改良柳枝稷的再生体系、分离鉴定柳枝稷根及维管束特异性启动子为研究目标,以柳枝稷成熟种子为外植体,采用两步法灭菌,并以MS培养基为基础培养基,构建了柳枝稷高效再生体系。此外,还通过生物信息学分析、real-time及RT-PCR验证、巢式PCR及genomewalking克隆、启动子序列分析及5'系列缺失分析、水稻及柳枝稷遗传转化等步骤后,最后通过组织化学染色验证,分离鉴定了柳枝稷两个根特异性启动子及一个维管束特异性启动子,主要结果如下:1.建立了柳枝稷稳定高效的再生体系:采用两步法灭菌种子,用70%乙醇处理20s,再用0.1%HgCl2处理5 min。之后,以MS培养基为基本培养基,添加5 mg·L-12,4-D与1.2 mg·L-1 6-BA进行愈伤组织诱导,添加0.5 mg·L-1GA3再生。该体系污染率低,出愈率高,可获得大量再生植株。2.通过同源比对,在柳枝稷基因组中发现了一个小基因家族PvRCc3,后经RT-PCR 及 real-time PCR 证实,其家族成员 PvRCc3.1、PvRCc3.2及PvRCc3.3 为柳枝稷根特异性表达的基因。随后,通过巢式PCR克隆了 PvRCc3.2及PvRCc3.3的启动子区域,并且克隆了 PvRCc3.3的4个5'系列缺失启动子。结果表明,由于数据库序列拼接错误,PvRCc3.1的启动子序列通过genome walking等技术均无法克隆,因此PvRCc3.1基因及其启动子序列有待进一步研究证实。3.通过LR反应,将PvRCc3.2、PvRCc3.3及其4个5'系列缺失启动子构建到了pMDC162表达载体上以驱动Gus基因,并且用于转化水稻及柳枝稷。转化植株的GUS染色发现:PvRCc3.2、PvRCc3.3及其系列缺失启动子所驱动的Gus基因在转基因水稻中并不是根特异性的表达,转化柳枝稷后虽然可得到状态良好的抗性愈伤,但对所有植株的GUS染色并没有发现蓝色。因此,本研究结果表明PvRCc3.2及PvRCc3.3的序列信息及其启动子的功能还需要进一步的研究。4.采用同样的研究方法,本研究还发现了柳枝稷维管束特异性profilin基因PvPfn2,通过RT-PCR及real-time PCR验证其表达模式后,克隆了 PvPfn2基因1715bp的启动子区域,以及1313bp、958 bp、712 bp及413 bp的4个5'系列缺失启动子。5.GUS染色结果发现:PvPfn2基因的启动子PvPfn2p可驱动Gus基因在转基因水稻的雄蕊、外稃内稃、节、节间、叶片、叶鞘、不同时期的种子以及根等组织器官的维管束中特异性表达,且其表达不受植物生长发育的影响;此外,PvPfn2的4个系列缺失启动子同样可以驱动Gus维管束特异性的表达。因此,PvPfn2p及其系列缺失启动子均可用于柳枝稷等单子叶植物的维管束特异性基因工程改良。
李岩[7]2006年在《热激启动子驱动基因删除及ipt基因遗传转化杜仲的研究》文中提出杜仲(Eucommia ulmoides Oliv．)系杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia植物，是我国特有的珍稀保护树种，既是传统名贵中药材之一，也是温带最具开发前景的胶源植物。为了通过转基因技术进一步发掘杜仲胶用及药用价值，探索基因构建Hsp_(18.2)：flp-35S：ipt在遗传转化困难植物转基因及快速繁殖中的运用，本研究完善了杜仲再生体系，建立了农杆菌介导的杜仲遗传转化体系，通过农杆菌介导法将该基因构建转化矮牵牛、烟草和杜仲，研究了ipt基因对植株转化及生长发育的影响，探索了热激启动子Hsp_(18.2)驱动的基因删除系统在烟草、矮牵牛中的删除条件及效率，取得如下主要结果： 1、农杆菌介导含基因删除系统表达载体对矮牵牛、烟草的遗传转化及基因热激删除的研究 利用农杆菌介导法将Hsp_(18.2)：flp及Hsp_(18.2)：flp-35S：ipt分别转化矮牵牛(Petunia axilaris)及烟草(Nicotiana tabacum cv．Xanthin)，在100mg／L kan的筛选压下进行筛选获得转基因植株。 ipt基因表达有效促进了进烟草、矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导，转ipt基因矮牵牛能够产生大量分枝，易于增殖培养。但转ipt基因的植株生根受到明显抑制。 由于表达载体含有基因删除系统，采用44℃、6 h热激6次，先后对309株转基因矮牵牛及191株转基因烟草进行热激，通过GUS检测。有61株矮牵牛，42株烟草没有检测到GUS活性。其中有2株转基因矮牵牛ipt06-01及ipt11-03在热激后表型发生明显变化，其新生叶片叶柄变长，叶型恢复，同时根部开始发育，植株恢复顶端优势并开始长高，形态学特征逐步呈现出野生型特征。通过PCR及RT-PCR检测，结果表明外源基因己被删除。
段永波[8]2007年在《转ipt-bar双价基因对水稻生长发育影响的研究》文中指出本研究以水稻EY105、R527及惠水黑糯为研究材料，并以农杆菌介导法和基因枪法将含有异戊烯基转移酶(ipt)基因和抗除草剂(bar)基因的双价表达元件导入水稻，分析转基因植株生理生化特性及农艺性状，拟通过基因工程手段调控水稻抗衰老特性和抗冷性，并获得抗除草剂性状。研究结果如下：1、农杆菌介导法遗传转化水稻体系的建立在本实验室已建立水稻愈伤组织诱导再生体系的基础上，对影响农杆菌介导水稻遗传转化的因子进行了优化。结果表明：成熟胚或幼胚来源的愈伤组织经继代培养1-3代后，与制备表达载体pBinAipt-bar的OD_(600)为0.5-0.7的农杆菌EHA105共培养，侵染15min后用无菌滤纸吸干，接入铺有滤纸的共培养基上，共培养3d后脱菌接种于筛选培养基(含4mg·L~-PPT)上进行筛选培养。保持选择压继代3次后转入分化培养基。当小苗长至10cm左右时炼苗、移栽至温室花盆中。通过本方法籼稻转化率为4.38％，粳稻转化率达9.69％，惠水黑糯最高，为13.67％。2、基因枪法遗传转化水稻参数的优化以惠水黑糯和中旱21未成熟胚诱导的愈伤组织为材料，采用轰击前6h--轰击后18h和轰击前12h--轰击后18h两种方式进行高渗处理，并对1100 psi、1350 psi和1550 psi 3种易裂片压力进行试验。研究发现，轰击前6h--轰击后18h高渗处理能得到较好的效果，易裂膜压力在1100 psi和1350 psi时都能获得较高转化效率，惠水黑糯以1100 psi较好，中旱21以1350 psi为宜，所试验的两个品种抗性愈伤获得率均在30％左右。3、转化植株筛选鉴定和生理生化研究通过农杆菌介导法及基因枪法遗传转化水稻，对转化植株进行PCR、RT-PCR检测和除草剂喷洒试验。结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中，转ipt-bar基因EY105和R527分别稳定遗传至T4和T3代。本研究结果证明转基因植株在低温(4℃)生存时间长于对照，而且在常温下，目的基因的导入对水稻植株的主要生理指标影响不大，但经低温胁迫后，转基因水稻叶片细胞电解质渗漏率明显低于对照，叶片叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量较对照高，POD、SOD活性降低速率和MDA含量增加率低于对照植株。且转基因水稻种子在低温(15℃)下萌发率高于对照。说明ipt基因表达，细胞分裂素增加，有利于抵抗低温不良环境。在生育后期，转基因水稻的光合速率、POD活性及叶片叶绿素含量显着高于对照植株，生育期比对照延长约15d。根据转基因水稻农艺性状、抗冷性和抗除草剂特性，筛选出两个稳定遗传的转基因株系。其中转基因R527ib1比对照R527增产25.4％，而转基因EY105株系6-19比对照EY105增产达125.3％。本研究首次将Act驱动的ipt基因与抗除草剂(bar)基因的双价表达载体导入水稻，通过对转基因水稻的生理生化指标和农艺性状分析，并初步筛选出植株茎叶衰老延缓、抗冷性增强且抗除草剂的转基因水稻株系，可作为水稻育种的新种质。
兰岚[9]2008年在《烟草根特异表达基因的筛选鉴定与启动子的克隆》文中提出烟草作为一种特殊的经济作物,每年为国家经济发展作出重要贡献。2007年烟草行业工商税利超过3880亿元,同比增长25%。但是烟草生产上受许多病虫害的侵染而影响烟叶产量和品质。烟草青枯病是影响南方烟区发展的一个重要因素之一,而分子育种为解决烟草青枯病问题开辟了新的育种途径。本研究采用了分子生物学、生物信息学技术和基因工程手段进行烟草的分子育种研究:一是筛选和鉴定了一些烟草根特异表达的基因片段,二是通过同源克隆途径分别克隆了烟草受病原菌诱导的启动子,为烟草的分子育种提供基础。其主要结果如下:用地高辛分别标记烟草茎叶和根的cDNA作为探针与根差异基因的高密度点阵膜进行杂交,从根差异基因的验证结果中挑选了130个克隆进行测序分析,其中发现有59个基因未找到与之同源性关系高的基因,并将其登录NCBI,登录号EX465336(?)EX465278(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez),另外71个基因在其它植物上有与之高度同源的基因存在。在这130个基因中有19个基因存在明显的差异,可能是根特异表达的基因。利用RT-PCR方法初步鉴定筛选19个根差异基因片段,结果显示基因3、5、14、16、18和19只在烟草的根中表达,其中基因18和19在根中的表达量丰富,基因3、5和14的表达量次之。基因1、2、6、11和17在根、花和果实等器官中都有表达,其中基因17在烟草根中的表达量大于在花和果实中表达量。基因12和13在烟草的根和茎中都有表达,基因13在根和茎中的表达量相当,而基因12在根中的表达量小于在茎中的。基因8在根、叶、花和果实中都有表达,以在根中的表达量最丰富。基因7、9和15在所有烟草器官中都有表达,不具有组织特异性。以福建省特色烤烟品种翠碧一号叶片总DNA为模板,通过设计引物利用PCR方法分离出受细菌诱导启动子PP1和PP3。将PP1和PP3启动子构建到克隆载体pGEM-T中并进行测序。PP1启动子的长度为1291bp,与GenBank上登录的序列的同源性为99%;PP3启动子的长度为222 bp,与GenBank上登录序列的同源性为99%。构建了由启动子PP1和PP3驱动的抗病基因(烟草几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因和花生胰蛋白酶抑制基因)的6个植物表达载体,分别命名为PPPP1、PPGP1、PPCP1、PPPP3、PPCP3和PPGP3。本研究筛选鉴定出的根特异表达基因片段,为克隆根特异基因启动子奠定了基础;构建的6个含诱导表达启动子与抗病基因的植物表达载体,可用于烟草抗青枯病分子育种研究。
钱秋芳[10]2008年在《ipt基因表达载体的构建及其水稻遗传转化研究》文中指出植物叶片衰老是叶片发育的最后阶段。叶片衰老过程有着很重要的实际价值,因为当叶片衰老进行时,植物的营养成分可以转运到植物其它的生长部位,使营养物质得以再利用。然而在农业生产上,叶片衰老会带来不利影响,它将极大地限制作物产量潜力的发挥。水稻生育后期叶片过早衰老,导致同化能力降低,制约着水稻产量的进一步提高,细胞分裂素是一种重要的延缓植物叶片衰老进程的植物激素,ipt基因是细胞分裂素生物合成的关键酶基因,将叶片衰老特异表达的启动子PSAG12与ipt基因融合构成嵌合基因后再导入水稻中,可以特异性地提高转基因水稻体内的细胞分裂素水平,从而有效地延缓水稻叶片的衰老,为提高水稻的产量探索一条新的途径。本研究克隆了ipt基因及启动子PSAG12,并构建了适合水稻转化的表达载体,通过农杆菌介导法将其导入水稻并进行相应的分子检测,主要研究结果如下:1.以根癌土壤农杆菌C58 Ti质粒为模板,采取PCR方法,克隆了ipt基因,序列测定结果表明,插入片段全长723bp,包含了该基因完整的编码阅读框,与发表的ipt基因核苷酸同源性为100%(AE009419)。2.根据已知的PSAG12启动子序列设计引物,成功从拟南芥基因组中克隆SAG12基因5’侧翼1522bp启动子区域,与GenBank上公布的SAG12基因(ATU37336)的上游序列有99%的核苷酸序列同源性。3.通过一系列的酶切、电泳、目的片断的回收过程,将ipt基因和PSAG12启动子克隆到双元表达载体pCAMBIA1301上,构建出pCAMBIA1301-SAG12-ipt表达载体。4.通过冻融法将植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105,PCR筛选出阳性克隆,获得含有目的基因的工程菌。以水稻品种中花16和浙大H02-117的胚性愈伤为材料,进行农杆菌介导的遗传转化,通过潮霉素筛选,共获得37株抗性植株,经过PCR初步检测,4株为阳性植株,其中水稻品种中花16和浙大H02-117各2株。
参考文献：
[1]. 水稻种子蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的特异表达[D]. 申佩弘. 广西大学. 2003
[2]. 转金属硫蛋白基因水稻的特异表达及其对重金属抗性的研究[D]. 卢碧霞. 西北农林科技大学. 2006
[3]. 植物双组分信号系统调控雌配子体发育的研究及其相关基因家族在白菜中的鉴定、进化和表达分析[D]. 刘振宁. 浙江大学. 2016
[4]. 大豆贮藏蛋白基因启动子的克隆与功能分析[D]. 张宇. 吉林农业大学. 2007
[5]. 水稻叶片衰老特异性启动子的克隆和利用及剑叶早期衰老上升表达基因的鉴定[D]. 刘莉. 华中农业大学. 2008
[6]. 柳枝稷根及维管束组织特异性启动子的分离鉴定[D]. 许文志. 四川农业大学. 2015
[7]. 热激启动子驱动基因删除及ipt基因遗传转化杜仲的研究[D]. 李岩. 贵州大学. 2006
[8]. 转ipt-bar双价基因对水稻生长发育影响的研究[D]. 段永波. 贵州大学. 2007
[9]. 烟草根特异表达基因的筛选鉴定与启动子的克隆[D]. 兰岚. 福建农林大学. 2008
[10]. ipt基因表达载体的构建及其水稻遗传转化研究[D]. 钱秋芳. 重庆大学. 2008
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