IgA与麻疹病毒的胞内相互作用

论文摘要

黏膜及其相关的黏膜免疫是机体抵御外界病原体入侵的第一道防线,分泌型IgA（Secretory Immunoglobulin A）抗体（S-IgA）是这道防线中重要的特异性效应因子。与血清型IgG等抗体不同的是,分泌型IgA抗体通常由多聚免疫球蛋白受体（pIgR）介导,在黏膜上皮细胞内转运并被分泌到黏膜腔面,从而赋予IgA进入黏膜上皮细胞内的活性并具备在细胞内与入侵病原相互作用的机会和能力。研究表明,在分泌型IgA抗体通过黏膜上表皮细胞转运到黏膜腔面的过程中,可在胞内与病毒的多种成分特异性相互作用,并能有效抑制病毒在上皮细胞中的复制。因此,IgA抗体具有一种独特的抵御病毒感染的机制——细胞内中和。然而,不同病毒成分特异的IgA抗体在胞内如何与病毒相互作用,及相应的分子机制和效应还所知甚少。本论文采用经典杂交瘤技术和梯度稀释方法筛选得到两株麻疹病毒P（phosphoprotein）蛋白特异的IgA抗体anti-P 1D11-IgA和anti-P 7F1-IgA,并采用聚碳酸酯膜Transwell极化单层细胞系统,对这两株单克隆IgA抗体与麻疹病毒的胞内相互作用、抑制病毒复制的效应及其分子机制进行了系统研究。研究发现:首先两株IgA抗体都能与Transwell系统中感染麻疹病毒的Vero-pIgR细胞中的病毒P蛋白特异性结合。进一步验证IgA抗体的胞内中和能力时我们发现:仅anti-P 1D11-IgA抗体在Vero-pIgR细胞中具有胞内中和病毒的能力,anti-P 7F1-IgA抗体在同样干扰素缺陷的Vero-pIgR细胞中无法中和病毒,在Caco-2细胞中却有显著抑制病毒复制的能力。这提示我们针对同一靶标抗原的两株特异性IgA抗体,是通过不同的机制与病毒相互作用,从而抑制病毒复制,因此我们分别针对两株IgA抗体与病毒作用的分子机制展开了研究。首先我们确认了anti-P 1D11-IgA抗体在麻疹病毒P蛋白上的关键性结合位点位于P蛋白N端第23位脯氨酸上,经过免疫共沉淀实验检验anti-P 1D11-IgA抗体通过干扰P蛋白N端α-分子识别元件（α-MoRE）与麻疹病毒N蛋白的结合,破坏P-N复合物结构。由于P-N复合物结构和功能的稳定是麻疹病毒基因组转录复制中心RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）行使功能的重要基础,因此通过RT-PCR实验我们发现anti-P 1D11-IgA抗体在感染病毒的细胞内可致使病毒基因组和mRNA合成的减少,最终减少子代病毒的产生。而与anti-P 1D11-IgA抗体不同的是,anti-P 7F1-IgA抗体在麻疹病毒P蛋白上的特异性结合位点位于P蛋白N端77-86位氨基酸上。并且在感染病毒的Caco-2细胞中发现anti-P 7F1-IgA抗体的胞内中和病毒能力优于anti-P 1D11-IgA抗体。通过ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）和RT-PCR（Real Time-Polymerase Chain Reaction）检测发现anti-P 7F1-IgA抗体能够促进IFN-β的产生和干扰素刺激基因的表达,因此我们推测anti-P 7F1-IgA抗体可以通过阻碍病毒免疫逃逸Ⅰ型干扰素来中和病毒。在免疫共沉淀实验中发现,anti-P 7F1-IgA抗体与麻疹病毒P蛋白的相互作用,阻碍了P蛋白与JAK1蛋白和STAT1蛋白结合。进一步使用Western Blot监测感染细胞中的蛋白表达,确认anti-P 7F1-IgA抗体可使磷酸化的JAK1蛋白和STAT1在感染病毒细胞内更早的产生。激光共聚焦观察也显示,在anti-P 7F1-IgA抗体存在下,感染病毒的细胞内STAT1蛋白能更有效的进行核转位。最终在293T细胞中,我们通过验证蛋白相互作用证明anti-P 7F1-IgA抗体可以阻碍麻疹病毒P蛋白与JAK1蛋白和STAT1蛋白的结合,激活I型干扰素信号通路的转导,通过赋予宿主细胞更有效的天然免疫功能来抑制病毒的复制。虽然针对同一靶标抗原——麻疹病毒P蛋白,但是两株特异性的IgA抗体却是分别通过破坏病毒基因组转录复制过程中关键复合物的结构或者通过阻碍病毒逃逸宿主天然免疫这两种途径来抵御病原体。这启示我们IgA抗体在细胞内与病毒成分的相互作用不仅仅只是结合。由于IgA抗体针对病毒结合的特异性,IgA抗体可以靶向病毒复制过程中的单个关键结构功能组分P蛋白,还可以通过针对病毒基因组转录复制的重要复合体或者病毒颗粒组装的核心连接蛋白等来进行中和病毒。另一方面,IgA抗体可以协调病毒与细胞相互作用,抑制病毒免疫逃逸的能力,增强细胞天然免疫,并最终发挥抗病毒功效。总而言之,IgA抗体与病毒相互作用的分子机制的研究,为病毒或者细胞成分是否可作为药物靶点提供了理论依据,为抗病毒疫苗提供了理论基础。

论文目录

摘要

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第1章引言

1.1 黏膜免疫系统与IgA抗体

1.1.1 黏膜免疫系统与黏膜上表皮细胞

1.1.2 分泌型IgA（Secretory IgA）抗体

1.1.3 分泌型IgA抗体在黏膜上表皮细胞中的转运

1.1.4 分泌型IgA抗体重要功能

1.1.5 单克隆抗体技术与抗体转型

1.1.5.1 单克隆抗体技术与有限稀释法

1.1.5.2抗体类别转换

1.1.6 Transwell通透膜系统

1.2 麻疹病毒与病毒蛋白

1.2.1 麻疹病毒

1.2.2 麻疹病毒外在蛋白

1.2.3 麻疹病毒内在蛋白

1.3 论文的选题和意义

第2章材料与方法

2.1 实验仪器、试剂和耗材

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验耗材

2.1.4 生物耗材

2.1.5 培养基、缓冲液以及溶液配方

2.2 实验方法

2.2.1 细胞传代,复苏,冻存

2.2.2 麻疹病毒培养

2.2.3 麻疹病毒滴度检测

2.2.4 Vero-pIgR细胞和Caco-2 细胞的培养以及Transwell系统的铺置

2.2.5 Western Blot检测蛋白含量

2.2.6 ELSIA

2.2.7 经典中和实验

2.2.8 抗体胞内中和病毒实验

2.2.9 单克隆抗体制备

2.2.10 激光共聚焦观察蛋白共定位

2.2.11 质粒转染

2.2.12 免疫共沉淀

2.2.13 病毒RNA提取

2.2.14 荧光定量PCR

2.2.15 统计学分析

第3章实验结果

3.1 筛选得到两株针对麻疹病毒磷酸化蛋白特异性IgA抗体

3.1.1 检测麻疹病毒磷酸化蛋白特异性IgA抗体在细胞中转运效率

3.1.2 检测anti-P1D11-IgA和 anti-P7F1-IgA抗体在胞内特异性结合麻疹病毒P蛋白

3.2 麻疹病毒特异性IgA抗体通过识别P蛋白a-MoRE元件干扰P-N复合物的结构和功能从而抑制麻疹病毒的复制

3.2.1 检测anti-P1D11-IgA抗体胞内中和麻疹病毒效率

3.2.2 确定麻疹病毒P蛋白特异性IgA抗体anti-P1D11-IgA抗体在P蛋白上的结合位点

3.2.3 Anti-P1D11-IgA在 Vero-pIgR细胞中阻碍P蛋白与N蛋白的相互作用

3.2.4 Anti-P1D11-IgA抗体抑制麻疹病毒的转录和复制

3.2.5 Anti-P1D11-IgA抗体小结

3.3 麻疹病毒P蛋白特异性IgA抗体阻碍麻疹病毒逃逸宿主I型干扰素

3.3.1 anti-P7F1-IgA抗体在Vero-pIgR细胞中无法抑制麻疹病毒复制,而在Caco-2 细胞中可以抑制病毒复制

3.3.2 确认anti-P7F1-IgA抗体在麻疹病毒P蛋白上的特异性结合位点

3.3.3 anti-P7F1-IgA抗体在Caco-2 细胞中可以恢复I型干扰素的表达

3.3.4 anti-P7F1-IgA抗体阻碍麻疹病毒P蛋白与JAK1和STAT1 蛋白的结合

3.3.5 anti-P7F1-IgA在 Caco-2 细胞中可以恢复STAT1和JAK1 蛋白的磷酸化水平

3.3.6 anti-P7F1-IgA在 Caco-2 细胞中可以恢复STAT1 蛋白入核

3.3.7 anti-P7F1-IgA在 Caco-2 细胞阻碍麻疹病毒P蛋白与JAK1 蛋白和STAT1 蛋白结合。

3.3.8 anti-P7F1-IgA抗体小结

第4章讨论

4.1 针对P-N复合物其他关键结构筛选特异性IgA抗体

4.2 针对麻疹病毒属其他病毒P23 位点筛选特异性IgA抗体

4.3 anti-P7F1-IgA抗体是否具有阻碍麻疹病毒V蛋白逃逸干扰素通路的功能

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杨益

导师: 鄢慧民

关键词: 抗体,麻疹病毒,胞内中和,复合物,型干扰素

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

分类号: R373.11

总页数: 115

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IgA与麻疹病毒的胞内相互作用

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