基于链交换扩增SEA新方法对金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究

论文摘要

金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌,由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒事件频繁发生。发展一种对金黄色葡萄球菌的快速检测方法具有重要的意义,目前对金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统培养法、免疫学检测法、分子生物学检测法,这些方法都存在不可避免的缺点,传统培养法检测周期长,操作繁琐;免疫学检测法检测灵敏度低;分子生物学检测法操作过程比较复杂,不利于现场快速检测,因此建立一种简单、快速的对食源性致病菌金黄色葡萄球菌的检测方法是必不可少的。本文构建了一种新的链交换扩增（Strand Exchange Amplification,SEA）检测方法,该方法采用变性气泡介导的链交换原理,在等温条件下1小时内完成扩增反应,结合比色法,仅需要一台金属浴就可以完成对金黄色葡萄球菌的检测,结果判定肉眼可视化,检测过程简单、快速。本文用SEA法对金黄色葡萄球菌进行了可行性研究,实现了对金黄色葡萄球菌检测方法的建立。为了进一步实现SEA检测方法对实际样品的检测能力,用SEA法对金黄色葡萄球菌进行了灵敏性、特异性、抗干扰性研究,检测限低至1.0×10-1414 M。SEA检测方法分别检测了总核酸（DNA和RNA）、DNA和RNA,实验结果表明SEA检测方法实现了无需额外的反转录可以一步法检测金黄色葡萄球菌RNA,并且检测RNA的效率高于检测DNA的效率。检测结果判别可以荧光判读,也可以通过反应体系颜色的转变,肉眼比色判读检测结果,结果操作简单便捷,不依赖于专业人员、昂贵仪器,检测结果准确。SEA方法的建立主要是为了对实际样品的检测,因此,本论文又对人工加标的猪肉样品进行检测,结果表明,SEA法最低可以检测到浓度为2 cfu/g污染的人工加标猪肉制品,满足对金黄色葡萄球菌检测标准的要求,然后又进一步对市场上抽样的112份肉制样品牛肉、猪肉、鸡肉、鱼干和火腿肠进行检测,结果表明用SEA法与传统的培养方法对比研究,SEA检测阳性率与传统培养法一致。说明SEA检测实际样品中的金黄色葡萄球菌方法可靠,有实际应用价值。本文构建了全新的RNA一步法等温扩增技术平台,整个检测过程具备简单、快速、无设备、可视化的特点,SEA检测方法也可集成到微流控芯片中,实现样本在单个设备中应答诊断,为食品中的其他致病菌提供一个即时检测平台。

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摘要

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第一章绪论

1.1 金黄色葡萄球菌简介

1.2 金黄色葡萄球菌检测方法

1.2.1 传统微生物学检测法

1.2.2 免疫学检测法

1.2.3 分子生物学检测法

1.3 本论文的研究目的及意义

第二章变性泡介导的链交换引发的等温核酸检测方法对金黄色葡萄球菌的检测研究

2.1 引言

2.2 试验材料

2.2.1 菌株

2.2.2 试剂

2.2.3 主要实验仪器

2.2.4 变性泡介导的链交换扩增反应引物设计

2.2.5 溶液的配置

2.3 试验方法

2.3.1 金黄色葡萄球菌菌种的活化、培养和保藏

2.3.2 金黄色葡萄球菌中提取基因组DNA

2.3.3 金黄色葡萄球菌DNA/RNA共提

2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4 基于变性泡介导的链交换扩增反应体系

2.5 结果讨论

2.5.1 金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳表征

2.5.2 变性泡介导的链交换扩增反应扩增温度的研究

2.5.3 可行性试验

2.5.4 灵敏性实验

2.5.5 特异性和抗干扰实验

2.5.6 比色实验

2.5.7 一步法检测金黄色葡萄球菌RNA

2.6 小结

第三章变性泡介导的链交换核酸扩增方法检测肉制品中金黄色葡萄球菌的研究

3.1 引言

3.2 试验材料

3.2.1 菌株

3.2.2 试剂

3.2.3 主要实验仪器

3.3 试验方法

3.3.1 金黄色葡萄球菌基因组DNA的热裂解提取

3.4 结果讨论

3.4.1 SEA方法对人工污染加标猪肉样品的检测

3.4.2 SEA对实际样品肉制品的检测

3.5 小结

第四章结论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘彩艳

导师: 王宗花,石超

关键词: 金黄色葡萄球菌,等温核酸检测,一步法,可视化检测

来源: 青岛大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 青岛大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27262/d.cnki.gqdau.2019.000064

总页数: 43

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