托品烷生物碱生物合成途径中三个新基因的发现与功能鉴定

论文摘要

天然产物（Natural Products）是药物的重要来源,在治疗疾病、维护健康和改善生活质量等方面起到十分重要的作用。托品烷生物碱（Tropane Alkaloids,TAs）是一类具有独特托品烷骨架（Tropane Skeleton）的生物碱。莨菪碱（Hyoscyamine）和东莨菪碱（Scopolamine）是TAs中最具代表性的药物,在临床上作为抗胆碱药物用于麻醉镇痛、止咳平喘、治疗晕动症和农药中毒等。茄科药用植物如颠茄（Atropa belladonna）、曼陀罗（Datura species）和澳洲毒茄杂交种（Dubiosia×hybrid）是生产TAs的主要来源。颠茄为国内外多部药典收录且大规模人工种植,是最为重要的生产TAs的药用植物。颠茄叶片中TAs含量很低,莨菪碱含量一般为0.2%干重（Dry Weight,DW）,东莨菪碱含量一般为0.02%DW。莨菪碱和东莨菪碱的市场需求巨大,来源十分有限,导致其药物资源短缺。代谢工程技术和合成生物学技术被认为是解决药物资源短缺问题最为有效的方法,但是代谢工程和合成生物学都依赖于鉴定生物合成途径中的基因/酶。迄今为止,共有9个TAs生物合成途径基因/酶被鉴定,而关于还原苯丙酮酸、活化苯乳酸、合成海螺碱和还原莨菪醛的酶/基因还有待发现。本研究针对TAs生物合成途径中的三个酶促反应,包括还原苯丙酮酸、活化苯乳酸和合成海螺碱,采用分子生物学、生物信息学、生物化学和生物技术等多学科的理论、方法和技术,寻找并鉴定编码这些TAs生物合成酶的新基因,具体包括:苯丙酮酸还原酶基因（Phenylpyruvate Reductase,PPR）、苯乳酸UDP-糖基转移酶（Phenyllactate UDP-Glycosyltransferase,PLA-UGT）和海螺碱合成酶（Littorine Synthase,LS）。本研究取得的主要结果如下:1.苯丙酮酸还原酶基因（PPR）的克隆与功能鉴定（1）PPR的克隆与生物信息学分析。对颠茄转录组中16个甘油酸脱氢酶基因和已报道的TAs生物合成途径基因进行表达相关性分析,锁定并克隆了一个在侧根中高水平表达的候选基因,并将其命名为PPR。PPR与微生物PPR（Phenylpyruvate Reductase,PPR）和植物HPPR（Hydroxylphenylpyruvate Reductase,HPPR）具有共同起源,属于NAD（P）H依赖的脱氢酶家族。PPR在氨基酸序列上与微生物PPR和植物HPPR差异较大。（2）PPR的催化活性鉴定与动力学分析。在大肠杆菌中表达并纯化了携带6个组氨酸标签的PPR（6×His-tagged PPR）。催化活性分析结果显示,PPR不仅能催化苯丙酮酸还原为苯乳酸,而且也能催化p-羟基苯丙酮酸还原为为p-羟基苯乳酸。PPR对苯丙酮酸和p-羟基苯丙酮酸的Km分别为2.77±0.39 mM和2.25±0.34 mM,表明其对这两个不同底物的亲和力没有显著差异。PPR对苯丙酮酸和p-羟基苯丙酮酸的Kcat/Km分别为108.30±4.33 S-1·M-1和12.88±0.44 S-1·M-1,表明PPR还原苯丙酮酸的效率比还原p-羟基苯丙酮酸效率高8.41倍。上述研究结果表明PPR的主要功能是还原苯丙酮酸生成苯乳酸。（3）PPR的组织表达分析。采用qPCR检测了PPR在颠茄侧根、主根、茎和叶中的表达量,结果显示PPR在根中特异表达,在侧根中的表达量远高于其在主根中的表达量。PPR的组织表达模式与已报道的TAs生物合成基因的组织表达模式高度类似。为进一步研究PPR在侧根中表达情况,克隆了该基因1195 bp的启动子（pPPR）,并获得了转化pPPR::GUS的颠茄毛状根。GUS组织化学染色的转基因毛状根切片结果发现,pPPR特异性的在中柱鞘和内皮层细胞中发挥作用。这与颠茄的腐胺N-甲基转移酶基因（Putrescine N-methyltransferase,PMT）和莨菪碱6β-羟化酶基因（Hyoscyamine6β-hydroxylase,H6H）启动子在中柱鞘特异表达的结果基本一致。（4）PPR-RNAi颠茄毛状根中相关代谢产物的含量分析。为进一步研究PPR在TAs生物合成中的作用,采用RNAi技术获得了干扰PPR的颠茄毛状根。分子检测结果表明,PPR-RNAi颠茄毛状根中该基因表达量仅为对照的18.7441.92%。所有PPR-RNAi毛状根株系中苯乳酸含量均大幅降低,仅为对照的0.486.41%。当PPR被干扰后,毛状根中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量与对照毛状根相比均大幅度下降。在PPR-RNAi毛状根中,莨菪碱含量为对照的0.499.14%,山莨菪碱为对照的2.2921.56%,东莨菪碱为对照的4.5140.60%。抑制PPR导致了其直接产物苯乳酸和相关TAs含量的大幅度下降,表明PPR参与了TAs的生物合成。2.苯乳酸UDP-糖基转移酶基因（PLA-UGT）的克隆与功能鉴定（1）PLA-UGT的克隆与生物信息学分析。对颠茄转录组中102个糖基转移酶基因进行表达相关性分析,锁定了5个unigene作为候选基因进一步开展生物信息学分析。分子系统进化分析结果发现,abalocus19485与拟南芥AT4G15480.1和AT3G21560.1聚在一起,表明abalocus19485可能具有与这两个拟南芥UGT类似的功能,即催化苯丙烷类化合物和UDP-葡萄糖生成糖酯类化合物。因此推测abalocus19485最有可能是PLA-UGT。（2）PLA-UGT的组织表达分析。PLA-UGT的组织表达模式与PPR以及已报道的TAs生物合成基因的组织表达模式高度类似,即在根中特异表达,在侧根中的表达量远高于其在主根中的表达量。为进一步研究PLA-UGT在侧根中表达情况,克隆了该基因1329bp的启动子（pPLA-UGT）,并获得了转化pPLA-UGT::GUS的颠茄毛状根。GUS组织化学染色的转基因毛状根切片结果发现,pPLA-UGT在中柱鞘和内皮层细胞中发挥作用。（3）PLA-UGT的催化活性鉴定。在大肠杆菌中表达并纯化了携带6个组氨酸标签的PLA-UGT（6×His-tagged PLA-UGT）。由于没有苯乳酰葡萄糖的标准品,本研究采用高分辨质谱鉴定相关化合物。催化活性分析结果显示,新产物的保留时间为3.80 min,其质荷比值为327.1084,与负离子形式的苯乳酰葡萄糖准分子离子的质荷比一致,表明PLA-UGT催化苯乳酸和UDP-葡萄糖生成了苯乳酰葡萄糖。（4）抑制PLA-UGT对TAs相关代谢物生物合成的影响。采用病毒诱导的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing,VIGS）方法,在颠茄幼苗中沉默PLA-UGT。qPCR检测结果显示,在PLA-UGT-VIGS颠茄侧根中,其表达量仅为对照的9.89%。PLA-UGT-VIGS颠茄中莨菪碱含量仅为对照的30.88%。沉默PLA-UGT研究结果初步表明该基因参与TAs生物合成。为进一步确证PLA-UGT的功能,采用RNAi技术获得了抑制PLA-UGT的颠茄毛状根。分子检测结果显示RNAi毛状根中PLA-UGT的表达量较对照大幅度降低,仅为对照的7.5511.99%。基于质谱的代谢产物分析结果发现,PLA-UGT干扰毛状根株系中海螺碱、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量较对照都大幅度下降。PLA-UGT干扰毛状根中海螺碱含量为对照的7.1221.50%,莨菪碱含量为对照的3.6514.29%,山莨菪含量为对照的7.2035.20%,东莨菪碱含量为对照的6.0225.30%。PLA-UGT干扰毛状根中托品的含量较对照出现了更高水平的积累,为对照的2.333.03倍。抑制PLA-UGT的研究结果表明该基因参与TAs的生物合成。3.海螺碱合成酶酶基因（LS）的克隆与功能鉴定（1）LS的克隆与生物信息学分析。对颠茄转录组中33个丝氨酸羧肽酶基因进行表达相关性分析,锁定abalocus17884作为候选基因进一步开展生物信息学分析。分子系统进化分析结果发现,abalocus17884与功能验证的AtSAT、AtSCT、AtSMT、AtSST、BnSCT1、BnSCT2和CtAT1聚在一起。所有这些基因都属于丝氨酸羧肽酶类-酰基转移酶（Serine Carboxylpeptidase-like Acyltransferase,SCPL-AT）,具有催化苯丙烷类糖酯化合物与特定酰基受体酯化缩合的功能。推测abalocus17884可能具有酯化酶的功能,将其命名为海螺碱合成酶基因（Littorine Synthase,LS）。（2）LS的组织表达分析。LS在颠茄的根中特异性表达,在侧根中的表达水平比主根中的高。为进一步研究LS在侧根中表达情况,克隆了该基因1629 bp的启动子（pLS）,并获得了转化pLS::GUS的颠茄毛状根。GUS组织化学染色的转pLS::GUS毛状根切片结果发现,pLS在内皮层和中柱鞘细胞中高水平表达。（3）抑制LS对TAs相关代谢物生物合成的影响。采用VIGS在颠茄幼苗中沉默LS。在LS-VIGS颠茄侧根中,其表达量仅为对照的19.95%,LS-VIGS颠茄中莨菪碱含量仅为对照的30.04%。沉默LS研究结果初步表明该基因参与TAs生物合成。为进一步确证LS的功能,采用RNAi技术获得了抑制LS的颠茄毛状根。分子检测结果表明,LS-RNAi颠茄毛状根中LS的表达量较对照大幅度降低,仅为对照的3.7920.35%。基于质谱定量的代谢产物分析结果发现,LS干扰毛状根中TAs（海螺碱、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱）都大幅度下降。在LS-RNAi毛状根株系ILS-1和ILS-5中,4种TAs处于痕量水平。对托品和苯乳酸的含量检测结果发现,LS-RNAi毛状根中这两种TAs的前体化合物含量较对照显著提高。抑制LS的研究结果表明,该基因参与TAs的生物合成。（4）采用合成生物学技术鉴定LS的功能。LS属于SCPL-AT,前人研究表明SCPL-AT通常需要翻译后加工才具有活性。在烟草叶片中瞬时表达携带HA标签的LS,western blot检测发现LS在翻译后被切割成不同肽段。基于western blot检测结果,同时由于无法制备获得LS的前体苯乳酰葡萄糖,本研究采用在烟草中重建海螺碱合成途径的方法验证LS的功能。在向烟草叶片注射托品和苯乳酸的情况下,在烟草叶片中单独表达LS时,能够检测到痕量的海螺碱;而LS和PLA-UGT共表达时,海螺碱含量约为单独表达LS时的8.5倍。在YFP（阴性对照）和单独表达PLA-UGT的烟草叶片中均没有海螺碱生成。上述研究结果表明LS具有合成海螺碱的功能。综上所述,本研究针对TAs生物合成途径中有待发现的新基因开展了相关研究,从颠茄中鉴定了TAs生物合成途径中三个新基因,包括PPR、PLA-UGT和LS。这三个基因具有类似的组织表达模式,表现为在侧根中特异性/高水平表达,且PPR、PLA-UGT和LS主要在侧根中柱鞘和内皮层中表达。PPR能够高效率催化苯丙酮酸还原为苯乳酸,PLA-UGT能够催化苯乳酸和UDP-葡萄糖生成苯乳酰葡萄糖,LS的功能是合成海螺碱。转基因研究结果表明,分别抑制PPR、PLA-UGT和LS都会导致TAs含量的大幅度下降。PPR、PLA-UGT和LS的发现和功能鉴定,不仅在分子生物学和生物化学方面解析了TAs生物合成途径的三个酶促反应步骤,也为今后利用这些新基因开展TAs的代谢工程和合成生物学研究提供了必需基因。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 托品烷生物碱

1.2 托品烷生物碱生物合成途径

1.2.1 鸟氨酸脱羧酶

1.2.2 腐胺N‐甲基转移酶

1.2.3 N‐甲基腐胺氧化酶

1.2.4 Ⅲ型聚酮合酶

1.2.5 托品酮合成酶

1.2.6 托品酮还原酶

1.2.7 芳香族氨基酸氨基转移酶

1.2.8 海螺碱变位酶

1.2.9 莨菪碱6β‐羟化酶

1.3 托品烷生物碱代谢工程研究

1.4 托品烷生物碱合成生物学研究

第2章绪论

2.1 选题依据、研究目的与意义

2.2 拟解决的科学问题

2.3 研究内容和技术路线

第3章苯丙酮酸还原酶基因克隆与功能分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 常规仪器设备

3.1.3 分子生物学试剂及试剂盒

3.1.4 生化试剂以及耗材

3.1.5 常规试剂与培养基的配置

3.1.6 常规分子生物学实验方法

3.1.7 苯丙酮酸还原酶候选基因筛选

3.1.8 构建颠茄RACE文库

3.1.9 PPR基因全长序列的获取

3.1.10 合成颠茄第一链cDNA

3.1.11 cDNA全长序列扩增

3.1.12 PPR生物信息学分析

3.1.13 PPR重组蛋白表达以及纯化

3.1.14 PPR重组蛋白质浓度测定

3.1.15 PPR重组蛋白催化活性测定

3.1.16 PPR最适反应条件以及酶动力学参数

3.1.17 PPR组织表达分析

3.1.18 PPR干扰毛状根获取及分子检测

3.1.19 PPR启动子克隆以及组织化学染色

3.1.20 毛状根中苯乳酸和苯丙酮酸含量测定

3.1.21 TAs提取及含量测定

3.2 结果与分析

3.2.1 筛选苯丙酮酸还原酶基因

3.2.2 克隆颠茄PPR的 cDNA序列

3.2.3 PPR的生物信息学分析

3.2.4 PPR重组蛋白催化活性测定

3.2.5 PPR重组蛋白质最适反应条件

3.2.6 PPR重组蛋白质酶动力学参数

3.2.7 PPR组织表达和启动子组织化学染色分析

3.2.8 获得RNAi干扰PPR的颠茄毛状根和相关分子检测

3.2.9 RNAi干扰PPR对苯乳酸和苯丙酮酸含量的影响

3.2.10 RNAi干扰PPR对 TAs含量的影响

3.3 小结与讨论

第4章苯乳酸UDP‐糖基转移酶基因克隆与功能分析

4.1 材料与方法

4.1.1 试剂

4.1.2 PLA‐UGT蛋白质纯化以及酶促催化反应

4.1.3 采用VIGS在颠茄中瞬时沉默PLA‐UGT

4.1.4 PLA‐UGT干扰颠茄毛状根获得和分子检测

4.1.5 UPLC‐MS/MS测定颠茄毛状根中代谢物的含量

4.1.6 GC‐MS检测转基因毛状根中托品的含量

4.2 结果与分析

4.2.1 组织表达相关性筛选糖基转移酶候选基因

4.2.2 PLA‐UGT候选基因的筛选

4.2.3 PLA‐UGT克隆

4.2.4 PLA‐UGT生物信息学分析

4.2.5 PLA‐UGT重组蛋白催化活性鉴定

4.2.6 PLA‐UGT的组织表达以及启动子组织化学染色分析

4.2.7 采用VIGS在颠茄植株中沉默PLA‐UGT

4.2.8 获得RNAi干扰PLA‐UGT的颠茄毛状根和相关分子检测

4.2.9 RNAi干扰PLA‐UGT对 TAs含量的影响

4.2.10 RNAi干扰PLA‐UGT对托品和苯乳酸含量的影响

4.3 小结与讨论

第5章海螺碱合成酶基因克隆与功能分析

5.1 材料与方法

5.1.1 植物表达载体

5.1.2 Western blot检测瞬时转化烟草表达的蛋白

5.1.3 瞬时转化烟草叶片鉴定LS的功能

5.2 结果与分析

5.2.1 海螺碱合成酶候选基因的筛选与克隆

5.2.2 LS的生物信息学分析

5.2.3 LS的组织表达以及启动子组织化学染色分析

5.2.4 采用VIGS在颠茄植株中沉默LS

5.2.5 获得RNAi干扰LS的颠茄毛状根和相关分子检测

5.2.6 RNAi干扰LS对 TAs含量的影响

5.2.7 RNAi干扰LS对托品和苯乳酸含量的影响

5.2.8 Western blot分析LS翻译后加工

5.2.9 采用合成生物学手段鉴定LS的功能

5.3 小结与讨论

第6章结论与展望

6.1 结论

6.2 特色与创新

6.3 展望

参考文献

附录

致谢

学习期间发表论文及参加课题

文章来源

类型: 博士论文

作者: 邱飞

导师: 廖志华

关键词: 托品烷生物碱,苯丙酮酸还原酶,苯乳酸糖基转移酶,海螺碱合成酶,生物合成

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

基金: 国家转基因科技重大专项“作物抗病虫调控回路设计技术”(2019ZX08010-004),国家自然科学基金“WRKY 类转录因子在托品烷类生物碱生物合成中的调控作用研究” (31370333),国家自然科学基金“莨菪碱转运分子机理与代谢工程研究”(31770335)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2019.000072

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