石海英[1]2003年在《利用酵母双杂交系统研究大麦黄矮病毒（BYDV）和小麦间的互作》文中认为酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)是研究蛋白质间相互作用的一种有效方法。该系统能迅速、敏感地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作，并可快速获得目的蛋白的编码基因，具有操作简便、灵敏度高的特点，已在植物病毒学的很多领域得到应用。本研究利用该系统对大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus BYDV)和寄主小麦之间的相互作用进行研究，为该病毒运动模式研究进行初步探索。 根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白。 利用SD选择性培养基和酵母共转化阳性对照实验分别对酵母菌株AH109、Y187和载体pGADT7-Rec进行检测，结果表明，菌株和载体符合双杂交分析的要求。通过将pGBKT7-GPV-CP或pGBKT7-GPV-MP、小麦cDNA文库和pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞，铺在SD选择性培养基上筛选，半乳糖苷酶发色检测，结果未检测到相互作用的发生，说明小麦cDNA文库中可能没有与BYDV发生相互作用的寄主因子。利用酵母匹配进行筛选得出的结果与共转化筛选结果相一致，进一步证明了上述结论。
陶烨[2]2016年在《大麦黄矮病毒GAV与二穗短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究》文中研究说明大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是一类在世界范围内广泛分布的重要禾谷类作物病毒,仅通过麦蚜传播,能够侵染多种禾本科作物,引起黄矮病,对世界范围内的农业生产造成了严重损失。在我国,BYDVs主要侵染小麦(Triticum aestivum),导致叶片黄化、分蘖减少等症状,其中造成危害最主要的病原之一是BYDV-GAV。因此,为了更好的控制由BYDV-GAV引起的小麦黄矮病,我们需要对病毒和寄主之间的互作关系,以及病毒的致病机制进行更加深入的了解,这对探索新型的病毒防治方法有着重要的意义。但由于小麦基因组非常庞大,且遗传转化体系不太成熟,致使在小麦上开展病毒-寄主互作及病毒分子致病机制的研究非常困难。二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是禾本科的模式植物,具有植株矮小,基因组简单且背景清晰,生命周期短和易于培养等优点。更重要的是,它和小麦的农艺性状相似,染色体组也具有很好的共线性。因此,本研究选用二穗短柄草作为模式寄主,探索了BYDV-GAV和寄主之间的互作关系,筛选和鉴定了与BYDV-GAV的互作的寄主因子,主要研究内容如下:(1)建立了二穗短柄草与BYDV-GAV的互作研究体系。通过蚜虫接种的方法,将BYDV-GAV接种到二穗短柄草Bd21-3上,接种21天后植株表现出叶片变红、严重矮化以及根部萎缩等黄矮病症状,并通过RT-PCR和TAS-ELISA的方法确认了BYDV-GAV的侵染。对健康的和感染BYDV-GAV的二穗短柄草的叶片细胞进行透射电镜观察,发现接种植株的筛管伴胞中存在病毒粒子,叶肉薄壁细胞的叶绿体结构也被严重破坏。以BYDV-GAV侵染的二穗短柄草为毒源进行了蚜传实验,表明BYDV-GAV可以在二穗短柄草之间进行传播。将BYDV-GAV同时接种至二穗短柄草和其自然寄主小麦上,观察和比较了接种21天内的症状扩展情况,并通过TAS-ELISA的方法检测了期间病毒含量的变化,结果表明,与BYDV-GAV的自然寄主小麦相比,二穗短柄草发病更早,表现出了更加严重的黄矮病症状,但病毒的积累模式与小麦非常相似。通过以上实验证明了禾本科模式植物二穗短柄草Bd21-3可以被BYDV-GAV成功侵染,侵染过程与小麦比较相似,因此可以作为研究BYDV-GAV的模式寄主。(2)筛选鉴定了与BYDV-GAV互作的寄主蛋白。首先,通过GatewayTM技术中的LR反应将二穗短柄草的入门文库成功转化成用于酵母双杂交筛选的cDNA文库,并通过半固体法对该文库进行了扩增,最终获得了滴度为1.7×107 cfu/mL的cDNA文库,可用于后续的酵母双杂交筛选。其次,通过GatewayTM技术成功构建了BYDV-GAV的外壳蛋白CP、假定的运动蛋白MP及基因沉默抑制子P6的诱饵载体,并对叁个诱饵蛋白进行了自激活检测,确定了文库筛选所需的3-AT(3-氨基叁唑)浓度为50mM。再次,通过酵母双杂交的方法,用叁个诱饵蛋白分别对二穗短柄草的cDNA酵母文库进行筛选。在SC-Leu-Trp-His+50mM 3-AT平板上获得互作子后,通过检测HIS3、URA3、Lac Z叁个报告基因的表达情况确定互作后,对互作蛋白的序列进行分析。结果表明,以CP为诱饵蛋白筛到16个与其存在弱相互作用的蛋白,包括2个假定蛋白,5个叶绿体蛋白(叶绿体磷酸果糖激酶、叶绿体转酮醇酶、叶绿体蛋白转运组件、叶绿体二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶、叶绿素a/b结合蛋白),以及动力蛋白2A、钙调蛋白3、跨膜蛋白147等;以MP为诱饵蛋白筛选到35个强互作蛋白,序列分析后主要为四个蛋白,分别是14-3-3 like蛋白、转录因子VOZ1、富甘氨酸RNA结合蛋白和26S蛋白酶体的一个亚基类似蛋白;以P6为诱饵蛋白没有筛到任何互作子。最后,将筛选到的猎物载体和诱饵载体重新转化酵母细胞验证,最终确定VOZ1与MP存在互作。(3)验证了MP与VOZ1的蛋白互作。首先,通过原核表达分别获得GST-MP和MBP-VOZ1融合蛋白进行GST pull-down实验,确定MP和VOZ1可以在体外互作。其次,通过农杆菌接种的方法,确定了MP和VOZ1在本氏烟中的亚细胞定位。结果表明,MP主要定位在核膜上,少量定位在细胞质中,VOZ1以聚集的形式在细胞质中存在。最后,通过双分子荧光互补实验(BiFC),结合农杆菌接种的方法,确定MP和VOZ1在烟草细胞内可以互作,并通过DAPI染色确定互作位置在细胞质而非细胞核。综上所述,本研究建立了二穗短柄草与BYDV-GAV的互作体系,在此基础上,以二穗短柄草为模式寄主,筛选和鉴定了和BYDV-GAV的互作蛋白,为进一步解析BYDV-GAV致病的分子机理奠定了基础。
王晶[3]2005年在《利用酵母双杂交系统筛选与大麦黄矮病毒编码蛋白互作的短肽》文中研究说明禾谷类作物的黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,简称BYDV)的侵染所引起的,在世界各国均有发生,由蚜虫进行循环性的永久传播。大麦黄矮病株系的命名,是根据各株系特异或主要的介体蚜虫来进行的。我国特有的株系GPV由麦二叉蚜和禾缢管蚜传播,GAV由麦长管蚜和麦二叉蚜传播。病毒介体专化性强,仅局限于植物的韧皮部生长且细胞内病毒含量很低,目前还没有理想的方法来防治该病毒。 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)是研究蛋白质间相互作用的一种有效方法。该系统能迅速、灵敏地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作,并可快速获得目的蛋白的编码基因,近几年来已在植物病毒学的很多领域得到应用。本研究利用双杂交系统筛选与大麦黄矮病毒GPV株系的移动蛋白和外壳蛋白以及GAV株系的移动蛋白互作的短肽,并对获得的短肽进行初步研究,为研究该病毒的致病机制,培育抗病毒小麦奠定基础。 本文根据已知的大麦黄矮病毒GAV株系和GPV株系的移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列以及GPV株系的外壳蛋白(CP)基因序列分别合成上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段后构建了酵母表达载体pGBKT7-GAV-MP、pGBKT7-GPV-MP和pGBKT7-GPV-CP用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白。 用pGBKT7-GPV-MP筛选Clontech公司的随机肽库,获得了两种和该蛋白互作的短肽,分别为:PHRGGLEWMGAIAGPV、TVSRRMRDCRQRIVCA并对这两种短肽进行了生物信息学分析,初步了解了其基本性质。然后利用获得的短肽和pGBKT7-GAV-MP共转化酵母细胞,没有检测到相互作用的发生,同样的方法检测pGBKT7-GPV-CP也没有相互作用的发生,说明这种互作是特异性发生在GPV-MP和筛选到的短肽之间的。有希望利用获得的短肽培育出短肽介导的抗病毒小麦。
曹汝菲[4]2011年在《大麦黄矮病毒运动蛋白影响植物生长发育的分子基础》文中研究表明大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV)是黄症病毒属(Luteovirus)的代表成员,该病毒依靠介体蚜虫传播、扩散而引起大麦、小麦、燕麦等多种禾谷类作物的黄矮病[1]。病毒在植物体内的传播需要17 kDa的运动蛋白(movement protein,MP)。本论文主要开展了两方面的研究:1.BYDV-MP的生化特性研究。构建了原核表达载体pET30a-MP,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,0.4 mM IPTG诱导得到与组氨酸标签的的融合蛋白,分子量约20kDa的MP。Western-blot检测到两条带,20 kDa和40 kDa,推测40 kDa是MP的同源二聚体,对20 kDa的MP切胶回收、透析纯化复性,同样检测到两条带,证实了MP的体外二聚化。构建酵母穿梭载体pGADT7-MP,进行自激活和毒性检测后,将pGADT7-MP、pGBKT7-MP共转化酵母AH109感受态细胞,铺在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His选择性培养基上,检测到相互作用的发生。利用酵母双杂交实验得出的结果与原核表达结果一致。表明MP可以在体内形成同源二聚体。2.利用转基因技术研究BYDV-MP对植物生长发育的影响。前期研究表明:MP的N端含有4个α-螺旋,使运动蛋白可以定位于核膜,C端富含精氨酸,有非特异的ssRNA结合活性。为了确定MP的关键功能域,设计引物分别扩增出MP,NMP(1-250 bp),CMP(250-500 bp)构建含有CaMV的35S强启动子的植物表达载体。转化农杆菌后flowral-dip法转化拟南芥,筛选PCR鉴定后得到转基因系。统计植株的的生长发育情况后,发现转GFP:MP的植株开花时间推迟,平均比野生型晚10天,转CMP的植株次之。推测GFP:MP、CMP在植物体内影响了植物细胞周期相关基因,而CDC48在拟南芥芽、根、花的伸长细胞以及生长点细胞中均高度表达,荧光定量PCR结果显示CDC48到转基因植株中的表达水平降低。对CDC48拟南芥T-DNA插入突变体(cdc48)的生长实验表明:CDC48的抑制或下调表达导致拟南芥植株发育迟缓。这进一步暗示了MP可能通过抑制CDC48的表达影响植物的生长发育。
参考文献：
[1]. 利用酵母双杂交系统研究大麦黄矮病毒（BYDV）和小麦间的互作[D]. 石海英. 吉林农业大学. 2003
[2]. 大麦黄矮病毒GAV与二穗短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究[D]. 陶烨. 西北农林科技大学. 2016
[3]. 利用酵母双杂交系统筛选与大麦黄矮病毒编码蛋白互作的短肽[D]. 王晶. 中国农业科学院. 2005
[4]. 大麦黄矮病毒运动蛋白影响植物生长发育的分子基础[D]. 曹汝菲. 河南农业大学. 2011