TGF-β信号与胚胎/胚胎干细胞造血调控

刘兵^[1]2004年在《TGF-β信号与胚胎/胚胎干细胞造血调控》文中提出前言 TGF-β分子通过对关键靶基因的转录调控,调节多种前体细胞的增殖、分化、凋亡和移行。原始和永久造血的有序发生是胚胎干细胞(ES细胞)及胚胎造血的共同特点。迄今,TGF-β、受体及下游信号分子SMAD在ES细胞/胚胎造血发育中的作用尚未明了。 结果 一 TGF-β1在成血-血管细胞(Hemangioblast)发生和分化中发挥不同作用。成血-血管细胞具有向造血和血管内皮细胞分化的潜能。间接证据认为:小鼠胚胎期(ED)7.0-7.5天的卵黄囊血岛结构由成血-血管细胞分化产生。基因敲除模型发现:TGF-β1、TGF-β受体Ⅱ型和TGF-β受体Ⅰ型缺失均可导致卵黄囊血岛发育缺陷,提示TGF-β信号可能参与成血-血管细胞发育的调节。鉴于目前无确凿证据证实卵黄囊阶段成血-血管细胞的存在,因此ES细胞/BL-CFC分化模型是研究成血-血管细胞发育的最佳模型。本研究首先建立了ES细胞/BL-CFC分化模型。应用无血清分化体系,小鼠ES细胞系TC1在BMP4的刺激下分化5天可形成中胚层细胞:F1k-1+细胞(3%),但不能产生BL-CFC。类似的,TC1在血清/胶原贴壁分化体系中培养4天可高效形成F1k-1+细胞(15-20%),但仍不产生BL-CFC。血清体系中,TC1悬浮分化3天形成的拟胚体中含有BL-CFC(60个/1*10~5细胞),后者在分化体系中形成形态典型的Blast集落。巢式RT-PCR检测发现:单个Blast集落表达造血(GATA-1,胚胎珠蛋白)和内皮特异性基因Tie-2。免疫荧光发现:Blast集落来源的贴壁细胞表达CD31、VE-Cadherin/CD144和UEA-Ⅰ,并可特异性吞噬低密度脂蛋白(LDL),证明其为内皮细胞。单个Blast集落的造血培养可产生原始红系前体和多种永久

刘兵^[2]2002年在《Smad5基因和胚胎造血发育的调控机制》文中认为小鼠的造血和血管系统起源于胚外中胚层。胚胎期6.5-7天时在卵黄囊形成特征性的血岛结构发生向造血和内皮细胞的分化。造血活性由卵黄囊向胎肝的转移标志由单系原始红系造血向多系永久造血的转化。胚胎造血实质是具有不同分化潜能的前体如成血-血管形成细胞、原始红系前体细胞和永久造血多能祖细胞等有序形成的过程。然而，目前对于调控上述前体细胞在哺乳动物胚胎发育中产生、增殖和分化机制的理解依然有限。近年来应用基因敲除小鼠和胚胎干细胞体外分化模型所获得的发现，揭示了某些特异性的生长因子以及转录因子在此过程中发挥的重要作用。大量证据表明： TGF-β家族通过对关键的靶基因的转录水平的调节，调控多种前体细胞的增殖、分化、移行和凋亡。随着SMADS家族的发现，对TGF-β信号传导通路形成了基本的认识。最初的体外实验表明，SMAD2和SMAD3在TGF-β、Activin下游起作用，而SMAD1和SMAD5对BMP信号发生反应。然而，各类SMAD分子在特定的造血前体细胞增殖、分化和活存调控中的角色并不清楚。在多种SMADS中，SMAD5令我们产生兴趣，基于叁个原因：1、Smad5基因敲除胚胎中发现卵黄囊的异位造血以及CFU-GM祖细胞数目增加，表明SMAD5可能是早期造血发育的负向调控基因。；2、应用反义核酸封闭Smad5可以逆转TGF-β对祖细胞增殖的抑制效应，表明它可能介导TGF-β信号转导，后者的异常，包括某些SMADS的功能异常，和白血病紧密相关；3、Smad5基因定位在人染色体5q21，此区域的缺失和急性髓系白血病和骨髓增生异常综合症相关，因此，Smad5被怀疑为白血病抑制基因。由于Smad5基因敲除胚胎存在非造血系统的缺陷，可能会影响正常的造血发育，本研究主要选择胚胎干细胞体外分化模型。目的：1，建立高效的胚胎干细胞体外定向造血分化模型。2，利用Smad5基因敲除胚胎和胚胎干细胞探讨其对不同造血前体细胞发育的调控作用。方法：集落形成实验检测不同的造血前体细胞，包括：BL-CFC、HPP-CFC、Ery-P等；流式细胞仪检测造血细胞特异性的表面分子表达；细胞形态学观察；RT-PCR检测造血相关基因在转录水平的表达。结果：1．小鼠胚胎干细胞体外诱导可形成成血-血管细胞（BL-CFC）、原始（primitive）红系前体细胞（Ery-P）、永久（definitive）红系祖细胞（BFU-E/CFU-E）、高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）等多种造血前体细胞；特别是：以6天拟胚体来源的HPP-CFC为对象，重点研究其造血再生潜能。发现ES细胞来源的HPP-CFC的增殖或自我更新特点与卵黄囊相似，而与骨髓不同，因此与拟胚体模拟胚胎造血的结论是吻合的。2．小鼠胚胎干细胞体外分化形成的拟胚体细胞可在照射的免疫缺陷型SCID小鼠体内诱导较低水平的髓系和淋系细胞，但在照射的正常小鼠体内无法形成脾结节（CFU-S）。3．Smad5基因敲除小鼠的卵黄囊（胚胎期9.0-9.5天）HPP-CFC数量和再生能力显着增加。4．Smad5-/-拟胚体中含有的HPP-CFC和CFU-Mix的数目与野生型和杂合型相比增加显着（P<0.01），叁种基因型间呈现Smad5基因相关的剂量效应。但是，CFU-GM未发现显着的区别。Smad5基因缺失并不阻止造血细胞的终末分化。RT-PCR发现Smad5-/-拟胚体中对早期造血发育很重要的转录因子SCL和AML1高表达，但对于早期造血祖细胞扩增重要的转录因子GATA2的表达明显下调。Smad5-/-HPP-CFC对低浓度TGF-β1（0.03-0.3ng/ml）的反应显着减弱;而当浓度提高至2 ng/ml时，则被完全抑制。其原因可能是：TGF-β1可通过其它受体激活型Smad分子，如：Smad2或3，来发挥抑制效应。Smad5-/-HPP-CFC的自我更新能力与野生型有显着的差别。首先是数量的差别。其次是次级HPP-CFC细胞形态学的差别。80% Smad5-/-HPP-CFC能产生次级HPP-Mix，而仅有20%的野生型HPP-CFC能产生此类集落。Smad5-/-HPP-CFC的细胞表型和分子表型是吻合的。它含有的转录因子AML1，GATA-2和造血因子受体IL-3、GM-CSF受体的水平显着提高。5．Smad5基因缺失导致BL-CFC数目显着增加（P<0.01）；同时，Smad5基因缺失导致中胚层标记短尾（Brachyury）表达下调，而Flk-1和SCL显着上调。Flk-1和SCL是BL-CFC发育的特征性标记，对中胚层细胞向成血-血管细胞的转变以及后者的扩增和迁移是必要的。叁种基因的共同变化表明：Smad5可能介导由中胚层细胞向造血特化的负向调控，并有助于解释成血-血管细胞数量的增加。6．在Smad5缺失的拟胚体中，原始红系造血相关的转录因子GATA-1和EPO受体表达上调以及胚胎型珠蛋白提前表达，后者和Smad5-/-卵黄囊原位杂交的发现吻合。我们证实了TGF-β1对胚胎型珠蛋白βH1和ζ的抑制效应；但此效应在Smad5-/-拟胚体消失，表明至少在转录水平上Smad5介导了TGF-β1对胚胎型珠蛋白合成的抑制作用。相反的是，Smad5缺失导致原始红系祖细胞增殖形成集落的能力减弱。上述结果表明：Smad5可能在原始红系造血的不同方面，即前体细胞增殖形成集落和合成珠蛋白，发挥了不同的作用。结论：小鼠ES细胞体外分化能够重现胚胎早期造血发育的生物学程序；Smad5基因对于胚胎造血发育调控的必要性和多样性，反映了其上游配体TGF-β家族分子在

滕增辉^[3]2003年在《骨形成蛋白对造血影响的研究进展》文中研究说明本文简述了骨形成蛋白的结构和理化性质 ,总结了骨形成蛋白对胚胎期和成年动物造血的作用 ,探讨了骨形成蛋白影响造血的可能机理 ,指出了进行骨形成蛋白对造血作用研究的理论和实际意义

参考文献：

[1]. TGF-β信号与胚胎/胚胎干细胞造血调控[D]. 刘兵. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004

[2]. Smad5基因和胚胎造血发育的调控机制[D]. 刘兵. 第二军医大学. 2002

[3]. 骨形成蛋白对造血影响的研究进展[J]. 滕增辉. 中国实验血液学杂志. 2003

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