论文摘要
口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染猪、牛、羊等偶蹄动物引起的一种急性、热性和高传染性动物疫病,可造成严重的经济损失。目前口蹄疫灭活疫苗仍是预防和控制口蹄疫的主要手段,但是鉴于灭活疫苗在生产中存在的安全隐患,研制新型安全有效的口蹄疫亚单位疫苗刻不容缓。在FMD表位疫苗研究领域,如何将FMDV中和表位更加有效的呈递给免疫系统,从而更加高效的激发抵抗FMD感染的免疫应答,是目前表位疫苗研究的主要方向。本研究选取了三种FMD多表位抗原的分子内佐剂,分别是:乙肝核心抗原（Hepatitis B core antigen,HBcAg）,结核分枝杆菌热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）的羧基端肽结合区（mHSP70C）以及肝素结合血凝素蛋白（heparin-binding hemagglutinin adhesin,HBHA）。另外选取A型和O型FMDV代表性毒株VP1上的B细胞表位（VP1 134-161aa,200-213aa）或非结构蛋白3A上的T细胞表位（3A 21-35aa）的编码基因进行串联,并插入到截短型HBcAg的主要免疫原区（major immunogenic region,MIR）进行合成。在原核表达系统中获得不同的重组抗原rHBc/AO和rHBc/AOT,经过亲和层析纯化以及尿素梯度透析复性等程序后使其在体外高效自组装成携带有FMDV抗原表位的病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。此外,笔者将A型和O型FMD二价多表位基因AO和HAO分别与mHSP70C以及HBHA的编码基因进行融合,以及HAO和HBHA单独构建至原核表达载体pET-28a,在原核系统中成功表达和纯化了重组蛋白AOHSP,HAO,HBHA以及HAO-HBHA。笔者将得到的rHBc/AO和rHBc/AOT VLPs以及融合抗原AO-HSP、HAO-HBHA等在小鼠模型中进行了免疫效果评价。rHBc/AO和rHBc/AOT VLPs均能刺激机体产生A型和O型FMDV特异性中和抗体;在细胞免疫应答方面,两者均能显著刺激机体产生Th1型细胞免疫应答,而灭活疫苗更倾向于刺激产生Th2型细胞免疫应答。与rHBc/AO VLPs相比,rHBc/AOT VLPs能够产生更高水平的Th2型细胞免疫应答。此外,HAO-HBHA免疫组的抗体水平以及脾淋巴细胞增殖水平明显高于HAO+HBHA混合免疫组,HAO以及HAO+206佐剂组。绵羊免疫结果显示,HAOHBHA免疫组能产生同灭活疫苗组同等的FMDV特异性抗体水平。由此可得出结论,在HBc分子MIR区插入多种血清型FMDV的抗原表位以提高该类VLPs疫苗广谱性的优势性;另外mHSP70C以及HBHA在增强FMDV表位免疫原性方面同样具有优势,特别是HBHA在提高FMDV特异性抗体水平以及细胞免疫应答方面有良好的应用前景。
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摘要abstract第一章 引言 1.1 口蹄疫及口蹄疫疫苗 1.1.1 口蹄疫 1.1.2 口蹄疫疫苗 1.2 表位疫苗的疫苗免疫学原理 1.3 表位疫苗分子内佐剂的研究现状 1.3.1 toll样受体激动剂作为内置佐剂 1.3.1.1 脂肽 1.3.1.2 热休克蛋白 1.3.1.3 肝素结合血凝素 1.3.1.4 细菌鞭毛蛋白 1.3.2 病毒样颗粒作为内置佐剂平台 1.3.2.1 乙肝病毒核心抗原 1.3.2.2 基于噬菌体的病毒样颗粒 1.3.2.3 烟草花叶病毒 1.3.3 其他新型的表位疫苗共递呈系统 1.3.3.1 自组装肽纳米颗粒 1.3.3.2 脂核心肽 1.3.3.3 有机高分子和无机材料 1.4 总结与展望第二章 基于HBcAg重组A型、O型口蹄疫二价多表位病毒样颗粒的制备 2.1 材料 2.1.1 主要试剂 2.1.2 主要仪器 2.2 实验方法 2.2.1 .A 型、O型口蹄疫二价多表位重组蛋白的设计 2.2.2 克隆质粒的构建以及基因合成 2.2.3 重组表达质粒的构建 2.2.3.1 质粒的双酶切 2.2.3.2 酶切产物的连接、转化 2.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及分析 2.2.5 重组蛋白的纯化 2.2.6 重组蛋白的复性 2.2.7 重组蛋白的抗western blot分析 2.2.8 透射电镜鉴定 2.3 实验结果 2.3.1 rHBc/AO,rHBc/AOT重组基因的扩增 2.3.2 重组蛋白的表达纯化、复性以及western blot验证 2.3.3 重组病毒样颗粒透射电镜的观察 2.4 讨论第三章 HSP70 肽结合区作为分子内佐剂的口蹄疫多表位免疫原的制备 3.1 材料 3.1.1 主要试剂及仪器 3.2 实验方法 3.2.1 A型、O型口蹄疫二价多表位抗原的设计与基因合成 3.2.2 HSP70羧基末端多肽结合区基因合成 3.2.3 重组表达质粒的构建 3.2.4 阳性重组质粒pAO-HSP的表达分析 3.2.5 重组蛋白的纯化 3.2.6 重组蛋白的Western Blot鉴定 3.3 实验结果 3.3.1 重组质粒pAO-HSP的鉴定 3.3.2 重组质粒pAO-HSP的表达鉴定 3.3.3 重组蛋白PAO-HSP的纯化结果分析 3.3.4 目的蛋白的Western-blot检测结果 3.4 讨论第四章 HBHA蛋白作为分子内佐剂的重组口蹄疫多表位免疫原的制备 4.1 材料 4.1.1 主要试剂和仪器 4.2 实验方法 4.2.1 重组A型、O型口蹄疫二价多表位抗原的设计与基因合成 4.2.2 HBHA基因的合成 4.2.3 融合抗原表达质粒的构建 4.2.4 HBHA表达质粒的构建 4.2.4.1 HBHA的 PCR扩增 4.2.4.2 PCR产物以及表达载体的酶切、连接、转化 4.2.5 阳性重组质粒pHBHA,pHAO,pHAO-HBHA的表达分析 4.2.6 重组蛋白的纯化 4.2.7 重组蛋白pHAO的复性 4.2.8 Western-blot鉴定 4.3 实验结果 4.3.1 重组质粒的测序以及PCR验证 4.3.2 重组蛋白的表达、纯化分析 4.3.3 重组蛋白的Western-Blot分析 4.4 讨论第五章 基于HBcAg重组A型、O型口蹄疫二价多表位病毒样颗粒的免疫效果评价 5.1 材料 5.1.1 病毒,细胞和实验动物 5.1.2 主要试剂 5.2 实验方法 5.2.1 疫苗的制备 5.2.2 动物免疫 5.2.3 小鼠血清样品的收集 5.2.4 ELISA法检测血清抗体水平 5.2.5 间接免疫荧光实验 5.2.6 微量中和实验 5.2.6.1 病毒TCID50 的测定 5.2.6.2 中和实验 5.2.7 细胞免疫评价 5.2.7.1 小鼠淋巴细胞的分离 5.2.7.2 淋巴细胞增殖实验 5.2.7.3 细胞因子检测 5.2.8 数据分析 5.3 实验结果 5.3.1 小鼠血清中特异性抗体的检测 5.3.2 免疫荧光 5.3.3 小鼠体内中和抗体检测 5.3.4 淋巴细胞增殖实验 5.3.5 细胞因子的检测 5.4 讨论第六章 A型、O型口蹄疫二价多表位融合抗原的免疫效果评价 6.1 材料 6.1.1 病毒,细胞,主要试剂和实验动物 6.2 实验方法 6.2.1 以HBHA作为疫苗分子内佐剂的小鼠免疫分组 6.2.2 以mHSP70C作为疫苗分子内佐剂的小鼠免疫分组 6.2.3 小鼠血清样品的收集 6.2.4 小鼠血清中特异性抗体水平以及中和抗体效价的检测 6.2.5 淋巴细胞增殖实验 6.2.6 羊免疫效果监测 6.3 实验结果 6.3.1 小鼠血清中特异性抗体的检测 6.3.2 中和抗体水平检测结果 6.3.3 淋巴细胞增殖实验结果 6.3.4 免疫后绵羊血清抗体检测 6.4 讨论第七章 全文总结参考文献致谢作者简历
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 雷垚
导师: 常惠芸
关键词: 口蹄疫,多表位抗原,分子内佐剂,病毒样颗粒
来源: 中国农业科学院
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 中国农业科学院
基金: 国家重点研发计划(2017YFD0500902),甘肃省重点研发项目(Grant No.17YF1NA070),中国生猪产业体系(CARS-36-06B)
分类号: S852.4
总页数: 68
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标签：口蹄疫论文; 多表位抗原论文; 分子内佐剂论文; 病毒样颗粒论文;
基于不同分子内佐剂的A型、O型口蹄疫病毒二价多表位免疫原的初步研究
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