基于PLGA的细胞内传感器用于监测持久性有机污染物细胞毒性的方法研究

论文摘要

持久性有机污染物（POPs）是一类有机化合物,包括农药、二恶英、呋喃、多氯联苯和全氟类化合物等。POPs持久存在于环境中,具有长的半衰期、长残留性、生物蓄积性、半挥发性和高毒性等特点。近年来,众多研究表明POPs的高剂量短期暴露会导致生殖系统损伤、免疫系统损害、内分泌紊乱、神经毒性和癌症等重大疾病。由于POPs在自然环境中难以降解,并且随着POPs的逐渐禁用,人类长期暴露于低剂量的POPs环境中。当前毒理学研究中采用的POPs浓度高于人类血液样本中POPs的检出浓度,因此持久性有机污染物的低剂量长期暴露的细胞毒性一直是全球关注的重要科学问题。当前的细胞毒性分析方法存在两个弊端,一是传统终点式分析方法缺少对于细胞响应的实时监测,无法在较低的时间分辨率内观测细胞响应的细微变化;二是所用癌化细胞系无法真实反映人原代细胞的响应。针对上述问题,本论文设计可集成到细胞内的传感器,用于实时监测细胞在有毒污染物刺激下特定生物分子的响应变化。同时采用人体骨髓间充质干细胞作为研究对象,研究其与典型POPs低剂量长期共培养下特定生化指标（细胞存活、活性氧的产生以及脂肪分化相关基因变化）与功能的响应。主要工作如下:1.利用双乳液合成法合成了基于可生物降解的聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）为载体的传感器,同时调控制备条件并用聚赖氨酸（PLL）进行表面正电荷修饰,成功将传感器尺寸控制在1μm左右,实现了对人源间充质干细胞的标记以及长达30天的细胞功能实时监测。2.采用以上合成方法成功合成了PLGA@calceinAM和PLGA@CellROX两种传感器,并成功实现了对细胞内溶质酯酶（指示细胞活性）和活性氧的灵敏检测。进一步对0.1和10μM两个剂量（普通人群与职业人群的血液浓度）全氟辛烷磺酸长期暴露下的hMSCs细胞内溶质酯酶及细胞内活性氧变化进行了短期（0-48小时）和长期（0-14天）的监测。3.成功设计了激动蛋白（β-actin）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）和脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（ap2）分子信标,并验证了三种分子信标对各自靶标链浓度的特异性响应。制备了基于PLGA的分子信标传感器,用以同时监测细胞内β-actin、PPARγ和ap2的mRNA表达水平。在0.1和10μM两个剂量全氟辛烷磺酸长期暴露下对hMSCs的脂肪分化进行监测,选取细胞中稳定表达的β-actin作为内参,监测两种与细胞脂肪分化相关的基因PPARγ和ap2的表达。本论文以PLGA传感器集成的人源间质充干细胞为研究平台,为研究POPs低剂量长期暴露下细胞毒性提出了新思路。

论文目录

摘要

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第一章绪论

1.1 持久性有机污染物分类及危害

1.2 有毒污染物的毒性检测

1.2.1 有毒污染物的毒性检测方法

1.2.2 细胞毒性筛查方法分类

1.2.3 干细胞毒理学及其重要意义

1.3 细胞传感器

1.3.1 细胞传感器分类

1.3.2 PLGA用于细胞传感器

1.4 本文研究意义及研究内容

1.4.1 研究意义

1.4.2 研究内容

第二章 PLGA传感器的可控制备及性能表征

2.1 引言

2.2 实验试剂及仪器

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 PLGA传感器的可控制备及形貌尺寸表征

2.3.2 PLGA传感器的毒性及安全性分析

2.3.3 PLGA传感器的细胞标记率表征

2.3.4 PLGA传感器可延缓信号衰减表征

2.4 结果与讨论

2.4.1 PLGA传感器的DLS尺寸表征

2.4.2 PLGA传感器的形貌表征

2.4.3 CalceinAM传感器的探针释放曲线

2.4.4 PLGA传感器MTT细胞毒性分析

2.4.5 PLGA传感器可延缓信号衰减

2.5 本章小结

第三章 PLGA传感器监测低剂量PFOS暴露下细胞内溶质酯酶和活性氧变化

3.1 引言

3.2 实验试剂及仪器

3.2.1 实验试剂

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 PLGA@calceinAM传感器特异性监测细胞内溶质酯酶

3.3.2 PLGA@CellROX传感器特异性监测细胞内活性氧

3.3.3 监测PLGA传感器标记细胞在低剂量PFOS暴露下的细胞功能变化

3.4 结果与讨论

3.4.1 PLGA@calceinAM特异性监测细胞内溶质酯酶

3.4.2 PLGA@CellROX传感器特异性监测细胞内活性氧

3.4.3 监测PLGA传感器标记的细胞暴露于低剂量PFOS下细胞内溶质酯酶和活性氧

3.5 本章小结

第四章 PLGA传感器监测低剂量PFOS暴露下干细胞脂肪分化相关基因

4.1 引言

4.2 实验试剂及仪器

4.2.1 实验试剂

4.2.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 分子信标的设计与模拟

4.3.2 基于PLGA的分子信标传感器的制备

4.3.3 PLGA传感器的DLS表征

4.3.4 PLGA传感器的TEM表征

4.3.5 分子信标标准曲线的绘制以及装载率的测定

4.3.6 确定分子信标与靶标链能够互补配对

4.3.7 确定分子信标传感器可以标记细胞

4.3.8 低剂量PFOS暴露下监测h MSCs细胞脂肪分化情况

4.4 结果与讨论

4.4.1 分子信标的设计及结构模拟

4.4.2 PLGA分子信标传感器的形貌尺寸表征

4.4.3 分子信标传感器的装载率测定及与靶标链的互补配对情况

4.4.4 两种基于PLGA的分子信标传感器标记细胞

4.4.5 低剂量PFOS暴露环境下对细胞中PPARγ进行长期监测

4.5 本章小结

第五章总结与展望

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间撰写的论文

附录2 攻读硕士学位期间申请的专利

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭西西

导师: 汪联辉,高宇

关键词: 细胞内传感器,实时监测,干细胞毒理学,低剂量长期暴露,全氟辛烷磺酸

来源: 南京邮电大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,信息科技

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用,自动化技术

单位: 南京邮电大学

分类号: X85;X171.5;TP212

DOI: 10.27251/d.cnki.gnjdc.2019.000049

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