林红[1]2003年在《乙醛对体外培养的大鼠肝星状细胞的促纤维化作用及复方中药的干预作用》文中进行了进一步梳理前言 肝硬化是威胁人类健康的严重疾病，肝纤维化是各种肝病(包括病毒性、酒精性、化学性等)发展成肝硬化的必经之路。肝纤维化的发展是细胞外基质(ECM)合成增加、降解减少的结果。肝星状细胞(HSC)的活化是肝纤维化发生的中心环节，HSC是分泌合成胶原的主要细胞。在ECM降解过程中起主要作用的酶类是基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)和尿激酶原激活系统(uPA和PAI-1)。HSC激活受多种细胞因子的调控如肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)、血小板源性生长因子(PDGF)等，其中PDGF是最强的促有丝分裂原，TGF-β_1为最强的促肝纤维化因子。目前普遍认为，在酒精性肝纤维化和肝硬化形成过程中，HSC起重要作用，HSC体外培养成功为肝纤维化的研究提供了理想的细胞模型。中药复方的多途径、多层次、多靶点的综合药理作用在抗肝纤维化治疗中显示出独特的优势。本研究观察了中药抗纤复方Ⅰ号(KXI)对乙醛处理的体外培养的大鼠HSC增殖、胶原合成、MMPs、TIMPs及PAI-1mRNA的表达和TGF-β_1、PDGF分泌的影响，以期阐述KXI抗酒精性肝纤维化的作用机制，为临床酒精性肝病(ALD)的中药治疗提供更多的理论依据。 材料与方法 一、主要材料与仪器 (一)动物为Wistar雄性大鼠。Ⅳ型胶原酶、密度梯度离心介质Nycodenz、NP-40均为Sigma公司产品，链霉蛋白酶为德国Merck公司产品，四甲基偶氮哩蓝（M’IT）为Fluka公司产品，40％乙酸（分析纯）购自中国医药集团上海化学试剂公司，DMEM培养液为美国GeO公司产品。兔抗人结蛋白（Deslnin）抗体、SP组化试剂盒购于福建迈新公司，PClll、LN、HA放射免疫测定试剂盒为上海海军医学研究所产品；RT－PCR试剂盒为hkaa产品，引物均由北京奥科公司合成。双抗体夹心ABC－EllSA试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。 （二）药物与药物血清的制备：抗纤复方互号（主要由丹参、黄茂、红花。汉防己、葛根、桃仁、甘草等药物组成）浓缩口服制剂和生理盐水，给大鼠谁服。无菌条件下由下腔静脉取血，离心取血清。使用时用无血清 DMEM培养液稀释成10％的药物和正常血清孵育液。 （叁）酶标仪E－Uza Mat－300：美国产JC－12ho放射免疫Y顺仪：中国产；w’n－100 PCR扩增仪：美国产；ID Kodak成像分析系统：美国产；稳压电泳仪 POWER／NPACJ00：BIO－RAD产品。 二、方法 （一）肝星状细胞分离、培养和鉴定 参照宋少刚等报道的方法分离肝星状细胞。采用链霉蛋白酶及IV型胶原酶对大鼠肝脏进行原位灌流消化，经比扬他以d用E密度梯度离心，吸取界面处的细胞悬浮于20％小牛血清DMEM培养液中，以IX10VInl的浓度接种在塑料培养M里，置CO。培养箱中培养。本次实验采用传2－4代HSC。HSC鉴定方法：将细胞爬片用兔抗人Desndn抗体、SP法作免疫细胞化学染色，胞浆阳染者为HSC。 （二）细胞增殖率测定 采用Mrt比色法，传代的细胞长满单层后用胰酶消化后置20％小牛血清 DMEM培养液中，调整细胞数为 IX10＊L，以每孔 100gi加人96孔培养板内，置 CO。培养箱内预培养72h后，分成正常血清对照组、正常血清十乙醛组及药物血清十乙醛组。每孔100J10％药物血清孵育液，再加人乙醛使之终浓度分别为 100w上00uM300uM。对照血清十乙酸组以同样方法添加正常血清及乙醛。每个浓度设4个复孔，作用 24b后，加人 W液20叶，用酶标仪测其OD值。 （叁）放免法测定nlll、LN、HA含量 以 IX10＊瓶浓度接种在培养瓶（25Cm2）中的 HSC长满单层后，分为正 ·2·常血清对照组、正常血清十乙醛组及药物血清十乙醛组。乙醛组加人乙醛后使终浓度为二见刚，血清浓度为10％，培养24h后收集培养上清，每个样品作双复管，严格按说明操作。JC－1200放射免疫Y计数仪上直接测定PClll、LN、HA含量，取均值。 （四）ELISA法检测TGF ＊；和PDGF含量 按方法（叁）处理HSC及收集培养上清，每个样品均作复管，严格按说明操作。酶标仪检测OD值。 （五）RT一PCR检测al（I）、al（IV）型胶原，MMP一1、2、9，TIMP一1、2和 PAI人 表达 按方法（叁）处理HSC 6h和24h，分另提取总RNA并测定RNA浓度和纯度。2 pgRNA经 BcaBEST Polylnerase逆转录成 cDNA。引物参照文献设计，p－achn作为内参照，PCR扩增条件及产物各有不同（详见论文部分人PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳、摄片、密度扫描，然后用其表达量与对应p－achn的表达量进行比较。 （六）统计学处理 各组数据以均值上标准差k。S）表示，两两均数的比较用t检验。 实验结果 （一）培养大鼠HSCS的鉴定 免疫细胞化学染色显示，传代＊SC纯度＞98％。（见图1－1） （二）乙醛及药物血清对HSC增殖的影响 正常血清浓度为10％时，乙醛浓度为100pM在00pMJ00pM时均对＊SC有增殖作用汗＜o．05人但各浓度间差异无统计学意义，而10％药物血清只对100pM乙醒刺
吴晓玲[2]2005年在《红景天甙对肝纤维化大鼠TGFβ-Smad信号通路的影响》文中提出背景与目的:肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的中间病理阶段,目前的研究认为肝纤维化病变经过适当的积极治疗有希望延缓甚至逆转,而发展到肝硬化阶段则难以逆转。令人遗憾的是,目前临床上还缺乏公认的确切有效的抗肝纤维化药物问世,肝纤维化的防治研究在今后一定时期内仍是国内外的热点与难点课题。我国的研究者在肝纤维化的防治研究领域经过数十年的悉心探索,逐步发现我国的许多传统中草药具有比较好的抗肝纤维化疗效,以小柴胡汤、复方 861 合剂、复方鳖甲软肝片、冬虫夏草、甘草、丹参、苦参等一大批具有活血化瘀、软坚散节功效的单方、复方中药制剂为代表,其中小柴胡汤在日本医学界倍受推崇,已经被用于慢性肝病的临床治疗[1],中药防治肝纤维化的研究显示出比较光明的发展前景。但是,目前国内很多针对中药制剂抗肝纤维化的研究局限于临床疗效观察或者初步的细胞、动物实验,缺少系统的分子机理研究,并且有些中药制剂组方复杂、价格昂贵、来源匮乏,难以获得临床的普遍推广和验证,也不适宜于中药现代化发展并走向世界的要求,迫切需要研制更为安全廉价、疗效肯定、来源充足的抗肝纤维化中药制剂。红景天(Rhodiola sachalinensis A Bor)在我国产量十分丰富,主要分布于西藏、云贵高原、四川盆地等地区,在抗高原病、抗辐射损伤以及抗衰老等方面广为应用,我们的前期实验研究证实其对四氯化碳诱导的实验大鼠具有保护肝细胞,抑制肝脏炎症反应,减少肝脏胶原
李生财[3]2008年在《“肝心宁”防治肝纤维化的作用及机理研究》文中指出目的:观察“肝心宁”对实验大鼠肝纤维化的防治作用,研究“肝心宁”对实验大鼠肝纤维化的防治作用的机理,为“肝心宁”在临床的广泛应用提供理论依据。方法:57只sD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组5组。采用改良复合因素法复制大鼠肝纤维化模型。空白组与模型组给予生理盐水10ml/kg灌胃,阳性对照组给予秋水仙碱0.125mg/kg治疗,中药高、低剂量组分别给予肝心宁26g/kg、6.5g/kg治疗。6周后,HE染色后比较各组大鼠肝脏病理组织改变;采用全自动生化分析仪,对各组大鼠血清ALT、AST、TBA进行检测;采用放免分析法检测大鼠血清HA、PⅢNP、LN的含量;用免疫组织化学法研究各组大鼠肝脏组织中caspase-3、bcl-2表达的部位及强度;并测定肝组织中PDGF-BB、bFGF的表达情况。结果:在肝脏病理积分上各治疗组与模型组比较均有显着性差异(P＜0.05或P＜0.01),且在炎症积分上中药低剂量组效果最为明显,与阳性对照组比较也有显着性差异(P＜0.05);在血清酶学指标上,与空白组比较,其余各组大鼠血清中ALT、AST的活性与TBA的含量均明显升高,有显着性差异(P＜0.01或P＜0.05)。与模型组比较,各治疗组血清中ALT、AST的活性与TBA的含量均明显减少有显着性差异(P＜0.01或P＜0.05),各治疗组间无显着性差异(P＞0.05);在血清ECM指标上,与空白组比较,其余各组大鼠血清中LN、HA、PⅢNP的含量均明显升高,有显着性差异(P＞0.01或P＜0.05),与模型组比较,各治疗组血清中LN、HA、PⅢNP的含量均明显减少,有显着性差异(P＜0.01或P＜0.05)。治疗药物之间,除血清LN中药低剂量组显着低于阳性对照组(P＜0.05)外,其余各治疗组之间比较无显着性差异(P＞0.05);在抑制bFGF表达上,与模型组比较,各治疗组肝组织中bFGF均明显减少,有显着性差异(P＜0.01),各治疗组间无显着性差异(P＞0.05);在抑制PDGF-BB表达上,各治疗组与模型组比较均有显着性差异(P＜0.01),各治疗组间无显着性差异(P＞0.05);在调节caspase-3方面,与模型组比较,各治疗组肝组织中caspase-3均明显减少,有显着性差异(P＜0.01或P＜0.05)。,治疗药物之间,中药低剂量组显着低于阳性对照组(P＜0.05),肝心宁低剂量组、肝心宁高剂量之间比较无显着性差异(P＞0.05);在调节bcl-2方面,与空白组比较,其余各组各组大鼠肝组织中bcl-2均明显升高,有显着性差异(P＜0.01),与模型组比较,各治疗组肝组织中bcl-2未见明显减少(P＞0.05)。结论:“肝心宁”能有效预防实验大鼠肝纤维化形成,改善肝纤维化大鼠肝组织损伤程度,可以有效降低肝纤维化模型大鼠血清ALT、AST、TBA等酶学指标和LN、HA、PⅢNP等肝纤维化指标的含量。其机制可能与“肝心宁”能够抑制PDGF-BB、bFGF介导的HSC增殖有关;此外通过调整caspase-3,bcl-2减轻肝细胞凋亡也可能“肝心宁”防治肝纤维化机制之一。中药防治肝纤维化往往是通过多途径、多层次、多靶点来实现的,所以以上结论的可靠性还需要在以后的科研临床工作中进一步验证。
管文婕[4]2012年在《咖啡因经腺苷A_(2A)受体介导的cAMP/PKA/Src/ERKI/2/p38MAPK信号转导通路抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用研究》文中认为酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。近年来，由于酒精消费的飞跃发展，ALD已成为全球性的公共卫生问题[1]。ALD初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。目前认为[2]，酒精性肝纤维化（alcoholic liver fibrosis）是ALD发展过程中的转折点，如能去除不利因素，可以逆转上述相关病理改变。因此，对其发病机制及治疗靶点的研究一直是学术界关注的焦点。在酒精性肝纤维化发生过程中，乙醇可通过代谢毒性产物乙醛等多种因素激活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）。活化的HSC是肝纤维化过程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要来源，也是各种因素所致肝纤维化发生的中心环节~([3])。尽管HSC在肝纤维化发病中的作用受到了广泛关注，有关细胞因子在HSC内转导的通路也被广泛研究，但由于乙醇致肝纤维化过程极为复杂，影响因素很多，迄今为止，对如何合理抑制HSC活化，逆转酒精性肝纤维化的发展尚无良策。近年来，腺苷A_(2A)受体由于其复杂的生物学作用以及在多种疾病中的重要调节功能已受到越来越多的关注。Chan~([4])等2006年一项令人振奋的研究表明，HSC上的腺苷A_(2A)受体活化在肝纤维化的发病机制中扮演着重要的角色，有希望成为预防和治疗肝纤维化的一个新颖的靶点。该项研究发现经乙醇诱导后释放的大量腺苷通过激活HSC腺苷A_(2A)受体，促进大鼠和人HSC胶原的合成。Hashmi和Sohail~([5-6])的研究也证实了腺苷通过激活A_(2A)受体在HSC活化致肝纤维化中的作用。Che~([7])等2007年也报道，腺苷A_(2A)受体通过其耦联的Gs蛋白上调cAMP-PKA信号途径，再分别经由其下游信号通路PKA-Src-ERK1/2MAPK和p38MAPK诱导LX-2人肝星形细胞株I型胶原和III型胶原的生成。咖啡因（caffeine）是世界上消费最广泛的日常饮食成分及精神类药物之一，其基本化学结构含有甲基黄嘌呤类活性成分，在体内主要通过拮抗腺苷A_(2A)受体和A1受体发挥其主要药理作用~([8-10])。Caffeine与健康的关系一直为科学家所关注，在传统的观念里，经常饮用含caffeine饮料似乎对身体无益[11-12]。但近年来[13-16]，越来越多有趣而又充满争论的流行病学研究被陆续地报道，这就是饮用含caffeine饮料可以显着减少酗酒人群罹患慢性肝病的的机率，包括罹患酒精性肝纤维化的风险。本课题组前期研究表明caffeine通过抑制炎症反应及氧化应激对小鼠酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其机制与其抗脂质过氧化、抑制炎性细胞因子以及减少肝组织生脂基因表达有关~([17])。同时研究发现caffeine对乙醛刺激的HSC-T6增殖具有抑制作用，并能够促进其凋亡，其作用机制可能与其上调TRAIL受体DR_4、DR_5的表达有关~([18])。目前，体外培养HSC常作为肝纤维化研究的重要手段，并已建立若干HSC系代替原代HSC作为研究的靶细胞。HSC-T6细胞系即是由大鼠HSC经过SV40病毒转染后形成的永生细胞系，具有无限传代的特性，是肝纤维化研究的良好模型[19-20]。因此本研究采用乙醛干预HSC-T6细胞系，建立离体的大鼠酒精性肝纤维化HSC模型，探讨饮料水平caffeine如何通过腺苷A_(2A)受体介导的cAMP–PKA–src-erk1/2-p38MAPK信号通路调控乙醛诱导的HSC-T6增殖活化。主要内容概括如下：1.不同浓度caffeine及腺苷受体调节剂作用不同时间对乙醛诱导的HSC-T6增殖的影响分别以caffeine（0.5，1，2，4，8mM），腺苷A_(2A)受体拮抗剂ZM241385（1，10，100，1000，10000nM），腺苷A_(2A)受体激动剂CGS21680（1，10，100，1000，10000nM）与HSC-T6共同培养，1h后加入终浓度200uM的乙醛刺激（每12h补充1次），分别继续培养24h，48h，72h后采用四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-25-,MTT]法分别检测caffeine，ZM241385，CGS21680对HSC-T6增殖的影响。结果显示，caffeine（0.5，1，2，4，8mM）作用24h的抑制率分别是3.56%，7.52%，18.02，25.15%，35.25%；作用48h的抑制率分别是12.05%，22.29%，51.01%，64.65%，67.36%；作用72h抑制率分别是13.68%，16.27%，37.51%，54.51%，85.70%。其中以caffeine(4mM)作用48h的抑制作用最为明显。ZM241385（1，10，100，1000，10000nM）作用24h的抑制率分别是10.25%，10.85%，12.85%，30.88%，23.87%；作用48h的抑制率分别是13.58%，14.81%，16.41%，40.98%，29.51%；其中以ZM241385（1uM）作用48h的抑制作用最为明显。CGS21680（1，10，100，1000，10000nM）作用24h的抑制率分别是-6.79%，-7.89%，-25.88%，-34.7%，-16.1%；作用48h的抑制率分别是-14.33%，-16.33%，-29.12%，-42.34%，-19.1%；其中以CGS21680（1uM）作用48h的增殖作用最为明显。结果表明caffeine及ZM241385对乙醛诱导的HSC-T6增殖具有明显抑制作用，CGS21680能进一步促进HSC-T6增殖，且表现出一定的浓度和时间依赖性。2. Caffeine经腺苷A_(2A)受体抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用在上述研究基础上，实验设正常组(常规培养)，模型组，咖啡因及腺苷受体（adenosine Receptor，AR）调节剂干预组，分别给予caffeine（4mM），ZM241385（1uM），CGS21680（1uM），caffeine+CGS21680，ZM241385+CGS21680与HSC-T6共同培养，1h后加入终浓度200uM的乙醛刺激（每12h补充1次），继续培养48h。采用荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测腺苷A_(2A)受体mRNA表达水平；免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的含量；逆转录PCR(reversetranscriptase polymerase chain reaction， RT-PCR)法检测I型前胶原氨端肽（Procollagen I N-terminal peptide，P I NP），III型前胶原氨端（Procollagen III，N-terminal peptide，P III NP），转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表达；Western blot法检测CTGF蛋白的表达。结果显示，模型组经200uM乙醛作用48h后，α-SMA，CTGF蛋白及腺苷A_(2A)受体，Procollagen I，ProcollagenIII，TGF-β1mRNA的表达均明显增强；与模型组比较，caffeine及ZM241385均显着降低HSC-T6中α-SMA，CTGF蛋白及腺苷A_(2A)受体，Procollagen I，Procollagen III，TGF-β1mRNA的表达，CGS21680则具有进一步的促进作用。而与单独用药组比较，caffeine+CGS21680及ZM241385+CGS21680联合用药组上述作用明显逆转。结果表明，caffeine能够显着抑制乙醛诱导的HSC-T6活化，以及显着抑制HSC-T6中腺苷A_(2A)受体，Procollagen I，Procollagen III，TGF-β1，CTGF的表达水平。提示，其机制可能与阻断腺苷A_(2A)受体介导的信号通路有关。3.腺苷A_(2A)受体介导的cAMP/PKA/Src/ERK1/2/p38MAPK信号转导通路在caffeine抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化中的作用实验分组如上述，采用放射免疫法检测环磷酸腺苷（cAMP）含量；RT-PCR法检测蛋白激酶A（PKA）mRNA的表达；Western blot法检测P-Src，P-ERK1/2，P-p38蛋白的表达。结果显示，200uM乙醛作用48h明显增强HSC-T6中cAMP，PKA，P-Src，P-ERK1/2，P-p38的表达；与模型组比较，caffeine及ZM241385均显着降低HSC-T6中cAMP，PKA，P-Src，P-ERK1/2，P-p38的表达，CGS21680则具有进一步的促进作用。而与单独用药组比较，caffeine+CGS21680及ZM241385+CGS21680联合用药组述作用明显逆转。结果表明腺苷A_(2A)受体介导的cAMP/PKA/Src/ERK1/2/p38MAPK信号转导通路可能参与了caffeine抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用。在此基础上，采用caffeine(4mM)，PKA抑制剂H89+caffeine(20μM+4mM)，Src抑制剂PP2+caffeine(20μM+4mM)， ERK1/2抑制剂U0126+caffeine(20μM+4mM)，P-p38抑制剂SB202190+caffeine(20μM+4mM)与HSC-T6共同培养，1h后加入终浓度200uM的乙醛刺激（每12h补充1次），继续培养48h；同时设正常组和200uM乙醛干预模型组。采用RT-PCR法检测Procollagen I，Procollagen III，TGF-β1，CTGF mRNA的表达。结果显示，与caffeine组比较，H89+caffeine，PP2+caffeine，U0126+caffeine均显着抑制Procollagen I，TGF-β1，CTGF的表达，但对Procollagen III无明显抑制作用；SB202190+caffeine显着抑制Procollagen III，TGF-β1，CTGF的表达，但对Procollagen I无明显抑制作用。提示，caffeine可通过抑制cAMP-PKA-Src-ERK1/2/p38MAPK通路下调TGF-β1，CTGF的表达。其可能分别经由cAMP/PKA/Src/ERK1/2通路和p38MAPK通路抑制Procollagen I和Procollagen III的合成。进一步采用Western blot法检测P-Src，P-ERK1/2，P-p38蛋白的表达。结果显示，与caffeine组比较，H89+caffeine，PP2+caffeine能显着抑制P-Src表达，而U0126+caffeine，SB202190+caffeine对P-Src表达无明显影响；H89+caffeine，PP2+caffeine，U0126+caffeine，显着抑制P-ERK1/2表达，而SB202190+caffeine对P-ERK1/2表达无明显影响；SB202190+caffeine能显着抑制P-p38表达，而H89+caffeine，PP2+caffeine，U0126+caffeine对P-p38表达无明显影响。提示caffeine可能分别经由cAMP/PKA/Src/ERK1/2通路和p38MAPK通路抑制乙醛诱导HSC-T6的增殖活化，且PKA，Src，ERK1/2之间可能存在信号转导通路的上下游关系。
参考文献：
[1]. 乙醛对体外培养的大鼠肝星状细胞的促纤维化作用及复方中药的干预作用[D]. 林红. 中国医科大学. 2003
[2]. 红景天甙对肝纤维化大鼠TGFβ-Smad信号通路的影响[D]. 吴晓玲. 重庆医科大学. 2005
[3]. “肝心宁”防治肝纤维化的作用及机理研究[D]. 李生财. 成都中医药大学. 2008
[4]. 咖啡因经腺苷A_(2A)受体介导的cAMP/PKA/Src/ERKI/2/p38MAPK信号转导通路抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用研究[D]. 管文婕. 安徽医科大学. 2012
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