平衡调节机制论文-梁燕

导读:本文包含了平衡调节机制论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:杭州市,住房租赁,集中建设,一般控制

平衡调节机制论文文献综述

^[1]（2019）在《杭州市人民政府办公厅转发市规划和自然资源局关于杭州市降低企业职工住宿成本和建立“退二进叁”调节平衡机制实施细则的通知》一文中研究指出杭政办函[2019]49号各区、县(市)人民政府,市政府各部门、各直属单位:市规划和自然资源局制定的《杭州市降低企业职工住宿成本和建立"退二进叁"调节平衡机制的实施细则》已经市政府同意,现转发给你们,请结合实际认真组织实施。(本文来源于《杭州市人民政府公报》期刊2019年05期）

闫思超^[2]（2019）在《双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型药效作用及调节Th/Treg平衡的机制研究》一文中研究指出1.研究背景及目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是以自身免疫功能紊乱为特征的特发性肠道炎症,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn' s disease,CD),发病率高、病势缠绵、治疗难度大,新治疗方法的研发十分必要。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是在上世纪70年代由中国科学家从菊科蒿属植物中提取得到的青蒿素的衍生物,是临床广泛应用的抗疟药物。除了治疗疟疾外,双氢青蒿素也被发现对红斑狼疮、类风湿关节炎以及多发性硬化等自身免疫病具有缓解病情和调节Th/Treg平衡的作用,但其对炎症性肠病的作用及机制研究尚在起步阶段。在化学方法诱导的小鼠炎症性肠病模型中,恶唑酮(Oxazolone,OXA)和 2,4,6-叁硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠模型在组织病理学特征方面与人类UC和CD类似,并且分别适用于对Th9和Th1/Th17的研究。本文基于Th/Treg平衡调节,探索DHA对小鼠IBD模型的药效作用和免疫调节机制,为进一步拓展青蒿素类药物临床新适应症奠定基础。2.研究方法和内容2.1双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病OXA模型和TNBS模型的药效作用研究建立恶唑酮和2,4,6-叁硝基苯磺酸诱导的小鼠炎症性肠病模型,以DHA4mg/kg/d、8mg/kg/d、16mg/kg/d为低、中、高剂量,地塞米松磷酸钠注射液1mg/kg/d为阳性药,分别在小鼠灌肠造模后8h、24h、48h腹腔注射,正常对照(Negative Control,NC)和OXA模型组、TNBS模型组予等剂量溶剂,共给药3次,在小鼠造模后Oh、8h、24h、48h和72h,记录一般状态,饮食饮水、腹泻便血程度,体重变化、死亡数量,评价疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。在小鼠造模72h后,麻醉,断颈处死并迅速取出OXA模型小鼠结肠组织和TNBS模型小鼠小肠组织,清洗后擦干平铺,观察大体病变程度,称重并记录长度,以4%多聚甲醛固定后,切片,进行H&E染色和天狼星红染色,光学显微镜下观察,分别记录淋巴细胞浸润程度和计算组织纤维化面积占比。2.2双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响在OXA模型中,利用Real-Time PCR方法检测小鼠结肠组织中Th9细胞转录因子PU.1和细胞因子IL9、Th22细胞转录因子AHR和细胞因子IL22、Treg细胞转录因子Foxp3和细胞因子IL10的mRNA表达水平,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th9、Th22和Treg细胞分布比例,利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th9细胞转录因子PU.1、Th22细胞转录因子AHR以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。在TNBS模型中,利用Real-Time PCR方法检测小鼠小肠组织Th1细胞转录因子T-bet和细胞因子IFN γ、Th17细胞转录因子RORγt、Treg细胞转录因子Foxp3和细胞因子IL10的mRNA表达水平,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠小肠固有层淋巴细胞中Th1细胞转录因子T-bet、Th17细胞转录因子ROR y t以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。2.3基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对激活CD4+T淋巴细胞的影响免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,在抗CD3/CD28抗体激活条件下,予DMS0或DHAO.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml培养72h后计算细胞存活率;予DMSO、DHAO.8mg/ml、SnPP(HO-1抑制剂)30nmol/ml或DHA+SnPP培养72h后计算细胞存活率,并采用ELISA法检测细胞培养上清中Heme Oxygenase-1(HO-1)的表达水平,PI双染法检测细胞凋亡比例。在OXA模型中,分离提取小鼠结肠固有层淋巴细胞并计数,TUNEL染色法计算小鼠结肠组织中凋亡细胞比例;在TNBS模型中,分离提取小鼠小肠固有层淋巴细胞并计数,TUNEL染色法计算小肠组织中凋亡细胞比例。2.4基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型病情的影响建立OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型,将小鼠分为NC组、模型组、DHA16mg/kg/d组、SnPP30umol/kg/d组、DHA+SnPP组,分别在小鼠灌肠造模后8h、24h、48h腹腔注射,SnPP分别在造模后Oh,24h和48h颈后皮下注射,NC和模型组予等剂量溶剂,在小鼠造模后Oh、8h、24h、48h和72h,记录一般状态,饮食饮水、腹泻便血程度,体重变化、死亡数量,DAI评分。在小鼠造模72h后,麻醉,断颈处死并迅速取出结肠或小肠组织,清洗后擦干并以4%多聚甲醛固定后,切片,进行H&E染色和天狼星红染色,光学显微镜下观察,分别记录淋巴细胞浸润程度和计算组织纤维化面积占比。2.5基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响在OXA模型中,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th9、Th22和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th9细胞转录因子PU.1、Th22细胞转录因子AHR以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。在TNBS模型中,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠小肠固有层淋巴细胞中Th1细胞转录因子T-bet、Th17细胞转录因子RORγt以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。2.6统计方法采用Graphpad Prism 7软件分析数据,统计数据均以x±S表示,多样本之间采用单因素方差分析,不同时间点数据采用重复测量方差分析,取P<0.05具有统计学意义。3.研究结果3.1双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病OXA模型和TNBS模型的药效作用研究1.模型验证:造模后模型组小鼠饮食饮水减少,蜷缩懒动,腹泻、便血、肛周污秽,体重下降,病变部位可见明显充血水肿甚至糜烂溃疡,组织切片染色后可见病变组织结构异常,伴大量淋巴细胞浸润及大面积组织纤维化,提示小鼠炎症性肠病模型造模成功。2.对于OXA模型,与NC组相比,模型组小鼠体重指数下降明显,DAI评分升高,结肠缩短,重量变轻,结肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润明显增加,天狼星红染色显示组织纤维化面积明显增加;与模型组相比,DHA组以及阳性药组小鼠一般状态均有所改善,饮食饮水增加,腹泻便血程度减轻,死亡数量减少,体重指数上升,DAI评分下降,结肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润程度减轻,天狼星红染色显示组织纤维化面积缩小。3.对于TNBS模型,与NC组相比,模型组小鼠体重指数下降明显,DAI评分升高,小肠重量变轻,小肠组织H&E染色结果显示淋巴细胞浸润明显增加,天狼星红染色结果显示组织纤维化面积明显增加;与模型组相比,DHA组以及阳性药组小鼠一般状态均有所改善,饮食饮水增加,腹泻便血程度减轻,死亡数量减少,体重指数上升,DAI评分下降,小肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润程度减轻,天狼星红染色显示组织纤维化面积缩小。3.2双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响1.对于OXA模型,Real-time PCR结果显示,与NC组相比,模型组小鼠结肠组织PU.1、IL9和IL22的mRNA水平明显升高,AHR均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3的mRNA水平明显降低;与模型组小鼠相比,DHA降低了PU.1、AHR、IL9和IL22的mRNA的表达水平,升高Foxp3和IL10的mRNA表达水平。流式细胞术结果显示,与NC组相比,模型组小鼠脾脏Treg细胞比例明显下降,Th9和Th22细胞比例明显上升;与模型组小鼠相比,DHA升高了小鼠脾脏Treg细胞比例,降低了Th9和Th22细胞比例。毛细电泳Western blotting结果显示,与NC组相比,模型组小鼠结肠固有层淋巴细胞PU.1蛋白表达水平明显升高,AHR均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3表达明显下降;与模型组小鼠相比,DHA剂量明显降低了PU.1和AHR的蛋白表达水平,升高了 Foxp3的表达。2.对于TNBS模型,Real-time PCR结果显示,与NC组相比,模型组小鼠小肠组织ROR γ t的mRNA水平明显升高,T-bet和IFN －均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3均值降低,但不具有统计学差异;与模型组小鼠相比,DHA降低了T-bet、RORγt和IFN y的mRNA的表达水平,升高了 Foxp3的表达水平,升高了 IL10平均值,但不具有统计学差异。流式细胞术结果显示,与NC组相比,模型组小鼠脾脏Treg细胞比例明显下降,Th1和Th17细胞比例明显上升;与模型组小鼠相比,DHA升高了小鼠脾脏Treg细胞比例,降低了Th1和Th17细胞比例。毛细电泳Western blotting结果显示,与NC组相比,模型组小鼠小肠肠固有层淋巴细胞T-bet和RORγγt蛋白表达水平明显升高,Foxp3表达明显下降;与模型组小鼠相比,DHA降低了 T-bet和RORγ t蛋白表达水平,升高了 Foxp3水平。3.3基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对激活CD4+T淋巴细胞的影响1.细胞存活率结果显示,DHA(0.1-1.6 mg/ml)对激活CD4+T淋巴细胞具有明显抑制作用,HO-1抑制剂SnPP(30 nM)能够明显降低DHA(0.8mg/ml)的抑制作用。ELISA结果显示,DHA升高了细胞上清中HO-1的蛋白表达,SnPP能够明显抑制HO-1表达,SnPP能够明显减弱DHA对HO-1的升高作用。PI双染法结果显示,DHA能够明显促进激活CD4+T细胞的凋亡,SnPP能够明显减弱DHA的促凋亡作用。2.对于OXA模型,DHA能够明显降低模型小鼠结肠组织中淋巴细胞数量,TUNEL染色结果显示DHA升高了模型小鼠结肠组织中凋亡细胞比例,而SnPP能够明显中和DHA的作用;3.对于TNBS模型,DHA能够明显降低模型小鼠小肠组织中淋巴细胞数量,TUNEL染色结果显示DHA升高了模型小鼠小肠组织中凋亡细胞比例,而SnPP能够明显中和DHA的作用。3.4基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型病情的影响1.对于OXA模型,与DHA组相比,SnPP+DHA能够明显降低模型小鼠的体重指数,升高DAI评分及死亡率,结肠组织H&E染色结果显示SnPP+DHA明显加重了淋巴细胞浸润程度,天狼星红染色结果显示SnPP+DHA组明显增加了结肠组织纤维化面积。2.对于TNBS模型,与DHA组相比,SnPP+DHA能够明显降低模型小鼠的体重指数,升高DAI评分及死亡率,小肠组织H&E染色结果显示SnPP+DHA明显加重了淋巴细胞浸润程度,天狼星红染色结果显示SnPP+DHA组明显增加了小肠组织纤维化面积。3.5基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响1.对于OXA模型,流式细胞术结果显示,SnPP+DHA组比DHA组小鼠脾脏中Th9比例更高,Treg比例更低,SnPP+DHA对Th22比例升高了平均值,但不具有统计学差异;毛细电泳Western blotting结果显示,SnPP+DHA能够削弱DHA对结肠固有层淋巴细胞PU.1和AHR蛋白表达的降低作用和对Foxp3的升高作用。2.对于TNBS模型,流式细胞术结果显示,SnPP+DHA组比DHA组小鼠脾脏中Th1、Th17比例更高,Treg比例更低;毛细电泳Western blotting结果显示,SnPP+DHA能够削弱DHA对小肠固有层淋巴细胞T-bet和RORγt蛋白表达的降低作用和对Foxp3的升高作用。4.结论1.DHA对OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病有缓解作用;2.DHA对OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型的CD4+T淋巴细胞亚群有调节作用;3.DHA基于介导HO-1的表达促进激活CD4+T细胞的凋亡;4.DHA基于介导HO-1的表达缓解OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病;5.DHA基于介导HO-1的表达调节OXA和TNBS小鼠炎症性肠病模型的CD4+T淋巴细胞亚群平衡。(本文来源于《中国中医科学院》期刊2019-05-31）

梁燕^[3]（2019）在《Tim-4调节巨噬细胞平衡抑制肥胖的作用及机制研究》一文中研究指出研究背景肥胖是由于体内脂肪堆积过多或分布异常而引起的全身性低度炎症的慢性疾病。近年来,随着经济的高速发展,生活节奏的不断加快,中国人群的超重率和肥胖率均不断上升,体重超标和肥胖问题越来越受到关注。截止2016年,全球约有21亿超重或肥胖人口,而中国的肥胖率目前为17%左右,总肥胖人口数达8960万人,已成为全球肥胖人口最多的国家。肥胖既是一种独立性疾病,又是高血压、糖尿病、冠心病等一系列慢性疾病的重要危险因素,甚至可导致某些癌症等恶性疾病的发生。由此可见,全球范围内流行的肥胖以及由此引起的代谢综合征,已成为21世纪的全球公共卫生危机。因此,探明肥胖发生、发展的重要分子机制、明确关键靶标基因,对预防和治疗肥胖及相关代谢性疾病具有十分重要的理论价值及现实意义。在肥胖的发展进程中,脂肪组织是炎症反应的始动环节。脂肪组织中含有多种免疫细胞,其中巨噬细胞是参与肥胖发生的最主要免疫细胞群,巨噬细胞也是发挥促炎、引起胰岛素抵抗的关键环节,与正常脂肪组织相比,其数量可增加50%,巨噬细胞已成为目前肥胖免疫学致病机制的研究热点。巨噬细胞浸润到脂肪中称为脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages,ATMs),ATMs有两种功能和表型截然不同的细胞亚型,即经典激活的、具有促炎作用的M1型巨噬细胞和替代激活的、具有抗炎作用的M2型巨噬细胞。Ml型巨噬细胞主要分泌促炎因子,使脂肪组织产生慢性炎症从而导致代谢紊乱和胰岛素抵抗。而脂肪组织中的M2型巨噬细胞可以抑制脂肪细胞内脂质积聚,并增强棕色脂肪的产热功能,诱导白色脂肪的米色化,从而有助于维持脂肪组织的代谢稳态。Ml和M2型巨噬细胞在脂肪组织中所占比例存在动态平衡,调节M1/M2巨噬细胞动态转变的因素与肥胖的发生密切相关,ATMs的异质性和可塑性是其在肥胖中发挥重要作用的关键因素。因此,明确维持ATMs功能稳态的调控分子可为干预肥胖进程提供有效的解决措施。免疫调节分子T细胞免疫球蛋白域与黏蛋白域4(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 4,Tim-4)是于2001年发现的Tim基因家族成员,该分子选择性高表达于巨噬细胞及树突状细胞,而不表达于T细胞。已有多项研究证实Tim-4可抑制巨噬细胞活性并参与肝脏免疫稳态及自身免疫病等,表明Tim-4在免疫相关疾病中的重要性,但Tim-4在肥胖中的作用未见报道。虽有文献报道,居留M2样巨噬细胞高表达Tim-4,但其在巨噬细胞表型转换中的作用并不清楚。基于巨噬细胞在肥胖发生、进展中的关键作用及Tim-4对巨噬细胞的负调控作用,结合国内外研究现状和本课题组前期研究结果,我们提出假说:Tim-4可能通过调控ATMs参与肥胖的发生、发展过程。研究目的本课题以肥胖为研究模型,探讨Tim-4在肥胖发生、发展中的关键作用及其分子机制,为肥胖的临床治疗寻找新的靶点。实验目的如下:1.明确肥胖微环境对Tim-4表达的影响2.探明Tim-4在肥胖中的作用3.明确Tim-4对巨噬细胞极化的影响4.阐明Tim-4调控巨噬细胞极化的机制5.明确Tim-4调节巨噬细胞在肥胖进展中的作用方法与结果1.肥胖微环境对Tim-4表达的影响1.1肥胖小鼠脂肪组织内Tim-4的表达升高首先,我们选择野生型(WT)小鼠通过高脂饮食(High-fat diet,HFD)诱导建立肥胖模型及db/db自发性肥胖小鼠,利用qPCR和Western blot(WB)技术检测HFD小鼠、db/db小鼠和正常饮食的对照小鼠脂肪组织中Tim-4的表达。结果发现,HFD小鼠、db/db小鼠脂肪组织中Tim-4 mRNA和蛋白的表达水平均较对照组明显上调。此结果提示,肥胖微环境可诱导脂肪组织中Tim-4的表达。1.2肥胖脂肪组织SVFs内Tim-4的表达升高为了明确脂肪组织血管基质成分(stromal vascular fraction cells,SVFs)中Tim-4的表达,我们提取了db/db小鼠及其同龄对照小鼠皮下脂肪组织内的SVFs,分别利用qPCR和流式细胞术检测SVFs中的Tim-4mRNA及蛋白的表达。结果显示,肥胖小鼠脂肪组织中SVFs及ATMs均高表达Tim-4。免疫荧光技术也进一步证实,db/db肥胖小鼠脂肪组织中的巨噬细胞表达Tim-4的水平上调。上述结果表明,肥胖小鼠ATMs中的Tim-4表达上调。1.3肥胖小鼠血清刺激上调巨噬细胞中Tim-4的表达为了进一步明确Tim-4表达与肥胖的相关性,我们利用肥胖小鼠血清(占培养基比:20%)模拟肥胖微环境,体外刺激小鼠骨髓巨噬细胞(bone morrow-derived macrophage,BMDM)。通过qPCR、WB及流式细胞术检测BMDM在肥胖小鼠血清刺激后Tim-4的表达变化。结果发现,肥胖小鼠来源的血清刺激后,BMDM表达Tim-4的水平上调。以上结果进一步证明,肥胖微环境可诱导巨噬细胞中Tim-4的表达,提示Tim-4可能通过调节巨噬细胞参与肥胖的发生、发展。2.Tim-4在肥胖中的作用2.1 Tim-4敲除小鼠的鉴定为了更好地研究Tim-4分子在肥胖发生、发展中的作用,实验室引进了Tim-4基因全身敲除(Tim-4-/-或Tim-4KO)的小鼠,并以此为模型开展相关研究。通过qPCR、WB及流式细胞术分别检测了 SVFs、BMDM以及腹腔居留巨噬细胞中Tim-4的表达,结果显示,Tim-4-/-小鼠具有明显的敲除效果,为后续实验的顺利进行奠定基础。2.2 Tim-4敲除可促进高脂饮食诱导的小鼠肥胖进程2.2.1 Tim-4敲除可加重高脂诱导的小鼠肥胖程度为了明确Tim-4在肥胖中的作用,利用WT和Tim-4-/-小鼠分别进行高脂饲喂20周建立肥胖模型。在构建肥胖模型的过程中,每周进行体重监测,发现在高脂饲喂14周后,Tim-4-/-组小鼠体重开始有明显升高的趋势。20周后处死小鼠,发现Tim-4-/-组小鼠皮下、附睾、内脏各部分脂肪组织的重量均较高,而且HE染色结果显示,Tim-4-/-组小鼠的脂肪细胞也明显增大。另外,为了明确两组小鼠的血糖调控能力是否存在差异,在高脂饲喂20周后,检测两组肥胖模型小鼠的糖耐量以及胰岛素抵抗。结果显示,Tim-4-/-组小鼠出现糖耐量减弱以及胰岛素抵抗增强的趋势。以上结果说明,在高脂饮食构建的肥胖模型中,Tim-4敲除可加重HFD诱导的小鼠肥胖程度。2.2.2 Tim-4敲除可加重肥胖引起的相关代谢紊乱我们进一步检测了两组肥胖模型小鼠血清中脂代谢及糖代谢相关分子的表达。首先发现,Tim-4-/-组小鼠的血清中甘油叁酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平高于对照组。另外,利用ELISA试剂盒检测血清中胰岛素、瘦素、脂联素的水平,结果显示,Tim-4-/-组小鼠对胰岛素及瘦素的抵抗增强,而血清内能够改善胰岛素敏感性的脂联素水平则显着降低,说明Tim-4敲除后可加重肥胖引起的相关代谢紊乱。以上结果进一步提示,Tim-4敲除后可促进高脂饮食诱导的肥胖。2.3 Tim-4敲除对高脂诱导肥胖模型小鼠能量代谢的影响由于脂肪组织在能量代谢稳态中发挥重要作用,我们在高脂饲喂20周时,利用代谢笼检测两组肥胖小鼠能量代谢的水平,结果发现,Tim-4-/-组小鼠耗氧量水平显着降低,提示Tim-4敲除后可抑制小鼠能量代谢的水平。为了更加明确Tim-4是否影响脂肪组织调控能量代谢,我们分离了两组肥胖模型小鼠的棕色脂肪及白色脂肪,利用qPCR和WB技术检测棕色脂肪组织中产热功能的标记分子解偶联蛋白l(uncoupling protein 1,UCP1),发现Tim-4敲除后可降低UCP1的表达,提示Tim-4敲除后减弱棕色脂肪的产热功能。另外,白色脂肪的米色化也是增强能量代谢的重要方式,因此利用qPCR技术检测皮下脂肪组织中米色化指标的表达,发现Tim-4敲除后UCP-1、Ear2、Tmem26、CD137mRNA的水平显着降低。以上结果均表明,Tim-4敲除后可使小鼠的能量代谢功能减弱。3.Tim-4对巨噬细胞极化的影响ATMs的极化和招募在肥胖的发生发展过程中发挥关键性作用,在肥胖的脂肪组织中,M1/M2型巨噬细胞的比例出现失衡,即M1型促炎巨噬细胞比例上调,M2型抑炎巨噬细胞比例下调,从而导致脂肪组织慢性炎症,而脂肪组织的局部炎症也会促进周边组织巨噬细胞募集至脂肪组织,从而进一步促进肥胖的发展进程。3.1 Tim-4敲除对高脂诱导肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞表型的影响利用Tim-4-/-和同窝对照小鼠通过HFD建立肥胖模型,ELISA检测血清炎症因子水平,结果发现,Tim-4-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平上调,提示Tim-4敲除后促进全身炎症水平。提取两组肥胖小鼠皮下脂肪组织的SVFs,利用qPCR和流式细胞术检测SVFs内M1/M2巨噬细胞的比例。qPCR结果显示,Tim-4-/-小鼠SVFs中高表达M1型巨噬细胞的标志性分子,如iNOS、TNF-α、Ccl2等,而低表达M2型巨噬细胞的标志性分子,如CD206、Argl、Retnla等。流式细胞术结果也表明,Tim-4-/-小鼠ATMs中Ml型巨噬细胞(CDllb+CDllc+)比例上调、M2型巨噬细胞(CDllb+CD206+)比例下调。另外,免疫荧光技术结果显示,Tim-4-/-小鼠ATMs中iNOS上调、Ym-1的表达下调。最后,我们还利用WB技术检测了附睾脂肪组织的SVFs中iNOS及Ym-1的表达,所得结论与免疫荧光的结果一致。以上结果共同表明,Tim-4敲除后可导致高脂诱导肥胖小鼠模型SVFs内M2型巨噬细胞的比例降低,从而促进体内的炎症反应。3.2 Tim-4调控M1/M2巨噬细胞的比例平衡3.2.1 Tim-4敲除可促进巨噬细胞内促炎因子的表达为了进一步明确Tim-4对巨噬细胞功能的调控作用,分别诱导培养正常饮食的Tim-4-/-与WT 鼠的BMDM,利用 LPS(100ng/ml)或IL-4(20ng/ml)处理24h,然后检测刺激前后巨噬细胞内炎症因子的表达变化。利用qPCR技术检测M1/M2巨噬细胞相关标记分子的表达,与SVFs结果相一致,当利用LPS将BMDM诱导成M1表型后,与对照组相比,Tim-4-/-小鼠来源的BMDM高表达M1型巨噬细胞标志性分子,如iNOS、TNF-α、Ccl2等,而当利用IL-4将BMDM诱导成M2表型后,Tim-4-/-小鼠来源的BMDM低表达M2型巨噬细胞的标志性分子,如CD206、Argl、Retnla等。WB结果显示,LPS刺激后Tim-4-/-组小鼠的BMDM表达iNOS的水平上调,而IL-4刺激后则可下调Ym-1的表达。以上结果表明,Tim-4敲除后可促进M1型巨噬细胞相关促炎因子的表达,提示Tim-4可能与巨噬细胞的表型转化有关。3.2.2 Tim-4敲除可促进巨噬细胞向M1促炎表型转化为了明确Tim-4在巨噬细胞表型转化中的作用,利用流式细胞术检测LPS或IL-4刺激后两组巨噬细胞的表型变化。结果显示,LPS刺激后Tim-4敲除使Ml型巨噬细胞的比例上调,同时IL-4刺激后M2型巨噬细胞比例下调。以上结果与体内结果一致,表明Tim-4敲除后导致M2型巨噬细胞的比例下调,提示Tim-4可能通过调节M1/M2巨噬细胞的平衡参与肥胖进程。为了明确肥胖微环境对Tim-4调节M1/M2巨噬细胞平衡的影响,利用肥胖小鼠血清分别刺激Tim-4-/-及对照小鼠来源的BMDM,流式细胞术检测其表型变化。结果发现Tim-4-/-小鼠来源的BMDM经肥胖小鼠血清刺激后M1型巨噬细胞比例上调,M2型巨噬细胞比例下调。以上结果进一步证明,Tim-4可调控M1/M2型巨噬细胞的比例平衡。4.Tim-4调控巨噬细胞极化的机制巨噬细胞在维持M1/M2表型的平衡会涉及多种机制,目前比较明确的主要信号分子和转录因子有:信号传导及转录激活因子(STAT)、核因子κB(NF-κB)、干扰素调节因子(IRF)以及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、肝X受体(LXR)等。实验室前期发现,Tim-4可通过NF-κB通路调节巨噬细胞产生NO,推测Tim-4可能通过NF-κB通路调控M1/M2型巨噬细胞的比例平衡。4.1 Tim-4对NF-κB通路的影响为进一步明确肥胖微环境下Tim-4对NF-κB通路的影响,我们利用db/db肥胖小鼠及对照小鼠血清分别刺激Tim-4敲除与WT鼠来源的BMDM,结果发现,肥胖小鼠的血清可以促进两组BMDM中NF-κB p65的磷酸化,但Tim-4-/-组NF-κB p65的活化程度更强。利用HEK293细胞分别转染Tim-4过表达及对照质粒DNA,然后均转染pNF-KB-luc双荧光报告基因质粒,检测两组中NF-κB的激活水平是否存在差异,结果发现Tim-4过表达后可以抑制NF-κB的激活。Tim-4-/-与WT小鼠的BMDM分别利用LPS(100ng/ml)进行刺激,于刺激后0、15、30min收取细胞蛋白,利用WB技术检测NF-κB信号通路中IKKα/β、IKBα、p65的活化情况,结果发现在LPS的刺激下,Tim-4敲除可增强NF-κB信号通路中IKKα/β、IKBα、p65的活化。以上结果证明,Tim-4敲除后可促进LPS诱导的巨噬细胞NF-κB通路的活化。4.2 Tim-4通过NF-κB通路调节巨噬细胞极化为了明确NF-κB通路在Tim-4调控巨噬细胞极化中的作用,我们利用NF-κB通路抑制剂对BMDM进行处理,观察Tim-4-/-与WT小鼠的BMDM表达M1、M2型巨噬细胞表型分子的差异。首先,对两组BMDM进行LPS刺激18h后,然后分别加入DMSO及NF-κB通路抑制剂处理6h,qPCR检测M1型巨噬细胞相关促炎因子的表达,结果发现,LPS刺激可促进Tim-4敲除BMDM促炎分子iNOS、TNF-α、IL-1β的表达,而NF-κB通路抑制剂组则可逆转该效应。另外,两组BMDM分别进行LPS或IL-4刺激,并加入DMSO或NF-κB通路抑制剂处理,利用流式细胞术检测巨噬细胞极化的比例。结果发现,LPS刺激后Tim-4-/-组BMDM中M1型比例显着上调,IL-4刺激后M2型比例下调,而NF-κB通路抑制剂组中则未发现明显差异。以上结果证实,Tim-4通过NF-κB通路调节巨噬细胞的极化。5.Tim-4调节巨噬细胞在肥胖中的作用5.1 Tim-4敲除的巨噬细胞对脂肪细胞产热功能、米色化的影响为了进一步明确Tim-4对脂肪细胞能量代谢的影响,将3T3-L1细胞系诱导为成熟的脂肪细胞,分别与IL-4刺激的Tim-4-/-与WT小鼠的BMDM共培养24h,然后检测两组巨噬细胞对脂肪细胞产热功能及米色化相关标记分子的影响。利用qPCR技术检测共培养后脂肪细胞中UCP-1、Ear2、Tmem26及CD137的表达,结果发现,与Tim-4敲除的巨噬细胞共培养的脂肪细胞表达上述分子显着降低,说明巨噬细胞敲除Tim-4后可抑制脂肪细胞的产热功能以及向米色脂肪的转化。5.2 Tim-4敲除的巨噬细胞转输对肥胖进程的影响为了明确Tim-4调节巨噬细胞在肥胖进程的具体作用,在HFD诱导的肥胖小鼠模型中进行了ATMs转输实验。首先,利用WT小鼠进行高脂饲喂10周后,分别通过F4/80+磁珠分选纯化正常饮食WT及Tim-4-/-小鼠的ATMs,经腹腔注射转输到高脂喂养的WT小鼠,每隔4天转输1次,共转输6次。GTT及ITT结果显示,Tim-4KO-ATMs转输组小鼠糖耐量减弱,胰岛素抵抗无明显差异,Tim-4KO-ATMs转输组较WT-ATMs组附睾脂肪重量较高,但无统计学差异。另外,检测了血清中胰岛素、脂联素、TG、TC的水平,结果显示,Tim-4KO-ATMs转输组小鼠血清中胰岛素及TG的水平明显升高,其余指标无明显差异。为了明确Tim-4是否通过促进脂肪细胞的米色化增强能量代谢,qPCR检测了脂肪组织中产热功能及米色化相关标记分子的表达,结果发现,Tim-4KO-ATMs组小鼠附睾脂肪内低表达UCP-1、Ear2和Tmem26。最后,为了明确巨噬细胞Tim-4对脂肪组织内炎性因子表达的影响,qPCR检测结果发现,Tim-4KO-ATMs转输组小鼠附睾脂肪内高表达促炎因子TNF-α及IL-6,而抑炎分子Argl、Retnla的表达则较低。以上结果表明,Tim-4可调节巨噬细胞促炎功能,影响脂肪组织的代谢水平,进而干预肥胖进程。综上,本课题首次研究了Tim-4在肥胖中的表达变化,明确了 Tim-4在肥胖发生发展中的作用,并证明了 Tim-4分子通过NF-κB通路调控巨噬细胞功能抑制高脂饮食诱导的肥胖,为肥胖的干预提供新的潜在靶点。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-10）

陈博,万敬员^[4]（2019）在《从白介素受体相关激酶反馈平衡调节与清热解毒中药抗脓毒症相关作用机制》一文中研究指出天然免疫TLR信号是机体防御病原体第一道防线,但过度活化失控导致脓毒症,因此,寻找其平衡的分子靶标和有效药物就显得尤其重要。白介素-1受体相关激酶(IRAKs)是TLR信号关键分子,它连接受体和下游转录因子,决定天然免疫的信号流向,影响其结局。研究发现,这些信号激酶可发生多态性表达,产生正性和负性的分子异构体,平衡机体防御和炎症。无疑,调控正负IRAK激酶平衡将成为防控脓毒症的新靶标。清热解毒中药具有免疫调节和抗炎活性,现代医学用分子生物学、病理学和免疫学的方法,从调控IRAK激酶信号中确证平衡天然免疫的内源性机制,阐明了清热解毒中药的物质基础和分子机制,为中药现代化提供了新的思路。(本文来源于《中华中医药学刊》期刊2019年03期）

王婉瑕^[5]（2019）在《OsSULTR3.2调节水稻磷素平衡的分子生理机制研究》一文中研究指出磷是植物生长发育不可缺少的营养元素。磷酸盐转运体负责植物从土壤中吸收磷以及磷在植物体内各器官组织中的分配和转移。在本研究中,我们报导了水稻硫酸盐转运体(Sulfate transporter,Os SULTR)第叁家族中的一个成员Os SULTR3.2在水稻(Oryza sativa)中的功能。取得的主要研究结果如下:1.Os SULTR3.2(LOC_Os03g06520)是硫酸转运体家族的成员,开放阅读框(ORF)为1974 bp,编码657个氨基酸,由9个内含子和10个外显子组成。Os SULTR3.2具有12个跨膜区,并且Os SULTR3.2蛋白的氨基端和羧基端都朝向细胞质一侧,其羧基端有一个STAS(Sulfate Transporter and Anti-sigma Antagonist)结构域。2.Os SULTR3.2定位在内质网。在正常水稻营养液中Os SULTR3.2在主根和侧根中的表达模式一致,在根尖表达最强,另外在侧根原基也有表达。Os SULTR3.2主要在根的表皮细胞表达。Os SULTR3.2在叶片的叶肉细胞和维管束中都有表达,在维管束中主要在木质部表达,且在基部节大维管束的木质部表达。3.对OsSULTR3.2进行硫饥饿和磷饥饿响应分析发现:OsSULTR3.2的表达水平在缺硫条件下受到了显着的抑制,与正常供硫条件下相比,在缺硫20天的时候,Os SULTR3.2在野生型(SSBM)根里的表达水平降低了大约5倍。而Os SULTR3.2的表达水平受到磷饥饿的诱导,随着缺磷处理时间的增加,Os SULTR3.2在野生型根里的表达水平明显增加,在缺磷20天的时候与对照相比Os SULTR3.2的表达水平提高了6倍。但是在phr1 phr2 phr3(phr1/2/3)叁突变体中,Os SULTR3.2缺磷条件下的诱导表达水平没有发生明显的改变,说明Os SULTR3.2在转录水平上受缺磷诱导不依赖于PHR的调控。4.Os SULTR3.2在酵母中具有转运磷酸盐的功能,并且是低亲和的磷酸盐转运体。5.在正常供硫条件下,突变体Ossultr3.2地上部和根中的硫酸盐含量与野生型相比没有显着差异;分析不同叶片中硫酸盐的含量发现,突变体Ossultr3.2与野生型也没有显着差异。在正常供磷条件下,突变体Ossultr3.2地上部的无机磷含量显着高于野生型,而根中无机磷含量与野生型相比没有显着差异;分析不同叶片的无机磷含量发现,与野生型相比,Ossultr3.2老叶中无机磷含量升高。这些结果表明Os SULTR3.2参与磷酸盐在水稻体内的转运。总之,本研究揭示了Os SULTR3.2定位在细胞中的内质网膜上,在水稻根的表皮细胞、叶的木质部表达。q RT-PCR结果表明,Os SULTR3.2的表达受到磷饥饿的诱导。与野生型水稻相比,Ossultr3.2突变体地上部磷含量升高,且无机磷主要积累在老叶中。而Ossultr3.2突变体硫酸盐含量与野生型相比没有显着的差异。这些结果进一步表明Os SULTR3.2在水稻中行使磷酸盐转运体的功能。(本文来源于《浙江师范大学》期刊2019-03-06）

王文君^[6]（2019）在《肾脏中原肌球调节蛋白1对机体水平衡的调节及机制研究》一文中研究指出肾脏中肾小管和集合管对水的重吸收决定着机体的水平衡,而肾小管的小管液中溶质所形成的渗透压,是对抗水重吸收的力量。因此,肾脏对水和电解质的重吸收和排泄是相互影响的过程,它们的平衡决定着肾脏功能的正常发挥。由于近端小管对水的重吸收是定比重吸收,而远曲小管和集合管对水的重吸收是可调节的,该部位对水和电解质的重吸收和排泄对机体的水平衡发挥着决定性作用,因此其调节机制具有重要的意义。肌动蛋白细胞骨架可以调控细胞形状、细胞运动等细胞过程。有文献表明,肌动蛋白及其相关蛋白参与肾脏的水盐代谢等各种功能的调节。在对血管加压素处理的小鼠皮质集合管顶端膜进行的蛋白质组学分析中,人们发现约100种蛋白发生显着变化,其中20%与肌动蛋白细胞骨架结构有关,这突出了肌动蛋白细胞骨架在调节水平衡中的重要作用。我们的前期研究发现,肌动蛋白微丝(actin filament,F-actin)的一个盖帽蛋白--原肌球调节蛋白1(Tropomodulin1,Tmod1)在肾脏远曲小管和集合管中特异表达,但其作用还有待研究。目的:通过研究Tmod1肾脏特异性敲除对小鼠肾脏水重吸收功能的影响,分析肾脏中与Tmod1相关的蛋白调控网络,研究Tmod1对水通道蛋白及离子通道的影响,探讨Tmod1对机体水平衡的调节及其作用机制。方法:1.利用免疫组化,确定Tmod1在小鼠肾脏中的表达和定位。2.构建Tmod1 ~(flox/flox)小鼠,并将其与肾小管和集合管特异表达Cre基因的Ksp-Cre小鼠杂交,获得Tmod1肾脏特异性敲除小鼠Tmod1 ~(flox/flox)/Ksp-Cre~+(简称为TFK),用Tmod1 ~(flox/flox)/Ksp-Cre~-(简称为TF)小鼠作为对照。利用PCR和蛋白免疫印迹对小鼠进行鉴定。3.利用代谢笼测量并比较TF和TFK小鼠在基础状态、禁水和水负荷条件下的尿量、尿渗透压;利用无创血压测定仪测量两种小鼠的血压;利用生化分析,检测尿液中的离子浓度,计算电解质的排泄量。4.利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TF和TFK小鼠血液中血管升压素(AVP)的含量;向两种小鼠腹腔注射AVP,收集并测量2小时后的尿量和尿渗透压。5.分离TF和TFK小鼠的肾脏组织并提取蛋白,将其进行质谱蛋白质组学分析。对差异蛋白进行生物信息学分析,并对部分蛋白的表达进行验证。6.利用实时定量PCR和免疫印迹,检测TF和TFK小鼠肾脏中水通道和离子通道表达。结果:1.免疫组化结果显示,Tmod1在肾脏远曲小管和集合管表达。2.PCR和蛋白免疫印迹结果显示,TFK小鼠的肾小管和集合管中Tmod1被敲除。3.代谢笼结果显示,在基础状态下,TFK小鼠24小时尿量为0.81±0.14mL,显着低于TF小鼠(1.59±0.12 mL,P<0.01);其尿液渗透压为5494±259 mOsm/kg,显着高于TF小鼠的尿渗透压(3843±106mOsm/kg,P<0.01)。在禁水条件下,TFK小鼠的尿量为0.40±0.10 ml,亦明显低于TF小鼠(0.93±0.18mL,P<0.05);TFK小鼠的尿渗透压为6512±977 mOsm/kg,显着高于TF小鼠的尿渗透压(3709±319mOsm/kg,P<0.05)。在水负荷24小时的条件下,TFK小鼠尿量为8.50±0.85 mL,显着低于TF小鼠(10.92±0.45 mL,P<0.05),其尿渗透压为878±145 mOsm/kg,显着高于TF小鼠(492±16 mOsm/kg,P<0.05)。血压测量结果提示,TFK小鼠的收缩压为97.9±0.8 mmHg,显着高于TF小鼠(105.0±1.6 mmHg,P<0.05)。4.TFK小鼠在基础状态下24小时内,主要电解质(包括Na~+、K~+、Cl~-、Ca~(2+)、P)和尿素的排泄量均较TF小鼠降低(P<0.05)。5.ELISA检测显示,TFK小鼠血液中血管加压素水平与TF小鼠无差异;两种小鼠在注射AVP后,尿量均减少,尿渗透压均升高。6.质谱分析结果显示,与TF小鼠肾脏相比,在TFK小鼠肾脏中有83个差异表达(变化倍数>2或<0.5,P<0.05)蛋白,其中13个上调,70个下调。Gene Ontology分析显示,差异表达基因与蛋白磷酸化、代谢过程、磷酸化过程和细胞内信号转导等生物过程有关,还与细胞外泌体、线粒体、溶酶体等细胞成分有关。7.蛋白免疫印迹实验显示,所筛选出的TGFβR2、SlC25A11和MTFP1等蛋白均在TFK小鼠肾脏中表达下调。8.qPCR和蛋白免疫印迹结果显示,与TF小鼠肾脏相比,TFK小鼠肾脏中AQP2、AQP4和氯离子通道CFTR的表达均显着上调。结论:Tmod1的敲除能够引起小鼠尿浓缩能力的改变,使小鼠表现出少尿、高渗尿和高血压的特征,肾脏中Tmod1可以影响多种蛋白的表达,参与调节肾脏的多种生物过程,特别是通过对水通道及离子通道的调节,进而影响机体的水平衡稳态。(本文来源于《承德医学院》期刊2019-03-01）

高天宇,元文学,张孝权,张永会^[7]（2018）在《视觉剥夺前后老年人步态平衡调节机制研究》一文中研究指出研究目的:探讨老年受试者视觉剥夺前后下肢步行平衡调节机制的变化。研究方法:选取普通无损伤老年女性受试者8名,利用Vicon红外高速运动捕捉系统和Noraxon表面肌电测试仪对受试者下肢步态的运动学和肌肉力学指标进行同步采集;使用配对样本T检验分析比较视觉剥夺前后差异。研究结果:(1)视觉剥夺后支撑相期间踝关节最大背屈角度显着大于视觉剥夺前(P<0.05);(本文来源于《第二十届全国运动生物力学学术交流大会论文摘要汇编》期刊2018-08-20）

任俊杰^[8]（2018）在《小鼠肝纤维化形成中IGFBPrP1对MMPs/TIMPs平衡的调节及其机制研究》一文中研究指出研究背景慢性肝病严重危害着人类的健康。病毒性肝炎、酒精、药物、自身免疫性肝病等十多种因素引起的慢性肝病均可导致机体产生对损伤的一种代偿性修复反应,发生肝纤维化(HF)。针对肝纤维化发病机制的研究,有助于早期发现并诊断肝纤维化。不同的损伤因素作用于肝脏后,肝纤维化发生的病理生理过程、参与的细胞因子存在不同程度差异,但是肝星状细胞(HSC)活化、细胞外基质(ECM)沉积,最终导致肝脏纤维化发生是其共同病理生理过程。因此,采用不同病因致肝纤维化动物模型进行研究有助于从不同角度阐明早期肝纤维化的发病机制。肝脏ECM的合成和降解由基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)共同调节。损伤因素作用于肝脏后可导致HSC活化,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),MMPs表达上调,TIMPs也随之上调,导致了不同MMPs/TIMPs动态表达的比例失衡,以I型胶原为主的ECM的合成和降解也随之失衡,过量沉积在肝内,促进了肝纤维化及肝硬化的形成。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPr Pl),是导师课题组十余年来在国家自然科学基金资助下发现的新的致肝纤维化因子并对其致肝纤维化的机制做了大量研究工作。IGFBPr Pl在致肝纤维化过程中,对HSC活化及ECM的合成、降解、重塑发挥着重要的作用。转化生长因子β1(TGFβ1)是目前公认的最强效的致肝纤维化细胞因子,IGFBPr P1与TGFβ1相互作用,相互影响,二者共同作用促进了肝纤维化的发生发展。那么,IGFBPr P1是否通过调节MMPs/TIMPs平衡致ECM沉积?目前国内外尚未见相关报道。Hedgehog(Hh)信号转导通路是参与早期发育的经典通路之一,控制着细胞的生长与增殖,可能在肝纤维化中起调控作用。导师课题组前期运用PCR Array筛选IGFBPr P1致肝纤维化的信号转导通路差异表达基因后发现,IGFBPr P1可以通过Hh通路导致肝脏HSC活化,ECM增多,促进肝纤维化发生发展。那么,肝脏IGFBPr P1、MMPs/TIMPs平衡与Hh信号通路叁者之间的调节关系如何,目前国内外尚未见相关报道。为此,本课题拟深入研究IGFBPr Pl致肝纤维化发生发展过程中,是否通过调节MMPs/TIMPs平衡发挥作用,探索IGFBPr Pl对MMPs/TIMPs平衡的调节与Hh信号通路的关系。第一部分IGFBPr P1及MMPs/TIMPs平衡在小鼠肝纤维化组织中的动态变化及意义实验一TAA或BDL致小鼠肝纤维化过程中IGFBPr P1及MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1的动态表达变化目的:观察硫代乙酰胺(TAA)致小鼠肝纤维化或胆总管结扎(BDL)致小鼠肝纤维化形成过程中,IGFBPr P1以及MMPs/TIMPs平衡的动态变化。方法:(1)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为叁组:正常组:正常饲养;对照组:腹腔注射生理盐水0.1ml/10g,每周3次;TAA组:腹腔注射TAA 100mg/Kg,每周3次。不同时间点(2w、4w、6w)麻醉动物后留取血清及肝组织样本,观察肝脏病理学改变,检测血清学指标,免疫组化及western blot方法检测肝组织IGFBPr P1、α-SMA、TGFβ1、MMPs、TIMPs等蛋白表达,Pearson相关分析肝组织中IGFBPr P1与MMPs、TIMPs蛋白表达的相关性。(2)C57BL/6野生型小鼠78只随机分为叁组:正常组:正常饲养;对照组:仅分离胆总管;BDL组:实施BDL术。标本采集及检测同(1)。结果:(1)血清肝功能指标:TAA作用于小鼠2w,血清ALT、AST、LDH水平明显升高,4w、6w逐渐下降(P<0.05)。小鼠实施BDL后2w,血清ALT、AST水平明显升高,4w、6w逐渐下降(P<0.05);小鼠实施BDL后,随着病变发展,ALP及DBIL/TBIL比值逐渐增高(P<0.05);BDL后2w,血清GGT、LDH、TBIL水平明显升高,4w达到高峰,6w逐渐下降(P<0.05)。(2)肝组织HE和Sirius red染色:TAA作用于小鼠后,随着病变进展,大量炎细胞浸润,肝细胞变性坏死,纤维组织增生,形成肝纤维化。小鼠实施BDL后,随着病变进展,汇管区扩大,胆管扩张,炎性细胞浸润,大量小胆管增生,胶原纤维沉积,形成肝纤维化。(3)ELISA、免疫组化及western blot方法检测血清和肝脏中IGFBPr P1等蛋白表达:TAA或BDL作用于小鼠后,血清及肝脏IGFBPr P1表达随着肝纤维化程度加重逐渐升高(P<0.05),肝脏α-SMA、TGFβ1、CollagenⅠ在肝纤维化过程中表达逐渐增多(P<0.05)。(4)免疫组化及western blot方法检测肝脏中MMPs、TIMPs的表达:分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达,TAA作用于小鼠后,MMP2/TIMP2比值在2w组无变化,4w及6w组比值增高(P<0.05);各时间点MMP9/TIMP1比值显着降低(P<0.05)。小鼠实施BDL后,MMP2/TIMP2比值在2w、6w组下降(P<0.05),4w组无变化;各时间点MMP9/TIMP1比值显着降低(P<0.05)。(5)肝组织中IGFBPr P1与MMPs、TIMPs蛋白表达的相关性:在TAA作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1的相关系数分别为r=0.891,0.931,0.954,0.965,P<0.01,呈正相关关系。在BDL作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1的相关系数分别为r=0.930,0.941,0.914,0.946,P<0.01,呈正相关关系。结论:TAA或BDL作用于小鼠不同时间后,可使HSC活化、IGFBPr Pl及TGFβ1的表达上调、MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1的表达失衡,最终形成不同程度的肝纤维化第二部分IGFBPr P1过表达致小鼠肝纤维化形成中对MMPs/TIMPs平衡的调节实验二Ad IGFBPr P1基因转染致小鼠肝纤维化及其对MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡的调节目的:观察Ad IGFBPr P1基因转染致小鼠肝纤维化过程中,MMPs/TIMPs平衡的变化,明确肝脏IGFBPr P1与MMPs/TIMPs的关系及意义。方法:C57BL/6野生型小鼠135只随机分为叁组:正常组:正常饲养;CAd组:尾静脉注射CAd 2×109pfu/只;Ad IGFBPr P1组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1 2×109pfu/只。分别于不同时间点(1w、2w、4w、8w、12w)标本采集及检测,检测方法同实验一。结果:(1)荧光显微镜EGFP表达:腺病毒转染1 w,肝组织可见绿色荧光,转染2 w时,可见明亮绿色荧光,EGFP表达明显增多,4w时绿色荧光逐渐减弱甚至消失。(2)血清肝功能指标:Ad IGFBPr P1转染小鼠1w后,ALT、AST迅速升高,后期逐渐下降(P<0.05);LDH在2w达高峰(P<0.05),后降至正常。(3)肝组织HE和Sirius red染色:Ad IGFBPr P1转染小鼠后,随着病变不断进展,大量炎细胞浸润,胶原纤维增生,肝细胞变性坏死,肝小叶结构遭到破坏,形成肝纤维化。(4)ELISA、免疫组化及western blot方法检测血清和肝脏中IGFBPr P1等蛋白的表达:Ad IGFBPr P1转染小鼠后,血清及肝组织中IGFBPr P1开始升高,2w达高峰(P<0.05)。肝脏α-SMA、TGFβ1、CollagenⅠ在肝纤维化过程中表达逐渐增多(P<0.05)。(5)免疫组化及western blot方法检测肝脏中MMPs、TIMPs的表达:Ad IGFBPr P1转染小鼠后,分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达后,各时间点MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1比值均降低(P<0.05)。结论:IGFBPr P1基因通过腺病毒转染至小鼠肝组织,导致了肝纤维化的发生,其作用可能与HSC的活化、TGFβ1表达上调、MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1表达失衡有关。第叁部分下调IGFBPr P1对肝纤维形成中MMPs/TIMPs平衡的影响实验叁Sh RNA-IGFBPr P1的构建及其细胞水平对MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡的影响目的:构建并筛选干扰效率最高的sh RNA-IGFBPr P1质粒,探讨下调NIH/3T3细胞中IGFBPr P1的表达是否通过逆转MMPs/TIMPs平衡来减少ECM的产生。方法:(1)构建叁条sh RNA-IGFBPr P1干扰质粒及一条空载体质粒,分别转染NIH/3T3细胞,筛选干扰效率最高的sh RNA-IGFBPr P1质粒。(2)分别将干扰效率最高的质粒和空质粒转染NIH/3T3细胞,于24h、48h、72h、96h后收取细胞样品,实时荧光定量PCR及western blot方法检测肝组织α-SMA、TGFβ1、MMPs、TIMPs m RNA及蛋白表达和平衡变化。结果:(1)荧光定量PCR及western blot检测IGFBPr P1 m RNA及蛋白表达:与对照组及空质粒组相比,转染72h,各质粒对IGFBPr P1 m RNA及蛋白表达呈不同程度的抑制,其中以sh RNA-IGFBPr P1-1的抑制率最高(P<0.05)。(2)荧光定量PCR及western blot检测α-SMA等m RNA及蛋白表达:转染sh RNA-IGFBPr P1后,各时间点TGFβ1、α-SMA、Fibronectin m RNA及蛋白表达量均下降(P<0.05)。(3)荧光定量PCR及western blot检测MMPs、TIMPs m RNA及蛋白表达:转染sh RNA-IGFBPr P1后,分析各时间点的MMPs、TIMPs m RNA及蛋白表达后,MMP2/TIMP2及MMP9/TIMP1比值增加(P<0.05)。结论:减少NIH/3T3细胞中IGFBPr P1的表达,可明显抑制细胞的活化,减少TGFβ1的表达,逆转细胞内MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡,减少ECM的合成和分泌而改善肝纤维化。实验四UTMD靶向介导CMB-sh RNA下调IGFBPr P1对小鼠肝纤维化中MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡的影响目的:探讨下调肝纤维化组织中IGFBPr P1的表达是否通过逆转MMPs/TIMPs平衡来减少ECM的产生,从而逆转肝纤维化。方法:(1)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为叁组:TAA组:腹腔注射TAA 100mg/Kg,每周3次;TAA+sh RNA-NC组:TAA作用1w后尾静脉注射CMB-sh RNA-NC,行超声靶向微泡破碎(UTMD);TAA+sh RNA-IGFBPr P1组:TAA作用1w后尾静脉注射CMB-sh RNA-IGFBPr P1,行UTMD。标本采集及检测同实验一。(2)C57BL/6野生型小鼠90只随机分为叁组:BDL组:实施BDL术;BDL+sh RNA-NC组:BDL术后1w尾静脉注射CMB-sh RNA-NC,行UTMD;BDL+sh RNA-IGFBPr P1组:BDL术后1w尾静脉注射CMB-sh RNA-IGFBPr P1,行UTMD。标本采集及检测同实验一。结果:(1)免疫组化及western blot方法检测肝脏IGFBPr P1等蛋白的表达:随着病变进展,在TAA或BDL致肝纤维化模型,转染sh RNA-IGFBPr P1质粒,小鼠肝组织中IGFBPr P1、TGFβ1、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达均下降(P<0.05)。(2)免疫组化及western blot方法检测肝脏MMPs、TIMPs的表达:在TAA或BDL致肝纤维化模型,分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达,转染sh RNA-IGFBPr P1质粒,各时间点小鼠肝组织中MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1比值增高(P<0.05)。结论:UTMD介导的CMB-sh RNA-IGFBPr P1可显着改善小鼠肝纤维化发展进程,该作用与靶向减少肝组织中IGFBPr P1表达,从而抑制HSC的活化、下调TGFβ1的表达、逆转MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1平衡有关。第四部分小鼠肝纤维化形成中IGFBPr P1对MMPs/TIMPs平衡调节与Hh信号通路的关系实验五Hh信号通路在小鼠肝纤维化发生发展中的表达变化目的:探讨Hh信号通路在IGFBPr P1致小鼠肝纤维化发生发展中的作用。方法:动物分组及处理同实验一、实验二。免疫组化及western blot方法检测肝脏Shh、Gli1蛋白表达,Pearson相关分析肝组织中IGFBPr P1与Shh、Gli1蛋白表达的相关性。结果:(1)免疫组化及western blot方法检测肝脏Shh、Gli1蛋白表达:TAA或BDL作用于小鼠后,随着肝纤维化程度加重,肝脏Shh、Gli1蛋白表达明显增多(P<0.05);Ad IGFBPr P1转染小鼠后,随着肝纤维化发展,肝脏Shh、Gli1表达逐渐增多(P<0.05)。(2)肝组织中IGFBPr P1与Shh、Gli1的相关性分析:在TAA作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与Shh、Gli1的相关系数分别为r=0.910,0.926,P<0.01,呈正相关关系;在BDL作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与Shh、Gli1的相关系数分别为r=0.918,0.950,P<0.01,呈正相关关系。结论:IGFBPr P1可通过激活Hh信号通路而致肝纤维化。实验六下调IGFBPr P1表达对小鼠肝纤维化发生发展中Hh信号通路的影响目的:探索下调肝纤维化组织或NIH/3T3细胞中IGFBPr P1的表达,Hh通路的变化及意义。方法:细胞分组及处理同实验叁,动物分组及处理同实验四。实时荧光定量PCR方法检测细胞中Shh、Gli1 m RNA表达,免疫组化及western blot方法检测细胞或肝组织中Shh、Gli1蛋白表达。结果:(1)实时荧光定量PCR方法及western blot方法检测细胞中Shh、Gli1 m RNA及蛋白表达:细胞转染sh RNA-IGFBPr P1 24h、48h、72h、96h后,Shh、Gli1 m RNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。(2)免疫组化及western blot方法检测细胞或肝组织中Shh、Gli1蛋白表达:UTMD介导sh RNA-IGFBPr P1质粒在TAA或BDL致肝纤维化小鼠体内转染后,随着肝纤维化进展,肝组织Shh、Gli1蛋白表达均相对减少(P<0.05)。结论:减少NIH/3T3细胞或肝组织IGFBPr P1的表达可延缓肝纤维化进程,该作用与抑制Hh信号通路及HSC的活化、TGFβ1表达下调、逆转MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1平衡有关。实验七Hh信号通路特异性抑制剂cyclopamine对IGFBPr P1介导MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡调节的影响目的:明确Hh通路阻断剂cyclopamine是否可以通过抑制Hh信号通路,逆转MMPs/TIMPs平衡,从而减缓IGFBPr P1致肝纤维化进程。方法:(1)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为叁组:TAA组:腹腔注射TAA 100mg/Kg,每周3次;TAA+Vehicle组:TAA作用1w后腹腔注射溶剂0.15ml/10g/d,持续2w;TAA+cyclopamine组:TAA作用1w后腹腔注射cyclopamine 15mg/Kg/d,持续2w。标本采集及检测同实验一及实验五。(2)C57BL/6野生型小鼠90只随机分为叁组:BDL组:行BDL术;BDL+Vehicle组:BDL术1w后腹腔注射溶剂0.15ml/10g/d,持续2w;BDL+cyclopamine组:BDL术1w后腹腔注射cyclopamine 15mg/Kg/d,持续2w。标本采集及检测同实验一及实验五。(3)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为叁组:Ad IGFBPr P1组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1;Ad IGFBPr P1+Vehicle组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1 1w后腹腔注射溶剂0.15ml/10g/d,持续2w;Ad IGFBPr P1+cyclopamine组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1 1w后腹腔注射cyclopamine 15mg/Kg/d,持续2w。标本采集及检测同实验一及实验五。结果:(1)免疫组化及western blot方法检测肝组织中Shh、Gli1蛋白表达:在TAA/BDL/Ad IGFBPr P1致肝纤维化小鼠,腹腔注射cyclopamine,肝组织中的Shh、Gli1蛋白表达相对减少(P<0.05)。(2)免疫组化及western blot方法检测肝组织中IGFBPr P1、α-SMA等蛋白表达:在TAA/BDL/Ad IGFBPr P1致肝纤维化小鼠,腹腔注射cyclopamine,肝组织中的TGFβ1、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达相对减少(P<0.05),IGFBPr P1在早期表达无变化,后期表达相对减少(P<0.05)。(3)免疫组化及western blot方法检测肝组织中MMPs、TIMPs蛋白表达:在TAA/BDL/Ad IGFBPr P1致肝纤维化小鼠,腹腔注射cyclopamine,分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达后,MMP2/TIMP2及MMP9/TIMP1比值均增高(P<0.05)。结论:Hh通路阻断剂cyclopamine可延缓IGFBPr P1致肝纤维化进程,该作用与抑制Hh信号通路及HSC的活化、TGFβ1表达下调、逆转MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1平衡有关。(本文来源于《山西医科大学》期刊2018-06-06）

黄强^[9]（2018）在《鲟鱼油调节肠道菌群平衡缓解NAFLD机制》一文中研究指出鲟鱼油是从人工饲养的鲟鱼内脏中提取的一种新型油脂资源,ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)含量较高,但脂肪酸组成不同于深海鱼油,其健康作用及对脂代谢的影响尚未见研究。有研究显示,富含ω-3 PUFAs的深海鱼油可以干预非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的进程,改善脂质代谢,缓解肝损伤和肝炎症,但其具体机制尚不完全清楚。而对于新型油脂资源的鲟鱼油是否具有类似的调节脂质代谢等健康作用有待深入研究。目的:研究富含ω-3 PUFA鲟鱼油调节肠道菌群平衡,缓解NAFLD的作用机制。方法:雄性C57BL/6J小鼠SPF(specific pathogen-free,SPF)60只按体重排序随机分为叁组,正常对照组(CON,n=20)、NAFLD模型组(High Fat Diets,HFD,n=20),鲟鱼油干预组(sturgeon fish oil,SF,n=20)。24w收集小鼠粪便、血液、肝脏、肠等材料。检测小鼠血浆中TC、LDL-C、TG、ALT、AST等含量,肝组织通过HE染色技术来观察心态学变化。采用PCR-DGGE技术分析小鼠肠道菌群变化。肠道组织和肝组织中炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α等)、肠链接蛋白OCLU和ZO-1的表达、肝组织TLR4炎性信号通路及相关因子的表达变化主要使用qPCR和western blot技术检测。结果:肝脏HE染色显示富含鲟鱼油干预组肝脏脂质聚积减轻,炎性细胞浸润减少。相比于HFD组,鲟鱼油干预组血浆中肝功能指标ALT和AST活力显着下降,同时qPCR和western blot检测表明:HFD组肠道组织、肝组织促炎因子IL-1β,TNF-α,和IL-6等表达显着增加,而SF组则显着减低。与正常对照组比较,高脂组小鼠肠道菌群细菌总量显着上升,Parabacteroides减少,Enterobacter cloacae、Clostridium clariflavum上升,肠道肠链接蛋白OCLU和ZO-1表达降低,而鲟鱼油干预组的菌群相比高脂组总量升高,叁种菌数量降低,肠连接蛋白表达显着升高。肝组织TLR4信号途径分子在高脂组显着升高,SF组则显着减低。结论:富含ω-3 PUFA的鲟鱼油通过调节肠道菌群的平衡,缓解肠道炎症,改善肠壁的屏障功能,缓解内毒素相关的肝组织TLR4信号通路导致的炎性反应,从而缓解NAFLD的发展。(本文来源于《武汉轻工大学》期刊2018-05-01）

谢东杰^[10]（2018）在《益气养阴清热化瘀方调节Th17/Treg平衡治疗免疫性血小板减少症作用机制的研究》一文中研究指出目的:通过构建ITP小鼠模型,明确益气养阴清热化瘀方对ITP的治疗效果并对各组小鼠外周血Th17、Treg细胞的比值、脾脏中Th17、Treg相关转录因子及外周血Th17、Treg相关细胞因子的水平进行检测分析。探讨该方在ITP中发挥治疗作用的最佳有效剂量与可能的作用靶点,为临床治疗ITP提供相应的理论依据。方法:1.ITP小鼠模型的建立及评估:将健康雌性BALB/C小鼠随机分为正常组(n=20),ITP模型组(n=110),采用针对血小板表面膜糖蛋白GPIIb/IIIa的被动免疫法,将模型组小鼠腹腔注射含2μg大鼠抗小鼠CD41单克隆抗体(MWReg30单抗)的磷酸盐缓冲液200μl,造成持续的血小板减少症,建立ITP小鼠模型。正常组则采用同样的方式注射等量生理盐水。造模开始第1、3、5、7天通过检测外周血小板计数并结合骨髓巨核细胞象进行模型评估。2.益气养阴清热化瘀方对ITP模型的药效学研究:实验第8天将ITP模型组再次随机分为模型组、合方(益气养阴清热化瘀方)低、中、高剂量组、西药对照组(以醋酸泼尼松对照)(n=20),各治疗组按给药剂量进行药物干预2周,观察各组小鼠一般状况的改变,检测各组小鼠外周血血小板计数、骨髓巨核细胞象从而对该方行药效学评价。3.益气养阴清热化瘀方治疗ITP模型作用机制的研究:采用流式细胞术(FCM)检测各组外周血Th17、Treg细胞的比值;q PCR、Western blot检测脾脏中Th17、Treg细胞特征性转录因子RORγt、STAT3及Fox P3基因和蛋白的表达水平;ELISA检测各组外周血Th17、Treg相关细胞因子IL-17、IL-21、IL-10的表达水平,探讨益气养阴清热化瘀方发挥效应的可能机制。结果:1.ITP模型的建立:与正常组相比较,ITP模型组在注射CD41单克隆抗体(MWReg30单抗)后外周血小板显着减少了正常组的一半以下且骨髓不产板及幼稚的巨核细胞数显着增加,符合ITP模型鼠的病理特征。2.血小板计数的改变:与模型组相比较,各治疗组血小板数值均有不同幅度的升高,差异均有统计学意义。其中,合方中剂量组与西药对照组血小板上升最为明显(P<0.01),而两组组间差异无统计学意义(P>0.05)。3.骨髓巨核细胞象的改变:与模型组相比较,各治疗组小鼠骨髓不产板巨核细胞及幼稚巨核细胞的数量均有所减少。其中,以合方中剂量组疗效更为显着。4.外周血Th17、Treg细胞数量的变化:与正常组相比较,模型组Th17细胞数量异常升高(P<0.05),Treg细胞数量显着降低(P<0.05);与模型组相比,合方中剂量组、西药对照组中的Th17细胞数量均明显下降(P<0.01,P<0.05),Treg细胞数量显着增加(P<0.01,P<0.05)。5.脾脏中Th17、Treg转录因子的变化:与正常组相比较,脾脏中Th17相关的转录因子RORγt、STAT3基因和蛋白的相对表达量异常增高(P<0.01),Treg细胞特异性的转录因子Fox P3基因、蛋白的相对表达量明显下降(P<0.01)。与模型组相比,经合方中剂量组、西药对照组干预后RORγt、STAT3基因及蛋白的相对表达量明显减少(P<0.01),而Fox P3基因、蛋白的相对表达量显着增加(P<0.01)。6.外周血Th17、Treg细胞因子的变化:与正常组相比较,外周血中Th17细胞相关的促炎因子IL-17、IL-21的表达显着升高(P<0.01),Treg相关的抑炎因子IL-10的表达显着降低(P<0.01);与模型组相比,经合方中剂量组、西药对照组干预后IL-17、IL-21的表达显着降低(P<0.01),IL-10的表达水平显着升高(P<0.01)。结论:益气养阴清热化瘀方具有显着升高及维持ITP模型血小板水平,促进骨髓巨核细胞分化的作用。其可能的作用机制为:抑制体内Th17相关的转录因子RORγt及STAT3表达,提高Treg细胞转录因子Fox P3的表达水平,从而减少Th17的产生,增加Treg的数量,调整Th17/Treg比值,使促炎因子IL-17、IL-21分泌减少,抑炎因子IL-10分泌增加,促进机体免疫稳态的恢复,使血小板破坏减少,生成增加,对ITP产生积极的保护作用。(本文来源于《天津医科大学》期刊2018-05-01）

平衡调节机制论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

1.研究背景及目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是以自身免疫功能紊乱为特征的特发性肠道炎症,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn' s disease,CD),发病率高、病势缠绵、治疗难度大,新治疗方法的研发十分必要。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是在上世纪70年代由中国科学家从菊科蒿属植物中提取得到的青蒿素的衍生物,是临床广泛应用的抗疟药物。除了治疗疟疾外,双氢青蒿素也被发现对红斑狼疮、类风湿关节炎以及多发性硬化等自身免疫病具有缓解病情和调节Th/Treg平衡的作用,但其对炎症性肠病的作用及机制研究尚在起步阶段。在化学方法诱导的小鼠炎症性肠病模型中,恶唑酮(Oxazolone,OXA)和 2,4,6-叁硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠模型在组织病理学特征方面与人类UC和CD类似,并且分别适用于对Th9和Th1/Th17的研究。本文基于Th/Treg平衡调节,探索DHA对小鼠IBD模型的药效作用和免疫调节机制,为进一步拓展青蒿素类药物临床新适应症奠定基础。2.研究方法和内容2.1双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病OXA模型和TNBS模型的药效作用研究建立恶唑酮和2,4,6-叁硝基苯磺酸诱导的小鼠炎症性肠病模型,以DHA4mg/kg/d、8mg/kg/d、16mg/kg/d为低、中、高剂量,地塞米松磷酸钠注射液1mg/kg/d为阳性药,分别在小鼠灌肠造模后8h、24h、48h腹腔注射,正常对照(Negative Control,NC)和OXA模型组、TNBS模型组予等剂量溶剂,共给药3次,在小鼠造模后Oh、8h、24h、48h和72h,记录一般状态,饮食饮水、腹泻便血程度,体重变化、死亡数量,评价疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。在小鼠造模72h后,麻醉,断颈处死并迅速取出OXA模型小鼠结肠组织和TNBS模型小鼠小肠组织,清洗后擦干平铺,观察大体病变程度,称重并记录长度,以4%多聚甲醛固定后,切片,进行H&E染色和天狼星红染色,光学显微镜下观察,分别记录淋巴细胞浸润程度和计算组织纤维化面积占比。2.2双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响在OXA模型中,利用Real-Time PCR方法检测小鼠结肠组织中Th9细胞转录因子PU.1和细胞因子IL9、Th22细胞转录因子AHR和细胞因子IL22、Treg细胞转录因子Foxp3和细胞因子IL10的mRNA表达水平,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th9、Th22和Treg细胞分布比例,利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th9细胞转录因子PU.1、Th22细胞转录因子AHR以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。在TNBS模型中,利用Real-Time PCR方法检测小鼠小肠组织Th1细胞转录因子T-bet和细胞因子IFN γ、Th17细胞转录因子RORγt、Treg细胞转录因子Foxp3和细胞因子IL10的mRNA表达水平,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠小肠固有层淋巴细胞中Th1细胞转录因子T-bet、Th17细胞转录因子ROR y t以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。2.3基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对激活CD4+T淋巴细胞的影响免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,在抗CD3/CD28抗体激活条件下,予DMS0或DHAO.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml培养72h后计算细胞存活率;予DMSO、DHAO.8mg/ml、SnPP(HO-1抑制剂)30nmol/ml或DHA+SnPP培养72h后计算细胞存活率,并采用ELISA法检测细胞培养上清中Heme Oxygenase-1(HO-1)的表达水平,PI双染法检测细胞凋亡比例。在OXA模型中,分离提取小鼠结肠固有层淋巴细胞并计数,TUNEL染色法计算小鼠结肠组织中凋亡细胞比例;在TNBS模型中,分离提取小鼠小肠固有层淋巴细胞并计数,TUNEL染色法计算小肠组织中凋亡细胞比例。2.4基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型病情的影响建立OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型,将小鼠分为NC组、模型组、DHA16mg/kg/d组、SnPP30umol/kg/d组、DHA+SnPP组,分别在小鼠灌肠造模后8h、24h、48h腹腔注射,SnPP分别在造模后Oh,24h和48h颈后皮下注射,NC和模型组予等剂量溶剂,在小鼠造模后Oh、8h、24h、48h和72h,记录一般状态,饮食饮水、腹泻便血程度,体重变化、死亡数量,DAI评分。在小鼠造模72h后,麻醉,断颈处死并迅速取出结肠或小肠组织,清洗后擦干并以4%多聚甲醛固定后,切片,进行H&E染色和天狼星红染色,光学显微镜下观察,分别记录淋巴细胞浸润程度和计算组织纤维化面积占比。2.5基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响在OXA模型中,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th9、Th22和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th9细胞转录因子PU.1、Th22细胞转录因子AHR以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。在TNBS模型中,利用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th17和Treg细胞分布比例;利用全自动Wes系统毛细电泳Western blotting方法检测小鼠小肠固有层淋巴细胞中Th1细胞转录因子T-bet、Th17细胞转录因子RORγt以及Treg细胞转录因子Foxp3的蛋白表达水平。2.6统计方法采用Graphpad Prism 7软件分析数据,统计数据均以x±S表示,多样本之间采用单因素方差分析,不同时间点数据采用重复测量方差分析,取P<0.05具有统计学意义。3.研究结果3.1双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病OXA模型和TNBS模型的药效作用研究1.模型验证:造模后模型组小鼠饮食饮水减少,蜷缩懒动,腹泻、便血、肛周污秽,体重下降,病变部位可见明显充血水肿甚至糜烂溃疡,组织切片染色后可见病变组织结构异常,伴大量淋巴细胞浸润及大面积组织纤维化,提示小鼠炎症性肠病模型造模成功。2.对于OXA模型,与NC组相比,模型组小鼠体重指数下降明显,DAI评分升高,结肠缩短,重量变轻,结肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润明显增加,天狼星红染色显示组织纤维化面积明显增加;与模型组相比,DHA组以及阳性药组小鼠一般状态均有所改善,饮食饮水增加,腹泻便血程度减轻,死亡数量减少,体重指数上升,DAI评分下降,结肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润程度减轻,天狼星红染色显示组织纤维化面积缩小。3.对于TNBS模型,与NC组相比,模型组小鼠体重指数下降明显,DAI评分升高,小肠重量变轻,小肠组织H&E染色结果显示淋巴细胞浸润明显增加,天狼星红染色结果显示组织纤维化面积明显增加;与模型组相比,DHA组以及阳性药组小鼠一般状态均有所改善,饮食饮水增加,腹泻便血程度减轻,死亡数量减少,体重指数上升,DAI评分下降,小肠组织H&E染色显示淋巴细胞浸润程度减轻,天狼星红染色显示组织纤维化面积缩小。3.2双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响1.对于OXA模型,Real-time PCR结果显示,与NC组相比,模型组小鼠结肠组织PU.1、IL9和IL22的mRNA水平明显升高,AHR均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3的mRNA水平明显降低;与模型组小鼠相比,DHA降低了PU.1、AHR、IL9和IL22的mRNA的表达水平,升高Foxp3和IL10的mRNA表达水平。流式细胞术结果显示,与NC组相比,模型组小鼠脾脏Treg细胞比例明显下降,Th9和Th22细胞比例明显上升;与模型组小鼠相比,DHA升高了小鼠脾脏Treg细胞比例,降低了Th9和Th22细胞比例。毛细电泳Western blotting结果显示,与NC组相比,模型组小鼠结肠固有层淋巴细胞PU.1蛋白表达水平明显升高,AHR均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3表达明显下降;与模型组小鼠相比,DHA剂量明显降低了PU.1和AHR的蛋白表达水平,升高了 Foxp3的表达。2.对于TNBS模型,Real-time PCR结果显示,与NC组相比,模型组小鼠小肠组织ROR γ t的mRNA水平明显升高,T-bet和IFN －均值升高,但不具有统计学差异,Foxp3均值降低,但不具有统计学差异;与模型组小鼠相比,DHA降低了T-bet、RORγt和IFN y的mRNA的表达水平,升高了 Foxp3的表达水平,升高了 IL10平均值,但不具有统计学差异。流式细胞术结果显示,与NC组相比,模型组小鼠脾脏Treg细胞比例明显下降,Th1和Th17细胞比例明显上升;与模型组小鼠相比,DHA升高了小鼠脾脏Treg细胞比例,降低了Th1和Th17细胞比例。毛细电泳Western blotting结果显示,与NC组相比,模型组小鼠小肠肠固有层淋巴细胞T-bet和RORγγt蛋白表达水平明显升高,Foxp3表达明显下降;与模型组小鼠相比,DHA降低了 T-bet和RORγ t蛋白表达水平,升高了 Foxp3水平。3.3基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对激活CD4+T淋巴细胞的影响1.细胞存活率结果显示,DHA(0.1-1.6 mg/ml)对激活CD4+T淋巴细胞具有明显抑制作用,HO-1抑制剂SnPP(30 nM)能够明显降低DHA(0.8mg/ml)的抑制作用。ELISA结果显示,DHA升高了细胞上清中HO-1的蛋白表达,SnPP能够明显抑制HO-1表达,SnPP能够明显减弱DHA对HO-1的升高作用。PI双染法结果显示,DHA能够明显促进激活CD4+T细胞的凋亡,SnPP能够明显减弱DHA的促凋亡作用。2.对于OXA模型,DHA能够明显降低模型小鼠结肠组织中淋巴细胞数量,TUNEL染色结果显示DHA升高了模型小鼠结肠组织中凋亡细胞比例,而SnPP能够明显中和DHA的作用;3.对于TNBS模型,DHA能够明显降低模型小鼠小肠组织中淋巴细胞数量,TUNEL染色结果显示DHA升高了模型小鼠小肠组织中凋亡细胞比例,而SnPP能够明显中和DHA的作用。3.4基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型病情的影响1.对于OXA模型,与DHA组相比,SnPP+DHA能够明显降低模型小鼠的体重指数,升高DAI评分及死亡率,结肠组织H&E染色结果显示SnPP+DHA明显加重了淋巴细胞浸润程度,天狼星红染色结果显示SnPP+DHA组明显增加了结肠组织纤维化面积。2.对于TNBS模型,与DHA组相比,SnPP+DHA能够明显降低模型小鼠的体重指数,升高DAI评分及死亡率,小肠组织H&E染色结果显示SnPP+DHA明显加重了淋巴细胞浸润程度,天狼星红染色结果显示SnPP+DHA组明显增加了小肠组织纤维化面积。3.5基于血红素氧化酶-1的双氢青蒿素对小鼠炎症性肠病模型CD4+T淋巴细胞亚群的影响1.对于OXA模型,流式细胞术结果显示,SnPP+DHA组比DHA组小鼠脾脏中Th9比例更高,Treg比例更低,SnPP+DHA对Th22比例升高了平均值,但不具有统计学差异;毛细电泳Western blotting结果显示,SnPP+DHA能够削弱DHA对结肠固有层淋巴细胞PU.1和AHR蛋白表达的降低作用和对Foxp3的升高作用。2.对于TNBS模型,流式细胞术结果显示,SnPP+DHA组比DHA组小鼠脾脏中Th1、Th17比例更高,Treg比例更低;毛细电泳Western blotting结果显示,SnPP+DHA能够削弱DHA对小肠固有层淋巴细胞T-bet和RORγt蛋白表达的降低作用和对Foxp3的升高作用。4.结论1.DHA对OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病有缓解作用;2.DHA对OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型的CD4+T淋巴细胞亚群有调节作用;3.DHA基于介导HO-1的表达促进激活CD4+T细胞的凋亡;4.DHA基于介导HO-1的表达缓解OXA和TNBS诱导的小鼠炎症性肠病;5.DHA基于介导HO-1的表达调节OXA和TNBS小鼠炎症性肠病模型的CD4+T淋巴细胞亚群平衡。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

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