CRISPR/Cas9敲除技术在重组动物疱疹病毒构建中的初步应用

论文摘要

CRISPR系统是原核生物的一种获得性免疫系统,近年来随着CRISPR/Cas9研究的不断发展,其基因编辑功能逐渐被应用于各个生物学领域。利用CRISPR/Cas9系统对靶标序列的识别,辅助病毒基因的敲除和重组,可提高新毒株的获得效率。疱疹病毒的基因组为线性双链DNA分子,其中伪狂犬病病毒（PRV）和牛疱疹病毒（BHV）的基因组皆能通过sgRNA引导,而被CRISPR/Cas9系统所编辑,可作为其他病毒基因敲除和重组的模式参考。本研究通过构建含敲除目的基因左右同源臂的重组质粒,当目的基因被Cas9蛋白切开后,利用同源重组原理将目的基因替换为eGFP荧光标记蛋白,从而达到基因敲除的目的,并将纯化得到重组的疱疹病毒进行生物学特性分析,建立了高效构建疱疹病毒重组毒株的技术平台。本论文的主要研究结果如下:1.构建PRV TK-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从PRV Bartha-K61株基因组DNA中扩增含TK启动子的TK基因同源臂左臂和TK基因同源臂右臂,与eGFP基因序列一起,顺序克隆至克隆载体pUC19中,构建重组载体pUC19-TKLR-eGFP;同时,设计针对TK基因的sgRNA,构建pX335-sgRNA-TK载体,测序验证后,与PRV Bartha-K61株基因组DNA共同转染BHK-21细胞。出现重组病毒的绿色荧光病变后,利用蚀斑纯化技术,获得PRV Bartha-K61 TK-/eGFP+重组毒株。通过TCID50检测病毒滴度,绘制重组毒株的生长曲线,证明其生长特性无差异性改变。通过小鼠攻毒实验,对比小鼠体重变化和死亡情况,发现TK基因敲除后,病毒致病性降低。2.构建BHV-1 gIgE-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从BHV-1 Bartha株基因组DNA中扩增gI和gE两个基因的左右同源臂,将CMV启动子的eGFP基因表达盒插入同源臂中,之后利用同源重组酶将线性化的pUC19载体与之连接成环,构建重组载体pUC19-gIgELR-eGFP;设计针对gI和gE基因的sgRNA,构建plenti-sgRNA-gIgE载体。将以上质粒转染293T细胞,同时接种BHV-1 Bartha Nu/67病毒,利用293T细胞作为媒介,使BHV株发生基因重组,之后将293T细胞转接MDBK细胞,使重组毒增殖并保持感染性。待出现绿色荧光的病变后,蚀斑纯化得到BHV gIgE-/eGFP+重组毒株。测定重组毒株的生长曲线,证明其生长特性无差异性改变。将重组毒接种小鼠后,用阻断ELISA测定小鼠血清抗体水平,gB抗体呈阳性表明重组毒株保持免疫原性,gE抗体呈阴性表明gE基因被敲除。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词表

文献综述

第一章 CRISPR/Cas9 技术与疱疹病毒基因敲除的研究进展

1.1 CRISPR概述

1.1.1 CRISPR/Cas9 研究历史

1.1.2 CRISPR/Cas9 系统核心结构

1.1.3 CRISPR/Cas9 技术的应用

1.2 伪狂犬病毒及其重组研究

1.2.1 PRV的国内流行现状

1.2.2 PRV基因组特征

1.2.3 PRV疫苗及重组研究

1.3 牛疱疹病毒I型及其重组研究

1.3.1 BHV的国内流行现状

1.3.2 BHV基因组特征

1.3.3 BHV疫苗及重组研究

1.4 研究目的和意义

试验研究

第二章 CRISPR/Cas9 技术在PRV基因敲除中的应用

2.1 材料

2.1.1 毒种、细胞系和实验动物

2.1.2 菌种和质粒

2.1.3 试剂

2.1.4 培养基及缓冲液配制

2.2 方法

2.2.1 细胞培养及病毒扩增

2.2.2 病毒基因组DNA提取

2.2.3 重组载体构建

2.2.4 sgRNA载体构建

2.2.5 细胞转染

2.2.6 病毒重组

2.2.7 病毒蚀斑纯化

2.2.8 重组病毒纯度测定

2.2.9 重组病毒滴度测定

2.2.10 重组病毒生长曲线测定

2.2.11 重组病毒致病性测定

2.3 结果

2.3.1 重组载体构建

2.3.2 sgRNA载体构建

2.3.3 病毒基因组致病性

2.3.4 TK启动子活性验证

2.3.5 病毒重组

2.3.6 病毒纯化

2.3.7 重组病毒纯度检测

2.3.8 重组病毒生长特性

2.3.9 重组病毒致病性

2.4 讨论

第三章 CRISPR/Cas9 技术在BHV基因敲除中的应用

3.1 材料

3.1.1 毒种、细胞系和实验动物

3.1.2 菌种和质粒

3.1.3 试剂

3.1.4 培养基及缓冲液配制

3.2 方法

3.2.1 细胞培养及病毒扩增

3.2.2 病毒基因组DNA提取

3.2.3 重组载体构建

3.2.4 sgRNA载体构建

3.2.5 病毒重组

3.2.6 病毒蚀斑纯化

3.2.7 重组病毒验证

3.2.8 重组病毒滴度测定

3.2.9 重组病毒生长曲线测定

3.2.10 动物抗体检测

3.3 结果

3.3.1 重组载体构建

3.3.2 sgRNA载体构建

3.3.3 病毒重组

3.3.4 病毒纯化

3.3.5 重组病毒纯度检测

3.3.6 重组病毒生长特性

3.3.7 动物抗体检测

3.4 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 于婉琪

导师: 萧飒,陈鸿军

关键词: 动物疱疹病毒,伪狂犬病病毒,牛疱疹病毒,基因敲除

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家重点研发计划-非洲猪瘟等外来动物疫病防控科技应急项目(编号:2018YFC0840400),烈性外来动物疫病防控技术研发项目(编号:2017YFD0502300)

分类号: S852.65

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CRISPR/Cas9敲除技术在重组动物疱疹病毒构建中的初步应用

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