带GFP标签的SQSTM1真核表达载体的构建及功能验证

论文摘要

目的构建带绿色荧光蛋白报告载体（pEGFP-C1）的死骨片1（SQSTM1/P62）真核表达载体,在获得pEGFPSQSTM1融合表达蛋白后,对其功能进行验证。方法以人乳腺文库为模板,通过聚合酶链反应（PCR）扩增人SQSTM1基因编码序列,插入到pEGFP-C1载体中,把测序正确的重组质粒转染人胚肾293T细胞,蛋白质印迹法（Western blotting）检测该融合蛋白表达情况;分别转染pEGFP-C1空载体、pEGFP-SQSTM1至乳腺癌细胞ZR75-1,荧光显微镜观察SQSTM1蛋白在细胞中的定位情况;荧光漂白后恢复实验（FRAP）验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体荧光漂白后恢复情况。结果重组质粒pEGFP-SQSTM1的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;荧光显微镜观察SQSTM1的表达,结果显示,表达产物主要以点状小体形式定位于乳腺癌ZR75-1细胞的胞质中;FRAP实验验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体激光漂白后绿色荧光可恢复。结论成功构建pEGFPSQSTM1真核表达载体,证实了SQSTM1蛋白在人乳腺癌细胞ZR75-1中表达,表达蛋白以点状小体形式定位于细胞质中,为进一步研究SQSTM1小体的功能提供基础。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 朱祥,陈玉,马路园,张德宇,刘娟,于世炎,聂秀红,徐小洁

关键词: 乳腺肿瘤,小体,绿色荧光蛋白质类,聚合酶链反应

来源: 军事医学 2019年06期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所细胞工程研究室,解放军252医院,首都医科大学宣武医院呼吸科

基金: 国家自然科学基金面上项目（81672602）,国家自然科学基金优秀青年基金项目（81822037）,全军后勤科研计划重点项目（BWS16J010）

分类号: R737.9;Q78

页码: 411-414

总页数: 4

文件大小: 1402K

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