鸡基质蛋白3在新城疫病毒复制中的作用研究

论文摘要

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种有囊膜,含有单股负链、不分节段基因组的RNA病毒,其基因组结构为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,至少编码六种结构蛋白。基质蛋白（matrix protein,M）是NDV M基因编码的一种分子量为40 kD,位于病毒囊膜内侧且高度碱性的疏水性蛋白。与大多数副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白也是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白,即在病毒感染早期M蛋白通过自身携带的核定位信号（nuclear localization signal,NLS）与importinβ1相互作用并且以RanGTP依赖的方式进入细胞核,而在感染后期M蛋白则通过三个核输出信号以CRM1非依赖的方式进入细胞质。细胞基质蛋白3（matrin 3,MATR3）是最早报道的12种主要核基质蛋白之一,主要定位在细胞核,在不同的细胞类型中广泛表达且高度保守。MATR3蛋白与转录调节、mRNA前体剪接和稳定性、DNA损伤修复和细胞增殖等功能密切相关,并且还参与调控病毒RNA的核输出、病毒基因组的稳定性和表达。本课题组前期利用酵母双杂交系统从鸡胚成纤维细胞cDNA文库中筛选到NDV M蛋白和鸡MATR3蛋白存在相互作用,但是这种互作在NDV复制中的作用尚不清楚。本研究首先对鸡MATR3基因进行克隆和生物信息学分析,鉴定介导MATR3蛋白细胞核定位的核定位信号,然后构建M基因和MATR3基因真核表达载体,通过荧光共定位和免疫共沉淀技术验证M蛋白和MATR3蛋白之间的相互作用,最后利用RNA干扰技术干扰BSR-T7/5细胞中MATR3蛋白的表达,研究其对NDV复制的影响。1.鸡MATR3基因的克隆和生物信息学分析参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列（序列号:NM204147）,设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增出鸡MATR3基因,并进行克隆和测序。利用生物信息学软件对其编码的蛋白质进行理化性质、二级结构和三级结构分析,预测其功能结构域,并绘制遗传进化树。结果表明,鸡MATR3基因ORF序列全长为2 709 bp,共编码902个氨基酸,理论pI为5.79,分子质量约为100.71 kDa,分子式可表示为C4362H6903N1267O1418S29;二级结构预测可知鸡MATR3蛋白含有丰富的二级结构,以无规则卷曲（47.67%）和α-螺旋（33.81%）为主;功能结构域预测显示该蛋白有2个锌指结构域和2个RNA识别基序。核苷酸同源性及遗传进化分析表明鸡与火鸡亲缘关系最近。2.鸡MATR3蛋白核定位信号的预测与鉴定运用在线软件对鸡MATR3蛋白NLS进行预测;参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列,设计合成Overlap PCR引物,构建表达不同鸡MATR3蛋白缺失体的重组真核表达载体,转染细胞后通过观察亚细胞定位来确定鸡MATR3蛋白NLS结构域;进一步根据NLS邻近碱性氨基酸序列特征,构建NLS邻近氨基酸缺失的重组真核表达载体,观察NLS邻近碱性氨基酸是否也参与鸡MATR3蛋白的细胞核定位。结果表明,鸡MATR3蛋白存在4个假定NLS（putative NLS,pNLS）,只有pNLS2(596PSDKKSK602)缺失时才导致鸡MATR3蛋白丧失核定位特征。并且,鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸不参与NLS介导的MATR3蛋白细胞核定位。此外,我们还发现该NLS基序在不同物种的MATR3蛋白中均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。3.鸡MATR3蛋白与NDV M蛋白相互作用的验证参照GenBank中登录的鸡MATR3基因序列和NDV SS1株M基因序列,分别设计合成特异性引物构建重组真核表达载体pDsRed-MATR3、pCMV-Myc-MATR3和pEGFP-M,将pDsRed-MATR3和pEGFP-M共转染细胞,观察鸡MATR3蛋白和M蛋白共定位情况;将pCMV-Myc-MATR3和pEGFP-M共转染细胞,利用免疫共沉淀方法鉴定鸡MATR3蛋白与M蛋白的相互作用。结果表明,EGFP-M和DsRed-MATR3融合蛋白均分布在细胞核,在细胞核中有明显的共定位;免疫共沉淀结果显示EGFP-M可与Myc-MATR3发生共沉淀,反之Myc-MATR3也可与EGFP-M发生共沉淀。以上结果表明,鸡MATR3蛋白和NDV M蛋白在细胞核中发生相互作用。4.干扰细胞中MATR3蛋白的表达对NDV复制的影响将MATR3 siRNA转染BSR-T7/5细胞,验证siRNA对细胞中MATR3蛋白表达的影响,然后在siRNA转染细胞后36 h感染1 MOI的NDV,观察不同时间点的细胞病变情况并测定细胞上清的病毒滴度,同时用荧光定量PCR方法检测病毒感染细胞24 h后细胞沉淀和细胞上清中NDV M基因mRNA的表达水平。结果表明,病毒感染细胞24 h后出现明显的细胞病变,病毒滴度在36 h达到最大值;MATR3 siRNA组细胞病变和病毒滴度均低于Control siRNA组和Normal组。同时,MATR3 siRNA组NDV M基因表达水平低于Control siRNA组和Normal组。以上结果表明,干扰细胞中MATR3蛋白的表达抑制了病毒的复制。

论文目录

中文摘要

Summary

英文缩略表

文献综述细胞基质蛋白3的功能及其参与病毒复制的分子机制

1 MATR3 蛋白的结构特征

2 MATR3 蛋白在细胞核中的功能

3 MATR3 蛋白参与病毒复制的作用机制

3.1 MATR3 蛋白参与病毒RNA的核输出

3.2 MATR3 蛋白调节病毒基因组稳定性和基因表达

3.3 MATR3 蛋白参与其它病毒复制的研究

4 小结

5 展望

试验研究

第一章鸡MATR3 基因的克隆和生物信息学分析

1 材料

1.1 细胞和菌株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 鸡MATR3 基因的克隆与鉴定

2.1.1 引物设计

2.1.2 细胞总RNA的提取

2.1.3 RT-PCR

2.1.4 PCR产物的纯化

2.1.5 连接

2.1.6 转化

2.1.7 重组质粒的鉴定

2.2 鸡MATR3 基因的序列分析

3 结果与分析

3.1 鸡MATR3 基因的克隆与测序

3.2 鸡MATR3 蛋白的生物信息学分析

3.2.1 鸡MATR3 蛋白理化性质分析

3.2.2 鸡MATR3 蛋白二级结构分析

3.2.3 鸡MATR3 蛋白三级结构预测

3.2.4 鸡MATR3 蛋白功能结构域保守性分析

3.2.5 鸡MATR3 基因核苷酸同源性分析

3.2.6 鸡MATR3 基因的遗传进化树分析

4 讨论

第二章鸡MATR3 蛋白核定位信号的预测与鉴定

1 材料

1.1 细胞、菌株和质粒

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 鸡MATR3 蛋白NLS的预测

2.2 鸡MATR3 蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体的构建

2.2.1 引物的设计

2.2.2 PCR分段扩增与纯化

2.2.3 Overlap PCR扩增与纯化

2.2.4 连接

2.2.5 转化

2.2.6 重组质粒的鉴定

2.3 鸡MATR3 蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失的重组真核表达载体构建

2.3.1 引物的设计

2.3.2 DNA寡核苷酸退火

2.3.3 连接

2.3.4 转化

2.3.5 重组质粒的鉴定

2.4 质粒小提

2.5 细胞培养及转染

2.5.1 细胞复苏

2.5.2 转染

2.6 重组蛋白的荧光观察

3 结果

3.1 鸡MATR3 蛋白pNLS的预测

3.2 鸡MATR3 蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体的构建

3.3 鸡MATR3 蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失的重组真核表达载体构建

3.4 鸡MATR3 蛋白pNLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位

3.5 鸡MATR3 蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失体重组蛋白的亚细胞定位

3.6 MATR3 蛋白NLS的保守性分析及其核输入能力检测

4 讨论

第三章鸡MATR3 蛋白与NDV M蛋白相互作用的验证

1 材料

1.1 菌株、质粒和细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 NDV M基因重组真核表达载体pEGFP-M的构建

2.1.1 引物设计

2.1.2 NDV M基因扩增与纯化

2.1.3 NDV M基因与载体pEGFP-C1 连接和转化

2.1.4 重组质粒的鉴定

2.2 鸡MATR3 基因重组真核表达载体pCMV-Myc-MATR3 的构建

2.2.1 引物设计

2.2.2 鸡MATR3 基因扩增与纯化

2.2.3 MATR3 基因与载体pCMV-Myc连接和转化

2.2.4 重组质粒的鉴定

2.3 荧光共定位实验

2.4 免疫共沉淀实验

2.4.1 样品制备

2.4.2 免疫共沉淀

2.4.3 Western Blotting

3 结果

3.1 NDV M基因重组真核表达载体pEGFP-M的构建

3.2 MATR3 基因重组真核表达载体pCMV-Myc-MATR3 的构建

3.3 M蛋白和MATR3 蛋白共定位分析

3.4 M蛋白和MATR3 蛋白在细胞中的相互作用

4 讨论

第四章干扰细胞中MATR3 蛋白的表达对NDV复制的影响

1 材料

1.1 毒株和细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 表达GFP的重组NDV r SS1GFP病毒滴度的测定

2.2 MATR3 siRNA干扰效果的检测

2.3 不同时间点病毒滴度的测定

2.4 干扰MATR3 蛋白的表达对NDV复制的影响

2.4.1 引物合成

2.4.2 RNA干扰

2.4.3 RNA提取

2.4.4 反转录

2.4.5 荧光定量PCR

2.5 数据统计分析

3 结果

3.1 NDV的病毒滴度测定

3.2 MATR3 siRNA对细胞MATR3 蛋白表达的影响

3.3 干扰MATR3 蛋白的表达对NDV复制和致病性的影响

3.4 干扰MATR3 蛋白的表达对NDV M基因表达的影响

4 讨论

全文总结

参考文献

附录一攻读研究生期间参与发表文章

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邓珊珊

导师: 嵇辛勤

关键词: 新城疫病毒,蛋白,荧光共定位,免疫共沉淀,干扰

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

基金: 国家自然科学基金(青年基金)项目:新城疫病毒M蛋白细胞核定位的分子机制及功能研究(编号:31502074),国家自然科学基金(地区基金)项目:新城疫病毒M蛋白核定位信号突变影响病毒复制增殖的作用机制(编号:31760732)

分类号: S852.65

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