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乳酸杆菌表面蛋白GAPDH粘附粘液素介导肠道定植的研究

2020-12-09阅读(566)

乳酸杆菌表面蛋白GAPDH粘附粘液素介导肠道定植的研究

论文摘要

乳酸杆菌作为一种益生菌在动物肠道中发挥重要的益生效应。其粘附特性是益生菌在肠道内成功定植发挥益生性的基础,并且成为筛选高效益生菌的重要标准之一。乳酸杆菌表面蛋白三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）在细胞表面发挥粘附肠道表层粘液素的作用。但是GAPDH由胞浆分泌到细胞表面的跨膜分泌规律和菌体表面的分布特征尚不明确,阐明GAPDH发挥对猪肠道粘液素的粘附作用,对于筛选和培育高效乳酸菌有重要意义。本试验旨在以具有高粘附性的乳酸杆菌ZJ617和低粘附性乳酸杆菌ZJ615为代表,研究表面蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）在乳酸杆菌不同生长期的分泌特性及其粘附粘液素参与肠道粘附作用。低黏附ZJ615和高黏附ZJ617罗伊氏乳酸杆菌培养不同时间（3、6、9、12、15、18 h）,以氯化锂提取表面蛋白,免疫印迹（Western–blotting）定量表面蛋白GAPDH含量;二乙酸荧光素（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法结合流式细胞仪检测细胞膜通透性;利用免疫电镜定位不同生长时期乳酸杆菌表面蛋白GAPDH;两种菌培养至18h（平台期）与载玻片固定猪肠道粘液素共同孵育1h,分析抗体封闭表面蛋白GAPDH、高碘酸氧化粘液素或抗体封闭加氧化双重处理后,革兰氏染色分析乳酸杆菌粘附数量;分子互作仪ForteBio分析不同处理条件下乳酸杆菌与粘液素的动力学结合特征。研究结果表明:1)乳酸杆菌表面蛋白GAPDH含量在6h（对数生长期）最高（P<0.05）,进入生长后期（12h、15h、18h）后含量显著下降（P<0.05）;高黏附乳酸杆菌ZJ617不同培养时间的GAPDH蛋白含量均高于ZJ615（P<0.05）。2)乳酸杆菌培养至对数生长期（6h）细胞膜通透性最高（P<0.05）,生长后期（12h、15h、18h）通透性降低（P<0.05）;高粘附乳酸杆菌ZJ617不同时间细胞膜通透性均高于ZJ615（P<0.05）。ZJ617和ZJ615不同培养时间表面蛋白GAPDH分泌量和细胞膜通透性相关性分别为0.8和0.6。3)与载玻片固定有粘液素时,乳酸杆菌的粘附数量相比,无粘液素固定、抗体封闭GAPDH、高碘酸氧化粘液素后乳酸杆菌粘附数量显著降低（P<0.05）;抗体封闭和高碘酸氧化双重处理,乳酸杆菌粘附数量进一步显著降低（P<0.05）;上述各处理下,高粘附乳酸杆菌ZJ617粘附数量显著高于低黏附ZJ615（P<0.05）。动力学相互作用结果显示,与对照组相比,各处理组:高碘酸氧化、去蛋白、加热和抗体封闭之后,各组反应值均减弱。由此可见,对数生长期乳酸杆菌表面蛋白GAPDH含量最高,其分泌与细胞膜通透性成正相关;高黏附乳酸杆菌具有表面蛋白GAPDH,通过粘附肠道粘液素在乳酸杆菌肠道定植中发挥作用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 文献综述
  •   1.1 乳酸杆菌肠道定植
  •     1.1.1 乳酸杆菌细胞壁的结构与功能
  •     1.1.2 乳酸杆菌参与肠道粘附成分
  •     1.1.3 粘附受体的研究
  •   1.2 细胞膜通透性对乳酸杆菌的影响
  •     1.2.1 细胞膜通透性
  •     1.2.2 细胞膜通透性的检测方法
  •   1.3 乳酸菌细胞膜通透性的影响因素
  •     1.3.1 压力
  •     1.3.2 冷冻干燥
  •   1.4 细胞膜通透性的生物学意义
  •     1.4.1 细菌繁殖
  •     1.4.2 物质转运
  •     1.4.3 冷冻保存
  •   1.5 GAPDH参与细胞粘附
  •     1.5.1 GAPDH的作用
  •     1.5.2 GAPDH的分泌与结合机制
  •     1.5.3 GAPDH与肠道粘液素的相互作用
  •   1.6 蛋白质组学分析方法
  •     1.6.1 2-DE双向凝胶电泳
  •     1.6.2 2D-DIGE双向差异凝胶电泳
  •     1.6.3 Label-free非标定量蛋白组学
  •   1.7 研究的目的与意义
  •     1.7.1 研究目的与意义
  •     1.7.2 研究内容
  • 2 不同培养时间乳酸杆菌表面蛋白GAPDH的分泌与细胞膜通透性的关系
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 菌株的培养
  •     2.1.2 仪器与试剂
  •     2.1.3 乳酸杆菌不同时间菌数的测定
  •     2.1.4 乳酸杆菌表面蛋白的提取
  •     2.1.5 免疫印迹Western blot
  •     2.1.6 流式细胞仪的检测
  •     2.1.7 免疫电镜定位GAPDH
  •   2.2 试验结果
  •     2.2.1 乳酸杆菌不同培养时间GAPDH蛋白的差异
  •     2.2.2 乳酸杆菌不同培养时间细胞膜通透性差异
  •     2.2.3 免疫电镜定位乳酸杆菌不同培养时间GAPDH分布
  •   2.3 讨论
  •   2.4 小结
  • 3 乳酸杆菌表面蛋白GAPDH和粘液素的相互作用
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 菌株的培养
  •     3.1.2 仪器与试剂
  •     3.1.3 猪肠道粘液素的提取
  •     3.1.4 粘附试验
  •     3.1.5 Forte Bio分子互作仪的测定
  •   3.2 试验结果
  •     3.2.1 乳酸杆菌与粘液素的粘附情况
  •     3.2.2 Forte Bio分子互作仪的测定结果
  •   3.3 讨论
  •   3.4 小结
  • 4 乳酸杆菌ZJ615和ZJ617蛋白质组学差异分析
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 菌株的培养
  •     4.1.2 仪器与试剂
  •     4.1.3 乳酸杆菌表面蛋白的提取
  •     4.1.4 表面蛋白的浓缩
  •     4.1.5 SDS-PAGE电泳检测
  •     4.1.6 蛋白Trypsin酶解
  •     4.1.7 Lable-free蛋白组学定量分析
  •   4.2 试验结果
  •     4.2.1 乳酸杆菌ZJ617与ZJ615差异蛋白筛选
  •     4.2.2 乳酸杆菌ZJ615与ZJ617差异蛋白组学GO分析
  •   4.3 讨论
  •   4.4 小结
  • 5 试验总结、创新点与展望
  •   5.1 试验总结
  •   5.2 创新点
  •   5.3 研究展望
  • 参考文献
  • 缩略词表
  • 作者简介
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 戴甜

    导师: 汪海峰

    关键词: 乳酸杆菌,表面蛋白,肠道粘液素,粘附

    来源: 浙江农林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 浙江农林大学

    基金: 国家自然科学基金项目

    分类号: S852.6

    总页数: 56

    文件大小: 2707K

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