猪瘟病毒反向遗传操作系统的建立

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业的重大传染病之一。自发现以来已流行于世界上多个国家,我国更是深受CSFV侵害的国家之一。目前在中国流行的CSFV毒株与之前的流行株相比,在遗传变异、毒力和致病性等方面都已发生了较大改变,这也使得我国对CSFV的防治面临更严峻的挑战。为了更好的预防与控制CSF,针对CSFV的致病机制,毒力的决定因素等问题仍需进行更深入的探究。随着实验研究的深入和相关学科的发展,反向遗传学技术已经成为研究RNA病毒的重要手段,在CSFV的研究中也发挥着越来越重要的作用。通过构建高效经济的CSFV反向遗传操作系统可以从基因水平上对CSFV有更深入的研究,也可以为CSFV的传统研究提供更多的思路。本研究基于DNA-Launched反向遗传技术,采用RNA聚合酶Ⅱ系统,分别构建了含有CSFV兔化弱毒疫苗株及强毒石门株全长基因组序列的感染性克隆。通过在CSFV基因组的5’端引入巨细胞病毒（CMV）启动子,3’端引入丁型肝炎病毒（HDV）核酶以及牛生长激素（BGH）信号序列等必要的工程核酶原件,然后将病毒基因组分段克隆进低拷贝的细菌人工染色体（BAC）载体中,可以使CSFV基因组在宿主细胞内正确复制翻译并且提高病毒的拯救效率。区别于传统的体外转录或构建细胞系的方法,本研究构建的感染性克隆转染PK-15细胞后,在细胞内完成转录,可快速、有效的直接收获拯救病毒。成功收获两种毒株的拯救病毒之后,分别对其进行遗传标记的鉴定与生物学特性的验证试验。试验结果说明拯救的病毒与其亲本毒株具有相似的生物学特性,引入的遗传标记经过验证可以对其进行有效的区分,同时拯救获得的病毒在体外细胞上也有着良好的增殖能力,可以用于CSFV后续的反向遗传学研究。在此基础上,通过反向遗传技术将外源基因EGFP引入CSFV兔化弱毒疫苗株的感染性克隆,成功构建了含有EGFP基因的重组CSFV兔化弱毒疫苗株全长cDNA克隆,并尝试进行重组病毒的拯救,以期获得能够稳定传代并表达EGFP荧光标记的重组CSFV兔化弱毒疫苗株,使CSFV的检测实现可视化。荧光显微镜观察结果显示,P1、P2代可见微弱绿色荧光,但在其后的传代中,荧光逐渐消失,推测由于蛋白构象发生了改变,影响了基因的正常功能,导致EGFP无法在CSFV基因组中稳定表达并传代。综上,本研究通过反向遗传操作技术,成功构建了我国CSFV兔化弱毒疫苗株和强毒石门株的感染性克隆,并能够快速、有效的收获拯救病毒。在此基础上,构建了含有EGFP基因的重组CSFV兔化弱毒疫苗株全长cDNA克隆。为下一步对CSFV致病机制的探究以及猪瘟标记疫苗的研究打下了基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

主要符号对照表

文献综述

第一章猪瘟病毒及其反向遗传系统的研究进展

1.1 猪瘟病毒概述

1.1.1 猪瘟病毒的分类学与形态学

1.1.2 猪瘟的流行与分布

1.1.3 猪瘟的临床症状和病理变化

1.1.4 猪瘟的诊断方法

1.1.5 猪瘟的防控措施及展望

1.2 反向遗传系统在猪瘟病毒研究中的应用

1.2.1 RNA病毒反向遗传学概述

1.2.2 猪瘟病毒反向遗传系统的背景与操作

1.2.3 猪瘟病毒反向遗传系统的应用及展望

试验研究

第二章猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株反向遗传操作系统的建立及其初步应用

2.1 材料和方法

2.1.1 细胞、病毒与质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 构建CSFV C株感染性克隆的主要引物

2.1.5 CSFV C株感染性克隆的构建策略

2.1.6 感染性克隆的转染及病毒拯救

2.1.7 拯救病毒的初步RT-PCR鉴定

2.1.8 拯救病毒分子标签的鉴定

2.1.9 拯救病毒的序列分析

2.1.10 间接免疫荧光（IFA）鉴定

2.1.11 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测

2.1.12 Western blot鉴定

2.1.13 病毒生长曲线的建立

2.1.14 表达EGFP的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建

2.2 结果

2.2.1 CSFV C株感染性克隆的构建

2.2.2 CSFV C株拯救病毒的初步鉴定

2.2.3 CSFV C株拯救病毒的序列分析

2.2.4 CSFV C株拯救病毒生物学特性的验证

2.2.5 CSFV C株拯救病毒一步生长曲线的建立

2.2.6 含有EGFP基因的CSFV C株感染性克隆质粒的构建

2.3 讨论

2.4 小结

第三章猪瘟病毒石门株反向遗传操作系统的建立

3.1 材料和方法

3.1.1 细胞、病毒与质粒

3.1.2 主要试剂与仪器设备

3.1.3 构建CSFV石门株感染性克隆的主要引物

3.1.4 CSFV石门株感染性克隆的构建策略

3.1.5 感染性克隆的转染及病毒拯救

3.1.6 拯救病毒的初步RT-PCR鉴定与分子标签的鉴定

3.1.7 拯救病毒的序列分析

3.1.8 拯救病毒的生物学特性分析

3.1.9 病毒生长曲线的建立

3.2 结果

3.2.1 CSFV石门株感染性克隆的构建

3.2.2 CSFV石门株拯救病毒的初步鉴定

3.2.3 CSFV石门株拯救病毒的序列分析

3.2.4 CSFV石门株拯救病毒生物学特性的验证

3.2.5 CSFV石门株拯救病毒一步生长曲线的建立

3.3 讨论

3.4 小结

结论

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高辉

导师: 王承宝

关键词: 猪瘟病毒,反向遗传

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 博士后特别资助基金(编号:2018T111113),博士后一等资助基金(编号:2017M610659)

分类号: S852.651

总页数: 69

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