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树突状细胞中TSC1/mTOR信号通路调控CD8阳性T细胞稳态的研究

2020-12-02阅读(683)

树突状细胞中TSC1/mTOR信号通路调控CD8阳性T细胞稳态的研究

论文摘要

树突状细胞属于天然免疫细胞,是连接天然免疫和适应性免疫的重要桥梁,参与调节T细胞的稳态以及激活。越来越多的证据表明树突状细胞的稳态以及功能受到包括代谢在内的诸多信号通路的调控,但是特定的代谢通路如何具体调控树突状细胞的功能还不是很清楚。mTOR参与形成mTORC1和mTORC2两种复合体,mTOR信号通路在调节机体的生长和代谢的过程中起着至关重要的作用,其调节机理非常复杂。mTOR信号通路可以整合胞外和胞内的各种信号,包括营养状况、生长因子等,从而调节一系列的细胞代谢反应,包括但不限于蛋白质合成、脂类合成、核酸合成以及自噬。为了研究mTOR信号通路调控的代谢反应如何影响树突状细胞的功能,我们构建了树突状细胞Tsc1特异性敲除的小鼠(CD11c-cre-Tsc1-floxed,Tsc1DC-/-)从而在树突状细胞中组成性激活mTORC1信号通路。我们发现,Tsc1敲除基本不影响树突状细胞的发育和稳态,但是却导致CD8阳性T细胞的稳态严重受损,Tsc1DC-/-小鼠的CD8阳性T细胞的增殖不受影响,然而其凋亡却显著增加。我们还构建了树突状细胞Tsc1和mTor(CD11c-cre-Tsc1/mTor-floxed,Tsc1/mTorDC-/-)以及Tsc1和Rptor(CD11c-cre-Tsc1/Rptor-floxed,Tsc1/RptorDC-/-)双敲除的小鼠,发现mTor或者Rptor的敲除能够完全回复Tsc1DC-/-小鼠中CD8阳性T细胞的缺陷,证明树突状细胞中mTORC1信号通路对于CD8阳性T细胞的稳态维持非常重要。此外,我们还利用李斯特菌以及B16黑色素瘤构建了小鼠体内感染以及肿瘤模型,发现Tsc1DC-/-小鼠不能产生有效的抗原特异性CD8阳性T细胞反应,而这一缺陷同样可被Tsc1/mTorDC-/-小鼠所回复。机制方面,我们发现Tsc1敲除的树突状细胞中MHC-I和IL-7表达量减少,体外共培养实验表明树突状细胞中MHC-I的回补可以极大地促进Tsc1敲除的树突状细胞介导的OT-I CD8阳性初始T细胞的增殖,体内实验表明补充外源IL-7可以有效促进Tsc1DC-/-小鼠脾脏中CD8阳性T细胞数量的增多。此外,我们发现TSC1-mTOR信号通路调控乙酰辅酶A参与到脂肪酸合成和组蛋白乙酰化这两者之间的平衡。Tsc1敲除的树突状细胞ACC1（acetyl-CoA carboxylase 1）表达量升高并且脂肪酸合成增加,导致乙酰辅酶A含量减少,进而导致MHC-I以及IL-7基因启动子区域组蛋白乙酰化修饰H3K27ac和H3K9ac降低,从而使得MHC-I和IL-7表达量下降。最后,ACC1的抑制剂或者shRNA介导的ACC1的敲低均能有效地促进MHC-I以及IL-7基因启动子区域的H3K27ac和H3K9ac修饰水平增加,并使得MHC-I和IL-7表达量以及树突状细胞介导OT-I CD8阳性初始T细胞增殖的能力显著升高。综上所述,我们发现树突状细胞中TSC1-mTOR信号通路可在稳态情况下调控乙酰辅酶A的代谢从而进一步调控CD8阳性T细胞的稳态,并且将代谢和表观遗传联系起来,为树突状细胞的研究提供了新思路。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 mTOR的发现,结构,信号通路及其生理功能
  •     1.1.1 mTOR的发现
  •     1.1.2 mTOR的结构
  •     1.1.3 mTOR信号通路
  •     1.1.4 mTOR信号通路在免疫系统中的作用
  •     1.1.5 mTOR信号通路的其他生理功能
  •   1.2 树突状细胞的发育、稳态以及功能
  •     1.2.1 树突状细胞的发育和稳态
  •     1.2.2 树突状细胞的功能
  •   1.3 T细胞的发育以及稳态
  •   1.4 代谢——表观遗传通路
  • 第二章 实验材料和实验方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验小鼠
  •     2.1.2 实验细胞
  •     2.1.3 抗体
  •     2.1.4 化学试剂
  •     2.1.5 试剂盒
  •     2.1.6 实验耗材
  •     2.1.7 实验仪器
  •     2.1.8 常用试剂的配制
  •     2.1.9 Real-time PCR引物列表
  •     2.1.10 ChIP-qPCR引物列表
  •     2.1.11 shRNA序列
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养
  •     2.2.2 小鼠脾脏树突状细胞的分离
  •     2.2.3 慢病毒包装以及感染
  •     2.2.4 总RNA的抽提
  •     2.2.5 RNA反转录以及real-time PCR
  •     2.2.6 Western blotting
  •     2.2.7 细胞胞质胞核分离
  •     2.2.8 使用Percoll分离小鼠组织中免疫细胞
  •     2.2.9 流式细胞术
  •     2.2.10 双抗体夹心法ELISA
  •     2.2.11 李斯特菌（L.m.-OVA）感染
  •     2.2.12 肿瘤模型
  •     2.2.13 抗原递呈实验
  •     2.2.14 细胞代谢分析
  •     2.2.15 ChIP-qPCR
  •     2.2.16 RNA-seq分析
  • 第三章 研究结果
  •   3.1 树突状细胞中的TSC1 对于CD8 阳性T细胞的发育以及稳态维持至关重要
  •     3.1.1 树突状细胞Tsc1 敲除效率的鉴定
  •     3.1.2 Tsc1 敲除基本不影响树突状细胞的发育及稳态
  • DC-/-小鼠CD8 阳性T细胞的发育以及稳态维持存在严重缺陷'>    3.1.3 Tsc1DC-/-小鼠CD8 阳性T细胞的发育以及稳态维持存在严重缺陷
  •   3.2 树突状细胞中TSC1 调控的mTORC1 的激活对于CD8 阳性T细胞的稳态至关重要
  • DC-/-以及Tsc1/RptorDC-/-双敲除小鼠可以完全回复Tsc1DC-/-小鼠次级淋巴器官中CD8 阳性T细胞的缺陷'>    3.2.1 Tsc1/m TorDC-/-以及Tsc1/RptorDC-/-双敲除小鼠可以完全回复Tsc1DC-/-小鼠次级淋巴器官中CD8 阳性T细胞的缺陷
  • DC-/-小鼠脾脏T细胞凋亡显著增加但增殖没有明显差异'>    3.2.2 Tsc1DC-/-小鼠脾脏T细胞凋亡显著增加但增殖没有明显差异
  • DC-/-小鼠CD8 阳性T细胞稳态维持的缺陷是由Tsc1 敲除的树突状细胞的缺陷导致的'>    3.2.3 Tsc1DC-/-小鼠CD8 阳性T细胞稳态维持的缺陷是由Tsc1 敲除的树突状细胞的缺陷导致的
  •     3.2.4 Tsc1M/N-/-小鼠不影响CD8 阳性T细胞的发育和稳态
  •   3.3 树突状细胞中的TSC1 对于CD8 阳性T细胞的激活至关重要
  •     3.3.1 树突状细胞中的TSC1-mTOR信号通路对于L.m.-OVA诱导的CD8阳性T细胞的激活非常重要
  •     3.3.2 树突状细胞中的TSC1-mTOR信号通路对于CD8 阳性T细胞介导的抗肿瘤免疫反应非常重要
  •     3.3.3 Tsc1 敲除的树突状细胞本身的激活没有非常明显的缺陷
  • DC-/-小鼠T细胞趋化因子受体的表达量没有明显缺陷'>    3.3.4 Tsc1DC-/-小鼠T细胞趋化因子受体的表达量没有明显缺陷
  •   3.4 TSC1 调控的转录组参与调控树突状细胞代谢以及和T细胞相互作用
  •     3.4.1 TSC1 调控参与糖酵解以及脂肪酸合成的一系列基因的表达
  •     3.4.2 TSC1 调控的转录组介导树突状细胞和T细胞的相互作用
  • b和IL-7 表达量的降低导致Tsc1 敲除的树突状细胞功能的缺陷'>  3.5 H2-Kb和IL-7 表达量的降低导致Tsc1 敲除的树突状细胞功能的缺陷
  •     3.5.1 TSC1 调控的MHC-I介导的抗原递呈对于OT-I CD8 阳性T细胞的增殖至关重要
  •     3.5.2 树突状细胞来源的IL-7对CD8 阳性T细胞的稳态维持必不可少
  •   3.6 失调的代谢——表观遗传通路导致MHC-I和 IL-7 表达下调
  •     3.6.1 Tsc1 敲除的树突状细胞中转录因子的表达没有明显缺陷
  •     3.6.2 Tsc1 敲除的树突状细胞中H2-K1和Il7 基因启动子区域的组蛋白乙酰化修饰程度大大降低
  •     3.6.3 乙酰辅酶A的含量和H2-K1 和Il7 基因启动子区域组蛋白乙酰化修饰程度紧密相关
  •     3.6.4 TSC1-mTOR-ACC1 通路通过调控乙酰辅酶A的含量进而调控H2-K1和Il7 基因启动子区域组蛋白乙酰化修饰以及H2-K1和Il7 的表达
  • 第四章 讨论
  • 参考文献
  • 在学期间的研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 石磊

    导师: 杨金波,肖晖

    关键词: 树突状细胞,代谢,表观遗传,阳性细胞

    来源: 兰州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 兰州大学

    分类号: Q23

    DOI: 10.27204/d.cnki.glzhu.2019.000059

    总页数: 111

    文件大小: 7643K

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