论文摘要
香菇（Lentinula edodes）是一种食药兼用的真菌,具有变温结实性,当温度高于25℃,会出现菌丝生长受到抑制、烧菌、菌丝变黄、子实体提前开伞,品质变差等问题,严重影响香菇的产量和质量。因此,研究高温胁迫影响香菇生长发育的分子机制对于选育优良耐热菌株,改善栽培条件,具有重要的指导意义。本文以香菇主栽品种18菌株以及经诱变和筛选得到的高温恢复型菌株18N44为供试材料,通过测定两种菌株的表型指标评估香菇菌株在应答高温胁迫后的差异,结合内参基因筛选及转录组学、蛋白组学、代谢组学检测技术,从转录、蛋白和代谢水平解析香菇应答高温胁迫过程中的分子表达模式,探究高温胁迫中的分子机理。主要研究结果如下:（1）高温胁迫下香菇表型分析在优化的最佳胁迫温度37℃,胁迫时间梯度为0,4,8,12,18,24h的条件下,观察到香菇菌丝生长受到抑制,分枝减少,形成了“热胁迫圈”,通过测定相对电导率、丙二醛、渗透势、活性氧及抗氧化剂等生理指标,发现菌株18N44对高温胁迫响应更敏感,但热激处理24 h解除高温胁迫后,菌株18恢复生长速度为0.881 mm/d,菌株18N44为1.613 mm/d,表明18N44恢复生长能力更强。（2）高温胁迫下香菇内参基因筛选和验证利用 qRT-PCR 方法,基于 geNorm、NormFinder和 BestKeeper 软件,并结合实验验证,从10个候选内参基因中明确了TUB（β-Tubulin）可作为香菇基因表达分析的最佳内参基因,为qRT-PCR检测香菇目的基因在高温胁迫环境下的表达规律提供必要的指导和校正依据。（3）高温胁迫下香菇转录组学分析利用PacBio Sequel和Illumina Hiseq Xten平台对两种香菇菌株在各个高温胁迫时间点进行了转录组测序。结合全长转录组Isoform库与二代测序结果,比较两种菌株在各个高温胁迫时间点中差异表达的基因,基于功能富集和表达趋势分析,结果表明菌株18N44参与的高温胁迫相关的生物过程更多,是响应高温胁迫更积极可能原因。且富集的功能主要集中在蛋白质的空间折叠、蛋白质的稳定性、细胞热适应、热激蛋白结合能力等。在菌株18N44中特有的差异表达基因存在着大量的热激蛋白如hsp100、hsp90、hsp70、hsp60等,疏水蛋白hyd1等,这些热激蛋白和疏水蛋白在高温胁迫中,可以有效的修复变性蛋白,降低错误折叠蛋白,保护细胞的完整性从而增强抵抗力,对生物体起到保护作用,在胁迫中RNA水平下的调控可以有效保护机体不受过度伤害,当胁迫解除,可以迅速完成转录、翻译和修饰等生物过程,从而完成较快的生长恢复。（4）高温胁迫下香菇代谢组学分析利用GC-MS技术,检测两种香菇菌株在高温胁迫各时间点中的代谢物含量及表达变化。18N44菌株的差异代谢物通路富集结果显示:谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的代谢,TCA循环,谷胱甘肽代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢变化比较显著。富集在这些代谢通路中的多数氨基酸和糖类,在菌株18中主要表现为上调,在菌株18N44中表现为下调,或者在菌株18中合成高于菌株18N44。氨基酸和糖醇等代谢产物的变化一定程度上为响应高温时菌株18N44的表型生理特征比出发菌株18更加积极提供了理论解释。（5）高温胁迫下香菇目标代谢物靶向定量和外源添加的功能验证筛选的目标代谢物靶向含量测定结果和非靶向普筛鉴定的相对含量变化趋势基本一致,证明了非靶向鉴定结果的准确性。并对关键的目标代谢物海藻糖和甘露醇的功能通过外源添加实验进行验证,结果表明两种代谢物不仅在正常条件下具有促进生长的营养功能,还能在高温胁迫环境中有效保护机体免受过度伤害,增强机体修复的能力,也为组学的验证建立了新方法,证明了代谢组学筛选的可靠性,有利于改良栽培措施,优化栽培配料制备,预防香菇的高温伤害。（6）高温胁迫下香菇多组学联合分析整合分析两菌株高温胁迫24h时差异显著的基因、蛋白、代谢物,构建多分子调控和Pathway互作的网络图。结果显示,高温胁迫后,具有显著差异的基因543个、蛋白20个、代谢物162个,主要富集在参与调控的信号通路TCA循环、丙酮酸代谢、丙酸代谢、氧化磷酸化、碳代谢、氨酰-tRNA的生物合成、氨基酸的生物合成、次生代谢产物的生物合成、磷酸戊糖途径、糖酵解和糖异生等途径。这些途径包含了具体的调控信息,解释了菌株18N44高温恢复能力强的分子机理,也为分子育种选育耐高温菌株提供依据。上述结果初步揭示了不同耐高温特性的香菇菌株应答高温胁迫时的表型差异和分子调控机理,并对诱变得到的高温恢复型菌株18N44的恢复机理作出了预判。但对恢复阶段的调控机理还需进一步研究,关键通路的作用需要实验解析,外源添加目标代谢物的功能还需要在子实体发育阶段进行深入验证。
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摘要ABSTRACT第1章 绪论 1.1 引言 1.2 香菇概述 1.2.1 香菇的学名及分类 1.2.2 香菇的食药用价值 1.2.3 香菇的生物学特性 1.2.4 香菇的生长和发育条件 1.2.5 香菇的栽培育种研究进展 1.2.6 香菇的高温胁迫研究进展 1.3 内参基因概述 1.3.1 内参基因研究背景 1.3.2 内参基因筛选标准和分析方法 1.4 组学技术研究进展 1.4.1 转录组学研究进展 1.4.2 蛋白组学研究进展 1.4.3 代谢组学研究进展 1.4.4 多组学联合分析的应用 1.5 本研究的目的、意义和思路 1.5.1 研究的目的与意义 1.5.2 拟解决的科学问题 1.5.3 研究的内容 1.5.4 技术路线 1.5.5 预期成果第2章 香菇响应高温胁迫的表型研究 2.1 研究背景 2.2 材料与方法 2.2.1 供试菌株 2.2.2 实验试剂 2.2.3 主要仪器设备 2.2.4 培养基的配制 2.2.5 菌丝的处理及收集 2.2.6 高温胁迫下香菇的形态变化测定 2.2.7 高温胁迫后香菇的恢复生长速度测定 2.2.8 高温胁迫下香菇的相对电导率测定 2.2.9 高温胁迫下香菇的丙二醛（MDA）含量测定 2.2.10 高温胁迫下香菇的渗透势测定 2.2.11 高温胁迫下香菇的活性氧及抗氧化剂的测定 2.3 结果与分析 2.3.1 香菇响应高温胁迫的菌丝形态测定结果 2.3.2 香菇响应高温胁迫后的恢复生长速度测定结果 2.3.3 香菇响应高温胁迫的相对电导率测定结果 2.3.4 香菇响应高温胁迫的丙二醛（MDA）测定结果 2.3.5 香菇响应高温胁迫的渗透势测定结果 2.3.6 香菇响应高温胁迫的活性氧及抗氧化剂测定结果 2.4 讨论 2.5 本章小结第3章 香菇响应高温胁迫的内参基因筛选 3.1 研究背景 3.2 材料与方法 3.2.1 供试菌株 3.2.2 实验试剂 3.2.3 主要仪器设备 3.2.4 菌丝的处理及收集 3.2.5 香菇菌丝体总RNA提取及反转录 3.2.6 候选内参基因的选择和引物设计 3.2.7 qRT-PCR反应体系的建立 3.2.8 候选内参基因扩增效率的评价方法 3.2.9 候选内参基因的验证方法 3.2.10 统计分析 3.3 结果与分析 3.3.1 总RNA质量检测 3.3.2 候选内参基因引物扩增效率及特异性 3.3.3 候选内参基因的扩增效率计算结果 3.3.4 候选内参基因的稳定性分析结果 3.3.5 候选内参基因的验证结果 3.4 讨论 3.5 本章小结第4章 香菇响应高温胁迫的转录组学研究 4.1 研究背景 4.2 材料和方法 4.2.1 菌株与培养基 4.2.2 实验试剂 4.2.3 主要仪器设备 4.2.4 菌株培养与高温胁迫处理 4.2.5 总RNA提取和测序方法 4.2.6 测序文库构建方法 4.2.7 三代全长转录组测序数据预处理与非冗余转录本分析 4.2.8 非冗余转录本功能注释 4.2.9 基因定量、差异基因筛选、功能富集及聚类分析 4.2.10 差异基因表达谱趋势聚类的STEM分析方法 4.2.11 两株香菇高温胁迫差异表达基因的qRT-PCR验证 4.2.12 编码蛋白框（CDS）预测 4.2.13 SSR和SNP & INDEL检测 4.3 结果与分析 4.3.1 全长转录组测序数据质控和非冗余转录本分析 4.3.2 非冗余转录本常规数据库注释 4.3.3 非冗余转录本转录因子注释 4.3.4 二代转录组测序数据质控和过滤 4.3.5 基于三代和二代测序的非冗余转录本表达量分析和差异筛选 4.3.6 高温胁迫下香菇差异基因的GO功能富集分析 4.3.7 高温胁迫下香菇差异基因的KEGG功能富集分析 4.3.8 高温胁迫下香菇差异基因表达谱趋势聚类的STEM分析 4.3.9 高温胁迫下香菇差异基因的qRT-PCR验证 4.3.10 编码蛋白框（CDS）预测结果 4.3.11 SSR和SNP&INDEL的检测结果 4.4 讨论 4.4.1 非冗余转录本的构建和常规数据库注释分析 4.4.2 高温胁迫下香菇差异基因的表达分析 4.4.3 高温胁迫下香菇差异基因的功能分析 4.4.4 高温胁迫下香菇差异基因的动态变化趋势分析 4.5 本章小结第5章 香菇响应高温胁迫的代谢组学研究 5.1 研究背景 5.2 材料与方法 5.2.1 实验材料 5.2.2 菌丝培养及高温胁迫处理 5.2.3 实验试剂 5.2.4 主要仪器设备 5.2.5 样本前处理 5.2.6 GC-MS非靶向代谢组学分析条件 5.2.7 氨基酸标准液的配制 5.2.8 氨基酸混标溶液的制备 5.2.9 靶向代谢物的提取 5.2.10 靶向衍生化处理 5.2.11 GC-MS靶向代谢组学分析方法建立 5.2.12 数据分析 5.2.13 目标代谢物外源添加的验证方法 5.3 结果与分析 5.3.1 GC-MS检测结果及非靶标代谢组学方法确证 5.3.2 化合物鉴定结果 5.3.3 数据降维处理结果 5.3.4 差异代谢物的筛选及通路富集分析 5.3.5 差异显著代谢物的通路分析 5.3.6 关键差异代谢物质靶向代谢组分析 5.3.7 目标代谢物外源添加验证结果 5.4 讨论 5.4.1 香菇高温胁迫下的代谢组学分析 5.4.2 外源添加目标代谢物对香菇高温胁迫的缓解效应 5.5 本章小结第6章 香菇响应高温胁迫的多组学关联分析 6.1 研究背景 6.2 材料与方法 6.2.1 实验材料 6.2.2 菌丝培养及高温胁迫处理 6.2.3 差异基因生物信息分析方法 6.2.4 差异蛋白生物信息分析方法 6.2.5 差异代谢物生物信息分析方法 6.2.6 基于代谢通路的整合分析方法 6.2.7 基因、蛋白、代谢物及相关酶互作网络构建 6.3 结果与分析 6.3.1 差异基因生物信息分析结果 6.3.2 差异蛋白生物信息分析结果 6.3.3 差异代谢物生物信息分析结果 6.3.4 转录组、蛋白组和代谢组整合分析结果 6.4 讨论 6.5 本章小结第7章 全文总结与展望 7.1 全文总结 7.2 创新点 7.3 存在的问题 7.4 研究展望参考文献附录 附表一: 符号和缩略语说明 附表二: 转录组样本过滤后的数据统计（QC） 附表三: fpkm相关信息 附表四: 代谢通路统计表 附图一: 组学整合的KEGG通路致谢在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果
文章来源
类型: 博士论文
作者: 赵旭
导师: 吴跃进
关键词: 香菇,高温胁迫,内参基因,转录组学,蛋白组学,代谢组学
来源: 中国科学技术大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,园艺
单位: 中国科学技术大学
分类号: S646.12;Q945.78
DOI: 10.27517/d.cnki.gzkju.2019.000084
总页数: 179
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标签：香菇论文; 高温胁迫论文; 内参基因论文; 转录组学论文; 蛋白组学论文; 代谢组学论文;
