超声调控血小板生物活性与装载纳米颗粒的研究

论文摘要

血小板作为循环系统的哨兵,其在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中发挥了重要作用。近年来,开发靶向血小板以及利用天然血小板自身或血小板膜构建的各种微纳药物输运系统已在血栓和肿瘤等疾病诊治方面显示了极大的潜力。本论文以血小板为研究对象,深入探究了超声能量对血小板生物活性的影响,并进一步通过超声能量的调控,实现了血小板细胞膜渗透性增强后的小分子成分和纳米颗粒的细胞内装载,无损装载了纳米颗粒的血小板既保持了天然血小板的生物活性和功能,又可进一步应用于暗场、光声的生物成像研究。该论文主要研究内容如下:首先,研究了超声能量（超声频率、强度和作用时间）对血小板生物活性的影响。从血小板的聚集能力、P选择素（CD62P）在血小板膜上的表达量等方面探究了血小板对超声能量的响应,结果表明,低频超声（45 kHz,80 kHz,100 kHz）对血小板的聚集功能基本没有影响;当超声频率为1 MHz时,0.25 W/cm2的超声强度对血小板的聚集功能、表面形态以及微粒释放均没有太大的影响,但当超声强度大于0.25 W/cm2时,除会影响血小板的聚集能力,还会使血小板产生伪足、改变血小板的形态、增加血小板的微粒释放,并且随着超声强度的增加而加剧;当超声强度为0.25 W/cm2时,超声时间60 s对血小板的生物活性不会产生影响,但当超声时间大于60 s时,对血小板的聚集能力、表面形态及微粒的释放会产生影响,却不会影响血小板的α颗粒分泌CD62P,并且超声参数为1 MHz,0.25 W/cm2,60 s时,血小板的蛋白成分亦不受影响。进而,在优化超声能量参数条件下（1 MHz,0.25 W/cm2,60 s）,研究了超声能量促进氯金酸、还原剂（NaBH4和柠檬酸钠）等小分子物质进入血小板,进一步利用血小板内还原酶,在细胞内原位合成金纳米颗粒（GNPs）。结果表明,血小板的细胞膜在超声能量作用下渗透性增强,细胞质中能快速（30 min）原位合成5 nm左右的GNPs。血小板细胞质内均匀分布的GNPs(Au合成量为（12.7±2.4）×10-3 pg/细胞)使血小板具有拉曼增强效应,并可实现血小板的暗场成像和计算机断层扫描（CT）成像。最后,进一步通过超声能量的调控,研究了GNPs与血小板的相互作用过程,结果表明,在超声能量为0.25 W/cm2（1 MHz,60 s）时,36 nm的GNPs通过胞吞作用/开放性小管系统（OCS）的细胞膜内化及声孔效应机理,能够被快速（30min）装载进入血小板内。与传统的共孵育装载GNPs的方法相比,装载量提高了32.1%。装载GNPs后的血小板具有光声和暗场成像的效果。此外,研究发现,表面包裹聚葡萄糖山梨醇羧甲基醚的γ-纳米氧化铁不能被装载进入血小板内,表明纳米颗粒的不同表面修饰会影响装载过程。本论文提出的超声辅助下在血小板内原位合成以及直接装载GNPs的方法,在血小板保持天然活性和生物学功能的基础上,实现了纳米颗粒的装载,这种声能协助构建的“特洛伊木马”仿生多功能载体,可实现天然高靶向、多模式生物成像等应用研究,在血小板相关疾病的诊断和治疗中具有极大的应用潜力。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 引言

1.2 血小板的生物学功能及生物医学应用

1.2.1 血小板在生理和病理方面的作用

1.2.2 血小板作为药物载体在生物医学方面的应用

1.3 纳米颗粒的特性及功能应用

1.4 超声能量与细胞之间的相互作用

1.4.1 超声能量的性能特点

1.4.2 超声能量作用于细胞的应用研究

1.5 本论文的主要研究内容和创新点

1.5.1 主要研究内容

1.5.2 创新点

第二章超声能量与血小板相互作用研究

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 血小板的处理

2.3.2 超声调控血小板生物活性

2.3.3 血小板的数量测定分析及形态学观察

2.3.4 血小板聚集能力的测定

2.3.5 血小板蛋白含量的测定

2.3.6 流式细胞仪测定

2.4 实验结果和讨论

2.4.1 超声作用对血小板聚集能力的影响

2.4.2 血小板的SEM观察结果

2.4.3 超声作用前后正常血小板数量的测定

2.4.4 血小板活化程度的测定

2.4.5 超声作用对血小板蛋白成分的影响

2.5 本章小结

第三章超声辅助血小板内快速原位生物合成金纳米颗粒的研究

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 超声辅助活体血小板快速原位生物合成金纳米颗粒

3.3.2 金纳米颗粒生物合成后血小板的定性和定量分析

3.3.3 流式细胞仪分析

3.3.4 血小板的蛋白表征

3.3.5 血小板聚集能力的测定

3.3.6 超声辅助活体血小板快速原位生物合成金纳米颗粒的应用

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 金纳米颗粒在血小板内快速原位生物合成

3.4.2 流式细胞术和SEM表征

3.4.3 血小板内金纳米颗粒分布的表征

3.4.4 金纳米颗粒合成后的血小板特定性质分析

3.4.5 金纳米颗粒合成后血小板的拉曼增强效应及暗场、CT成像效果

3.4.6 超声辅助活体血小板快速原位生物合成金纳米颗粒的机制探讨

3.5 本章小结

第四章超声调控血小板直接装载纳米颗粒的研究

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 血小板直接装载金纳米颗粒浓度的优化

4.3.2 超声调控血小板直接装载金纳米颗粒

4.3.3 超声调控血小板直接装载金纳米颗粒的定性和定量分析

4.3.4 血小板直接装载金纳米颗粒的形态学表征

4.3.5 血小板直接装载金纳米颗粒后的稳定性及活化程度测定

4.3.6血小板聚集和凝血实验

4.3.7 超声调控血小板直接装载金纳米颗粒的光声和暗场成像

4.3.8 超声调控血小板直接装载三氧化二铁纳米颗粒

4.4 实验结果和讨论

4.4.1 血小板直接装载金纳米颗粒浓度的优化

4.4.2 血小板直接装载金纳米颗粒超声参数的优化

4.4.3 直接装载金纳米颗粒后的血小板表面及内部表征

4.4.4 血小板直接装载金纳米颗粒后稳定性及活化程度的测定

4.4.5血小板聚集和凝血实验

4.4.6 暗场显微镜及光声成像

4.4.7 超声调控血小板直接装载三氧化二铁纳米颗粒的研究

4.5 本章小结

第五章总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

致谢

参考文献

硕士期间成果清单

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘桃桃

导师: 杨芳

关键词: 血小板,纳米颗粒,超声,光声成像,暗场成像

来源: 东南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物医学工程

单位: 东南大学

分类号: R318

DOI: 10.27014/d.cnki.gdnau.2019.002319

总页数: 75

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