导读:本文包含了共表达质粒论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,蛋白,质粒,免疫,毒素,白介素,病毒。
共表达质粒论文文献综述
熊泰特,万小平,陈建林,肖永乐,陈义辉[1]（2018）在《共表达猪IL-2与融合抗菌肽重组质粒的构建及其小鼠免疫效应研究》一文中研究指出为研制新型高效安全的动物免疫调节剂,本实验采用In-fusion克隆技术、2Aself-cleavage技术构建pVAX1融合抗菌肽与白细胞介素2基因真核共表达载体:CAM PS-2A-IL2(VAP2)。构建的重组质粒用壳聚糖包裹并转染HEK293细胞,通过猪外周血淋巴细胞刺激实验检测表达上清活性。将包裹的重组质粒纳米颗粒腹腔注射接种4周龄的雌性昆明小鼠作体内生物学活性研究。并于28d后用大肠杆菌(Amp、Kana高耐受)和金黄色葡萄球菌(Amp、Kana高耐受)进行攻毒试验,观察每组小鼠的发病率和死亡率。实验结果表明VAP、VAP2两实验组CD~(4+)、CD~(8+)细胞,IgG,IgG1,IgG2a含量以及TLR s,IFN-r等免疫相关因子的表达水平均明显高于对照组pVAX1(P<0.05)。而且两实验组相比较,VAP2组明显高于VAP组(P<0.05)。以上实验结果表明,CS包裹的VAP,VAP2能有效防止病原微生物感染小鼠,增强机体的体液免疫和细胞免疫能力,并且VAP2的作用要明显优于单一抗菌肽融合基因,表明抗菌肽融合基因与白细胞介素2的共表达对动物有更好的保护效应,这为研究新型有效的免疫分子以增强机体对感染的抵抗力奠定了基础,具有重要的学术价值和应用。(本文来源于《畜牧兽医科技信息》期刊2018年03期）
何秀贞,晏永波,诸梦露,林绍强[2]（2017）在《人T-bet和HBV-L共表达质粒的构建及体外表达》一文中研究指出目的构建人转录因子T-bet基因与乙肝病毒表面抗原大蛋白全长基因(hepatitis B virus surface antigen large protein,HBV-L)的共表达载体,并检测其在体外的表达。方法利用PCR及基因重组技术,以人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的cDNA为模板,扩增获得人T-bet全长基因,以含有HBV-L的质粒pcDNA3.1-HBV-L为模板,扩增获得HBV-L基因,将上述2个基因克隆至真核表达质粒p IRES中,获得共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L。将该质粒转染293T细胞,经RT-PCR、ELISA和细胞免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。结果限制性酶谱分析及测序证实重组质粒p IRES-T-bet-HBV-L构建成功;该质粒在体外转染293T细胞后,可表达T-bet与HBV-L两者的mRNA;细胞免疫荧光试验和ELISA检测结果证实,该质粒转染293T细胞后可表达T-bet和HBV-L蛋白。结论成功构建了共表达质粒pIRES-T-bet-HBV-L,该质粒能在293T细胞中表达。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2017年06期）
雷云[3]（2017）在《共表达RA OmpA与鸭IL-2重组质粒的构建及免疫研究》一文中研究指出鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer;RA)病是由鸭疫里默氏杆菌感染引起的一种急性、高致病性传染病。目前已呈世界性流行,是严重危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。RA的血清型众多,且不同血清型之间有少数存在有较低的交叉保护作用,再加上临床治疗抗生素药物的频繁滥用及用药量的不合理,导致RA易产生多重耐药性和食品卫生安全,因此给该病的防治带来了极大的困难。RA外膜蛋白A(OmpA)在不同血清型RA中均具有良好的免疫原性,可制成一种针对多血清型的RA疫苗;而IL-2具有免疫增强、免疫治疗及免疫预防等作用,在构建新型基因工程疫苗方面显现良好的应用前景。结合二者的优势,本实验将RA OmpA与鸭IL-2基因进行融合基因的构建及表达,构建真核表达重组质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA,将其免疫健康雏鸭后通过检测雏鸭的免疫指标,评价d IL-2-OmpA融合蛋白诱导雏鸭产生免疫效果,并探讨鸭IL-2对RA核酸疫苗的免疫增强作用,为将来研发安全、廉价、高效的新型RA疫苗奠定基础。1.RA贵州株的分离鉴定及OmpA与16S rRNA基因的序列分析:为了解RA贵州分离株OmpA和16S rRNA基因序列的相关性以及与RA血清型分型之间的关系,本研究通过PCR技术对12株RA分别扩增OmpA和16S rRNA基因,对其构建系统进化树和分析其系统进化关系。结果显示,12株RA分离株OmpA基因分属在2个基因群,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.9%-100%和98.4%-100%;OmpA蛋白中有规律的变异位点为100(R/G)、143(S/P)、145(T/I)和268(S/P)。12株RA分离株16S rRNA基因同属1个群,其核苷酸序列同源性为99.4%-100.0%。结果表明,12株RA贵州分离株OmpA和16S rRNA基因序列所属的基因群无明显相关性,并且与RA血清型的分型也无直接关联。2.叁穗鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析:为了解叁穗麻鸭d IL-2基因的分子差异和遗传变异水平,本实验根据Gen Bank发表的鸭d IL-2基因序列,设计并合成一对特异性引物,从刀豆蛋白A(Con A)诱导的叁穗麻鸭颈外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增叁穗麻鸭d IL-2基因并进行基因克隆与序列分析。测序结果表明,叁穗麻鸭d IL-2基因编码区序列(CDS)全长为423 bp,共编码140个氨基酸,预测的分子式为C695H1125N175O226S13。序列分析发现,叁穗麻鸭与绿头鸭、番鸭、绍兴麻鸭的IL-2基因核苷酸序列同源性最高(为98.3%);与其它水禽IL-2蛋白氨基酸序列相比,在29(N/D)、32(K/T)、49(D/N)、58(T/K)、90(K/N)、105(M/T)、122(N/K)和129(Q/R)存在8处氨基酸位点变异,仅有L66、C68、E72和F127这4个氨基酸是叁穗麻鸭和人与其它动物IL-2所共有保守位点。旨在为进一步研究d IL-2基因的生物学功能以及开发疫苗免疫佐剂奠定基础。3.RA OmpA基因与d IL-2基因重组质粒的构建与鉴定:为了解RA OmpA与IL-2融合基因构建真核表达质粒的蛋白表达情况。本实验以RA贵州分离株血清2型OmpA基因和叁穗麻鸭d IL-2基因的克隆质粒DNA为模板,设计并合成带有linker的特异性引物,利用SOE-PCR方法扩增d IL-2-OmpA融合基因。将其插入真核表达载体pc DNA3.1(+)中成功构建pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA融合表达质粒。通过脂质体将其转染禽细胞DF-1进行Western-blot检测发现,d IL-2-OmpA蛋白分子量为57 k Da。结果表明,融合表达质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA能够在真核细胞中表达,为后续的动物免疫试验研究提供了基础。4.重组质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA对雏鸭感染RA的免疫保护研究:为了解重组质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA对雏鸭感染RA的免疫效力,本实验选取10日龄的叁穗麻鸭70只,随机分成5组即pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA组、pc DNA3.1(+)-OmpA组、pc DNA3.1(+)组、灭活疫苗组和空白对照组,在免疫后的不同时间段采集鸭血分离血清,应用间接ELISA方法测定RA抗体水平。同时选取血清1型和2型RA菌株测定毒力后分别进行攻毒保护试验。结果显示,重组质粒组和灭活疫苗组均能诱导免疫鸭产生RA抗体,其中pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA组的抗体水平明显高于pc DNA3.1(+)-OmpA组,差异极显着(P<0.01)。以血清1型和2型RA菌株分别进行感染试验鸭,pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA组、pc DNA3.1(+)-OmpA组和灭活疫苗组的免疫保护率分别为66.67%和66.67%,33.33%和50%,83.33%和100%。结果表明,pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA、pc DNA3.1(+)-OmpA均能产生免疫保护效果,其中d IL-2作为免疫佐剂对重组质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA在雏鸭体内的免疫起到免疫增强作用。重组质粒免疫雏鸭对血清1型和2型RA具有较弱的交叉免疫保护作用。本研究为将来研发安全、高效的新型RA佐剂疫苗提供参考依据。综上所述:本试验成功克隆了血清2型RA OmpA基因和叁穗麻鸭d IL-2基因,并构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA和pc DNA3.1(+)-OmpA免疫雏鸭,能刺激鸭体内产生RA特异性抗体,对血清1型和2型RA均有一定的交叉免疫保护作用,其中d IL-2作为免疫佐剂可以促进真核表达质粒pc DNA3.1(+)-d IL-2-OmpA的免疫保护效果。(本文来源于《贵州大学》期刊2017-06-01）
周小芬,林卫萍,何华红,李想,张焜[4]（2015）在《不相容双质粒共表达霍乱毒素类似嵌合蛋白》一文中研究指出霍乱毒素由5个B亚基(CTB)和l个A亚基(CTA)(包括CTA1和CTA2)组成。该蛋白结构可帮助有毒的CTA1分子进入细胞。本研究拟利用原核不相容双质粒共表达系统获得霍乱毒素类似嵌合蛋白,用于大分子蛋白质黏膜给药的载体研究。将CTB基因片段克隆至载体p ET-28a中,获得重组质粒p ET-28a-CTB;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)代替有毒的CTA1,在CTA2序列N端融合穿膜肽(TAT),将EGFP-CTA2-TAT基因克隆至载体p ET-22b(+)中,获得重组质粒p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT。利用p ET-28a-CTB和p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,将双质粒分步转化到大肠杆菌BL21中。表达条件为0.75 mmol/L IPTG、20℃、200 r/min诱导20 h,重组嵌合蛋白能以可溶形式表达。经过Ni-NTA、Sephadex G-75纯化,Western blotting对蛋白质特异性进行鉴定,确定获得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2015年07期）
李宁,吉晓滨,谢景华,刘启才[5]（2015）在《葡萄球菌肠毒素A与黑色素瘤抗原A3共表达真核质粒致敏小鼠淋巴细胞对喉癌细胞模型的影响》一文中研究指出目的观察真核质粒p MAGEA3-IRES-SEA免疫小鼠后,鼠脾淋巴细胞对喉癌细胞模型B16/MAGEA3的杀伤作用。方法将葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal endotoxin A,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3),构建成基因共表达的真核质粒p MAGEA3-IRES-SEA,用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌。末次免疫2周后,取脾分离淋巴细胞,与B16/MAGE-A3细胞共同培养,MTT法观察活化的淋巴细胞对B16/MAGE-A3的杀伤作用。结果 ptk-IRES-SEA、p IRES2-EGFP/MAGE-A3和p MAGEA3-IRES-SEA质粒组对B16/MAGE-A3细胞特异性杀伤率均高于空白质粒及生理盐水组(P<0.05);p MAGEA3-IRESSEA质粒组杀伤作用大于ptk-IRES-SEA、p IRES2-EGFP/MAGE-A3质粒组(P<0.05)。结论构建的p MAGEA3-IRES-SEA真核质粒可通过电转染的方式输入到小鼠体内,诱导特异性细胞免疫,可提高杀伤B16/MAGE-A3细胞的作用。为DNA疫苗接种途径、方法及抗喉癌疫苗的研究提供了实验依据。(本文来源于《中国耳鼻咽喉颅底外科杂志》期刊2015年02期）
赵晓晖,芦丽莉,葛贺,李冰,赵雪俭[6]（2014）在《携带pGRIM-19-si-survivin共表达质粒的减毒沙门菌对前列腺癌移植瘤的体内抑制作用》一文中研究指出目的:探讨人减毒沙门菌携带pGRIM-19-si-survivin共表达质粒对人前列腺癌皮下移植瘤生长的抑制作用及相关机制。方法:复制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型,通过腹腔注射携带共表达质粒的减毒沙门菌进行治疗,实时监测肿瘤体积;运用免疫组织化学染色法、RT-PCR法和TUNEL法检测携带pGRIM-19-si-survivin共表达质粒的减毒沙门菌对肿瘤抑制作用的相关机制。结果:与psi-survivin或pGRIM-19单基因治疗对照组比较,携带pGRIM-19-si-survivin共表达质粒减毒沙门菌组肿瘤体积明显缩小,其缩小率分别约为2.36和3.02倍;肿瘤组织内survivin mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.05),GRIM-19 mRNA及蛋白表达明显增高(P<0.05),凋亡相关蛋白Bcl-xL、Stat3、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达明显降低(P<0.05),血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及Ki67蛋白表达降低而caspase-3 mRNA表达明显上调(P<0.05),同时细胞凋亡明显。结论:携带pGRIM-19-si-survivin共表达质粒的减毒沙门菌明显抑制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的生长,其发生机制与促进细胞凋亡及抑制肿瘤细胞增殖有关。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2014年06期）
Seydou,Sylla（赛度）[7]（2014）在《共表达PCV2 Cap基因及TGEV S基因的真核重组质粒构建及实验免疫研究》一文中研究指出猪圆环病毒属于环状病毒科，圆环病毒属，其成员包括PCV1和PCV2。PCV1对猪没有致病性，而PCV2可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）。在国产猪中PCV2的感染非常普遍，而且在五大洲各个国家都诊断出有PMWS发生，患病率在4-30%不等。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是单链RNA病毒，属于尼多病毒目、冠状病毒科，能够引起猪的传染性胃肠炎。各个品种和各个年龄段的猪都对TGEV易感，并且在感染后3周内死亡率可达到100%。因此，PCV2和TGEV在世界范围内的养猪业中都是毁灭性疾病，预防接种是避免PCV2和TGEV感染的有效方法。虽然现有的抗PCV2和TGEV的疫苗可以有效地减少临床症状的出现，并且能够提高农场生产量，但这些疫苗无法完全防止PCV2和猪TGEV的感染和传播。此外，一些实验性的灭活疫苗、DNA疫苗、含有PCV2Cap或TGEV S基因的重组活病毒载体疫苗也用于抗PCV2和TGEV的感染。尽管如此，这是首次在同一种疫苗载体中共表达PCV2Cap和TGEV S基因，并用其免疫猪以抵抗PCV2和TGEV的感染。本研究的目的是在真核表达载体中共表达PCV2Cap和TGEV S融合蛋白基因，并评价该重组DNA疫苗在猪体内抵抗PCV2或TGEV感染的免疫原性和保护率。因此，我们在pEGFP-N1真核表达载体中个使PCV2Cap基因（702bp）和包括免疫位点A的TGEV S基因（1830bp）得到共表达。Cap基因和S基因之间采用柔性接头(Gly4Ser)3相连。重组疫苗已经通过PCR、双酶切和测序进行鉴定。利用Western blot检测PCV2Cap、TEGV S和Cap-S重组蛋白在PK-15细胞中的表达。利用间接ELISA检测IFN-γ的体外表达水平。将32只猪随机分成6组，每次每只免疫500μg pEGFP-Cap、pEGFP-S、pEGFP-Cap-S和2ml PBS，每隔两周免疫一次，共免叁次。在第叁次免疫后一周攻毒，攻毒剂量为2x107TCID50的PCV2或TGEV病毒。通过间接ELISA、NA、T淋巴细胞流式细胞术、病毒量、HE和免疫组化等试验检测这种DNA疫苗在猪体内针对PCV2和TGEV的免疫原性和保护效率。本研究结果显示，用pEGFP-Cap或pEGFP-S免疫的实验组，可以通过诱导高度特异性血清IgG抗体、IgA、IgG1和IgG2a同型抗原以及细胞因子(IFN-γ和IL-10)而引发猪体内的固有保护机制。这些DNA疫苗能够减少PCV2和TGEV的病毒量。Cap和S基因共表达的产物能够加强免疫动物针对PCV2或TGEV感染的体液和细胞免疫应答。HE染色显示pEGFP-Cap、pEGFP-S和pEGFP-Cap-S免疫组没有明显的组织病理学损伤；免疫组化结果显示，与PCV2和TGEV攻毒对照组相比，也仅有少量的阳性细胞。总之，本研究证明：PCV2Cap和TGEV S基因共表达的重组DNA疫苗能够大大减轻PCV2和TGEV对猪的感染。(本文来源于《吉林大学》期刊2014-06-01）
顾俊莲[8]（2014）在《锌联合Si-mdm2与P53共表达质粒（Pmp53）抗前列腺癌的实验研究》一文中研究指出背景：前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，手术和放化疗是前列腺癌主要的治疗手段，由于其副作用大，容易复发等原因，严重影响前列腺癌的治疗和预后。近年来，随着药物和分子生物学的迅猛发展，药物联合基因治疗方法以它的安全性和有效性得到了越来越多的关注。肿瘤细胞的生长和死亡很大程度上取决于癌基因和抑癌基因作用不平衡所导致，其中P53是最主要的抑癌基因之一，被冠以“基因卫士”之美名，它在调节正常细胞周期进程，凋亡发生，DNA修复及代谢环境稳态等方面发挥重要作用。大约有50%的人类肿瘤中存在P53突变，而且在各类肿瘤中已经鉴定出2000多种P53突变类型。逆转缺陷的P53功能对于减少肿瘤发生，改善肿瘤耐药将是一项理想的治疗策略。引起P53失活的原因很多，其中重要的有两个：（1）原癌基因MDM2对P53的泛素化降解。MDM2由P53诱导产生，P53与MDM2形成一种负反馈的调节环路，相互制约。MDM2的E3泛素连接酶的活性可以特异性的催化P53的泛素化及介导其出核，并在26S蛋白酶复合体中降解。此外MDM2可直接抑制P53的转录激活功能。所以切断MDM2-P53的反馈环路，对于增强P53蛋白的抑癌功能至关重要。（2）锌的缺失同样会影响P53功能。锌是体内200多种金属酶的辅酶，在基因表达和基因稳定性方面起着重要作用。P53蛋白DNA结合结构域具有锌的结合位点，结合锌以后能够稳定P53蛋白空间构象。在表达野生型P53蛋白的细胞培养中，应用金属锌螯合剂TPEN诱导的缺锌环境能够破坏P53野生型构象，失去其与靶基因DNA结合的活性。此外锌是参与前列腺液合成的必需微量元素之一，正常成年人前列腺液中锌含量为720ug/ml，而其他组织仅为80ug/ml，而前列腺癌血清和组织中的锌浓度下降60%-70%，并且随着前列腺癌的进展，锌的浓度进一步下降，锌的缺失可能也是前列腺癌中P53功能丧失和对放化疗产生耐受的主要原因之一。因此，本课题在构建MDM2特异siRNA与野生型P53相连接的共表达质粒Pmp53基础上，首次提出锌联合共表达质粒Pmp53治疗前列腺癌的方案。其目的一方面可以恢复前列腺癌中缺失或突变的P53状态，更好的发挥P53作为抑癌基因的功能，另一方面改善前列腺癌血清和组织中的缺锌状态。目的：通过基因重组技术构建pGCsilencer-mdm2（Si-mdm2）质粒与pcDNA3.1-U6si-mdm2-p53共表达质粒（Pmp53），探讨锌联合共表达质粒Pmp53对前列腺癌细胞株PC-3和DU145及前列腺癌移植瘤协同治疗效应及可能机制，为前列腺癌的联合治疗提供新的理论和实验依据。方法：参考实验室以前的工作基础，根据P53和MDM2的基因序列以及siRNA设计的基本原理，使用pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi和PCDNA3.1载体，利用酶切等技术，构建质粒Si-mdm2和Pmp53，运用RT-PCR和Western blot方法检测MDM2和P53基因和蛋白的表达，流式细胞术检测各组质粒对PC-3细胞凋亡的影响。体外实验以前列腺癌细胞株PC-3（缺失性P53）和DU145（突变性P53）细胞为研究对象。体外实验的分组：对照组，Zn组，TPEN组，Pmp53组，Pmp53+Zn组，Pmp53+TPEN组和Pmp53+Zn+TPEN组。MTT法检测锌联合Pmp53质粒对PC-3和DU145细胞增殖活性的影响；流式细胞术检测锌联合Pmp53质粒对PC-3和DU145细胞周期的影响；流式细胞术及TUNEL法检测锌联合Pmp53质粒对PC-3和DU145细胞凋亡的影响；罗丹明123观察锌联合Pmp53质粒对PC-3细胞线粒体膜电位的影响；qPCR, RT-PCR和Western blot检测与p53相关的靶基因和蛋白的表达；免疫共沉淀（Co-Immunoprecipatation）检测P53蛋白构象的变化；荧光素酶报告基因（Luciferase Reporter Activity）检测P53转录激活下游靶基因的活性；染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipatation）检测P53与其下游基因p21和bax启动子结合能力。体内实验构建裸鼠前列腺癌移植瘤模型，运用具有肿瘤靶向性的减毒沙门氏菌（Ty21a）携带共表达质粒Pmp53，联合灌胃方式给予锌及锌的抑制剂TPEN，观察其对前列腺癌移植瘤生长的影响及探讨其相关的分子机制。体内实验分组：对照组，Pmp53+TPEN组，Pmp53组和Pmp53+Zn组。这样分组的目是为了给裸鼠体内营造一种低锌，正常锌和补锌的环境。应用qPCR和Western blot检测肿瘤组织P53相关基因和蛋白的表达；应用免疫共沉淀检测P53蛋白构象的变化；流式细胞术和TUNEL检测细胞凋亡变化；HE和免疫组化检测肿瘤组织形态学及PCNA的表达。结果：经酶切鉴定，成功构建了siRNA-mdm2与p53的共表达质粒Pmp53。PCR，Western blot和流式细胞术结果显示前列腺癌细胞经转染Pmp53后，MDM2基因表达被干涉，同时高表达野生型P53，显着增强P53抑癌功能。体外实验证明：与锌和Pmp53组相比，锌联合Pmp53组显着增强了PAB1620的表达，稳定了P53的野生型构象。锌联合Pmp53组诱导细胞周期阻滞于GO-G1期，其机制可能与上调P21表达，下调CDK4，CDK6，CyclinD1表达有关。锌联合Pmp53组抑制增殖，诱导发生细胞凋亡，其机制可能与上调P53，Bax，Caspase-8, Caspase-9，Caspase-3表达，下调Bcl-2，PCNA，MMP2，MMP9表达有关。体内实验证明：应用减毒沙门氏菌携带Pmp53质粒联合锌治疗前列腺癌移植瘤。与对照，Pmp53+TPEN和Pmp53组相比，Pmp53+Zn组肿瘤体积显着缩小，重量显着减轻，肿瘤组织内凋亡率上升，差异具有统计学意义。免疫共沉淀结果显示Pmp53+Zn组显着增强了PAB1620的表达，与体外实验结果一致。HE结果显示Pmp53+Zn组出现大片无结构坏死灶。免疫组化检测到肿瘤组织PCNA和MDM2蛋白表达下调，P53蛋白表达上调，差异有统计学意义。结论：本实验成功构建了共表达质粒Pmp53。体内外实验证明锌联合共表达质粒Pmp53对前列腺癌具有显着治疗作用，且联合治疗的疗效优于单一治疗。其机制可能一方面与共表达质粒Pmp53直接抑制MDM2的表达，一定程度解除了MDM2对P53的负反馈抑制和降解作用，同时高表达野生型P53，既双重增强了野生型P53抑制肿瘤生长的作用有关；另一方面可能与锌进一步稳定了因导入Pmp53质粒而恢复的P53野生型构象，增强了P53转录激活活性，提高了其靶基因p21和bax的表达水平，诱导前列腺癌细胞周期阻滞和凋亡发生有关。(本文来源于《吉林大学》期刊2014-04-01）
殷殷[9]（2014）在《人源GM-CSF、IL-4基因串联共表达重组克隆质粒构建与表达》一文中研究指出目的本课题以人白细胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4, IL-4），粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)为模型细胞因子,建立并优化人源性细胞因子的组合，并在真核细胞中稳定性表达重组蛋白及其活性研究，这为多细胞因子在体外能够共同表达提供了实验素材和理论参考。构建人GM-CSF、IL-4基因各自独立和经IRES元件串联的重组真核表达质粒pGM-CSF、 pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，转染细胞并经过连接免疫荧光（indirectimmunofluorescence assay， IFA）及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）检测其表达活性，为构建永久表达细胞系做准备，同时人源细胞因子的体外表达及其诱生DC/CIK培养试剂盒的研发奠定了基础。方法1.引物和质粒的设计与合成依据GenBank上已经公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的参考序列。分别设计了附加酶切位点的引物，酶切位点为Xho I、Bgl II和Sal I、Mlu I，以及质粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4。2.重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4的构建经PCR扩增重组质粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM-CSF、IL-4；利用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行回收、琼脂糖凝胶回收纯化好的的PCR产物，分别在各自的酶切位点处进行双酶切，目的是回收两条目的基因片段GM-CSF和IL-4；用T4连接酶分别与经同步酶切的载体片段psT-ΔSG上进行连接，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建单独表达GM-CSF、IL-4基因的重组质粒pGM-CSF、pIL-4；将目的基因与连接片段IRES分步连接到PsT-ΔSG载体上，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表达载体。3.重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO细胞中的瞬时表达将重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在阳性脂质体的介导下转染CHO细胞，24小时后检测GM-CSF、IL-4在CHO细胞中的表达。4.IFA及Elisa检测表达情况对转染的CHO细胞用IFA和Elisa检测人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白质表达。结果1.真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4的构建成功构建的叁种真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，分别在经菌落PCR，质粒的PCR，琼脂糖凝胶电泳双酶切等方法鉴定后构建成功。2. IFA实验及Elisa实验检测GM-CSF、IL-4表达结果经过IFA的实验结果显示出，在荧光显微镜的下阳性表达的细胞大约在60%以上左右。Elisa的实验结果显示，GM-CSF、IL-4两种基因在培养的CHO细胞当中能够成功的表达。结论1.成功将人源基因GM-CSF、IL-4亚克隆入psT-ΔSG，分别构建了融合基因真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-42.人源细胞因子GM-CSF、IL-4在真核细胞中表达并鉴定正确，为构建人源细胞因子体外永久性表达细胞系及体外激活DC/CIK奠定了基础。(本文来源于《泰山医学院》期刊2014-04-01）
刘丹清,廖勇,刘敏慧,刘俊英,盛云建[10]（2014）在《基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达》一文中研究指出目的构建基于口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)2A片段的多基因共表达质粒,并在293T细胞中共表达HBx、人Sox2及人c-Myc基因。方法以FMDV 2A自剪切片段连接HBx、Sox2和c-Myc基因编码序列,克隆至载体pEGFP-C1,构建多基因共表达质粒pEGFP-XSM;在脂质体LipofectamineTM2000的介导下,将重组质粒pEGFP-XSM转染293T细胞,同时设空载体组(转染空载体pEGFP-C1)和空白对照组(未转染),转染48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达;Real-time PCR和Western blot法分别检测各组293T细胞中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果多基因共表达质粒pEGFP-XSM经酶切和测序鉴定构建正确;空载体组和pEGFP-XSM转染组细胞荧光镜下均可见GFP的表达;pEGFP-XSM转染组中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平较空白对照组及空载体组均明显升高(P﹤0.001);pEGFP-XSM转染组可见相对分子质量约48 000的GFP-HBx-2A融合蛋白条带和约38 000的HA-Sox2-2A融合蛋白条带,各组均可见相对分子质量约49 000的c-Myc蛋白条带,pEGFP-XSM转染组c-Myc蛋白的表达水平明显高于空白对照组及空载体组(P﹤0.01)。结论成功构建了多基因共表达质粒pEGFP-XSM,并在293T细胞中实现了HBx、Sox2和c-Myc蛋白的共表达,为进一步深入研究该共表达蛋白在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的生物学机制奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2014年03期）
共表达质粒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的构建人转录因子T-bet基因与乙肝病毒表面抗原大蛋白全长基因(hepatitis B virus surface antigen large protein,HBV-L)的共表达载体,并检测其在体外的表达。方法利用PCR及基因重组技术,以人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的cDNA为模板,扩增获得人T-bet全长基因,以含有HBV-L的质粒pcDNA3.1-HBV-L为模板,扩增获得HBV-L基因,将上述2个基因克隆至真核表达质粒p IRES中,获得共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L。将该质粒转染293T细胞,经RT-PCR、ELISA和细胞免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。结果限制性酶谱分析及测序证实重组质粒p IRES-T-bet-HBV-L构建成功;该质粒在体外转染293T细胞后,可表达T-bet与HBV-L两者的mRNA;细胞免疫荧光试验和ELISA检测结果证实,该质粒转染293T细胞后可表达T-bet和HBV-L蛋白。结论成功构建了共表达质粒pIRES-T-bet-HBV-L,该质粒能在293T细胞中表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
共表达质粒论文参考文献
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[10].刘丹清,廖勇,刘敏慧,刘俊英,盛云建.基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达[J].中国生物制品学杂志.2014
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