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利用CRISPR/Cas9构建FAH基因缺陷模型猪

2020-12-09阅读(650)

利用CRISPR/Cas9构建FAH基因缺陷模型猪

论文摘要

随着科学技术的不断发展,人类迫切的需要对各种疾病进行透彻的了解和研究,从而开发出能够有效治疗疾病的手段。但是,由于伦理道德的限制,科学研究并不能直接以活人作为实验研究的对象。而动物可以作为科学研究的直接对象,科学家可以直接在符合伦理审查的活体动物上做实验。与小鼠、大鼠等啮齿类动物相比,猪作为在器官构造,大小及生理结构上更加接近于人的物种之一,因其诸多的优势被广泛用于科学研究,作为动物模型,猪拥有的最大优势。自基因编辑技术现世以来,科学家已经能够通过基因编辑,如锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFN）技术、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALEN）技术和成簇规律性间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palidromic repeats,CRISPR/Cas）技术等获得基因编辑的动物,从而拿到动物疾病模型,进行相关疾病的研究。目前科研人员已经通过基因编辑技术逐渐建立了以小鼠,大鼠,兔子,猪为对象的FAH疾病模型。经鉴定这些疾病模型动物能很好的模拟人HT1肝纤维化,肝硬化等表型。遗传性酪胺酸血症Ⅰ型（Hereditary tyrosinemia type I,HT1）,在人类中是种严重的常染色体隐性遗传病,该病的发生是因为患者体内的延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fumarylacetoacetate hydrolase,FAH）缺失所造成,该酶是催化酪氨酸代谢的最后一步。如果体内FAH基因发生突变,就会导致血液中延胡索酰乙酸乙酯和琥珀酰丙酮大量积累,长时间最终会造成肝脏和肾脏的严重损伤,并造成胎儿期或者幼儿期肝肾病变,最终造成死亡。1998年科学家找到一种药物2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮（2-（2-nitro-4trifluoromethylbenzyol）-1,3 cyclohexanedione,NTBC）,它可以抑制延胡索酰乙酸乙酯和琥珀酰丙酮所产生的酪氨酸分解代谢产物的积累,从而防止肝肾毒性。1993年,Grompe M编辑小鼠胚胎干细胞获得了FAH的突变小鼠;2011年,Raymond等人首次使用通过AAV载体获得了FAH+/-模型猪;2014年,同一课题组利用体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT）技术获得了FAH+/-的雌雄猪,待其性成熟后两者交配繁殖FAH-/-模型猪;2016年,Lijian Hui利用CRISPR/Cas9技术制作了FAH-/-大鼠,随后,脾内注射107WT肝细胞,症状有所缓和;2017年,Liangxue Lai利用TALEN技术获得了FAH-/-模型兔。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9技术,构建了FAH基因敲除的猪成纤维细胞系,再利用该细胞进行体细胞核移植技术,通过胚胎移植后成功的制作了10只FAH-/-疾病模型猪。本研究的意义在于直接通过核移植技术,无需交配繁殖即可获得FAH-/-模型猪,缩短了繁殖周期,其次,构建FAH基因敲除的猪成纤维细胞再通过体细胞核移植技术可以大批量的制备FAH-/-模型猪。FAH-/-模型猪不仅可以作为疾病模型来研究遗传性酪氨酸血症的发病机理及治疗方法,也可以仿照肝人源化小鼠模型作为肝人源化猪模型的基本品系,此外,还可以为临床研究提供相关模型,用于测试各种细胞治疗方法的功效,为解决器官短缺问题提供一丝的曙光。（1）利用CRISPR/Cas9技术构建了FAH-/-猪胎儿成纤维细胞系。取35天胎儿构建6株胎儿成纤维细胞系,经过基因型鉴定,PEF-1,PEF-2,PEF-6为雌性,PEF-3,PEF-4,PEF-5为雄性。我们在FAH基因第一外显子设计了sgRNA序列构建敲除载体,通过细胞核电转建立了FAH-/-细胞系,最终得到了40bp敲除的FAH-31细胞系。（2）经过体细胞核移植和胚胎移植后,获得10只FAH-/-胎儿。以FAH-31为供体细胞,通过体细胞核移植并经胚胎移植后,获得了10只FAH-/-的胎儿。经基因型鉴定,确定所有出生胎儿均与FAH-31细胞系的基因型一致。（3）采用Western Blot技术,确定FAH蛋白已完全敲除。（4）采用免疫组化和H&E染色技术,检测出生小猪的肝脏和肾脏表型。结果表明,FAH-/-猪的肝组织呈现弥漫性肝损伤,肝细胞出现坏死,细胞质膨胀变大,核巨大并且显着核仁。而FAH-/-猪的肾脏具有局灶性急性肾盂炎,肾小管扩张和肾小管上皮损伤等,野生型的肾脏结构正常（5）通过外周血的血常规检测,FAH-/-猪血液中ALP、ALT、AST、TBA等含量明显高于野生型猪的血液中的含量,证明FAH-/-猪的肝功能和肾脏功能异常。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第1章 引言
  •   1.1 基因编辑技术的发展
  •     1.1.1 锌指核酸酶（ZFN）
  •     1.1.2 TALEN
  •     1.1.3 归巢核酸内切酶
  •     1.1.4 CRISPR/Cas9系统
  • -/-模型动物的研究进展'>  1.2 FAH-/-模型动物的研究进展
  •     1.2.1 动物疾病模型的进展
  •     1.2.2 FAH肝损伤模型动物的研究进展
  •   1.3 本研究的目的及意义
  • 第2章 材料与方法
  •   2.1 实验动物
  •   2.2 实验材料
  •   2.3 实验主要仪器
  •   2.4 实验相关液体配方
  •   2.5 实验方法
  •     2.5.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立
  •     2.5.2 gRNA的设计
  •     2.5.3 gRNA-CRISPR/Cas9载体构建
  •     2.5.4 猪成纤维细胞的核电转及FAH缺陷单克隆细胞系的获取
  •     2.5.5 猪卵母细胞的采集及体外成熟培养
  •     2.5.6 体细胞克隆
  •     2.5.7 胚胎移植
  •     2.5.8 FAH基因敲除猪的基因型鉴定
  •     2.5.9 组织石蜡切片及HE染色
  •     2.5.10 Western Blot
  •     2.5.11 免疫组化染色
  •     2.5.12 Masson染色
  • 第3章 结果
  •   3.1 猪原代胎儿成纤维细胞的制作培养
  •   3.2 FAH基因敲除细胞系的制作
  •   3.3 体细胞克隆与胚胎移植获得怀孕母猪
  •   3.4 FAH模型克隆猪出生
  • -/-猪出现肝脏和肾脏的坏死'>  3.5 NTBC撤除后FAH-/-猪出现肝脏和肾脏的坏死
  • -/-猪出现肝纤维化'>  3.6 NTBC撤除后FAH-/-猪出现肝纤维化
  •   3.7 外周血的血常规
  • 第4章 讨论
  • 第5章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 在读期间发表的论文及研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王晶

    导师: 杨月伟,周琪

    关键词: 肝损伤,基因编辑,疾病模型

    来源: 曲阜师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 曲阜师范大学

    分类号: Q78;R-332

    总页数: 58

    文件大小: 3362K

    下载量: 51

    相关论文文献

    • [1].FAH基因敲除克隆小型猪的制备及繁育[J]. 中国比较医学杂志 2019(05)
    • [2].延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立[J]. 中国组织工程研究 2013(01)

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