吴颉[1]2002年在《磁性高分子微球固定化α-淀粉酶的研究》文中认为磁性高分子微球作为一种新型的高分子功能材料在近几十年得到了充分地发展。特别是磁性高分子微球在固定化酶领域的应用，解决了自由酶易于失活、分离困难、工业上难以应用等难题，使酶催化得以快捷、有效地用于工业大规模生产。制备催化能力强、稳定性好的磁性固定化酶，磁性高分子微球外所包聚合物是关键。我们经过查阅文献发现PF凝胶及聚乙烯醇缩丁醛对酶和蛋白质具有较高的结合能力。本文采用共沉淀法将磁性微球与PF凝胶、聚乙烯醇缩丁醛相结合，制备出磁性PF微球及磁性聚乙烯醇缩丁醛微球，并运用交联法以其作载体固定α-淀粉酶。该类微球未见文献报导。同时运用了X-射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、红外光谱(IR spectra)、振动样品磁强计、紫外光谱(UR spectra)等多种手段对其进行了表征。主要内容如下： (1)通过大量实验确定了在共沉淀法制备过程中二价铁盐和叁价铁盐的浓度、反应温度、沉淀剂浓度、体系pH值等工艺条件，发现二价铁盐和叁价铁盐的浓度是影响Fe_3O_4粒子形成的关键因素。控制n(Fe~(2+))：n(Fe~(3+))=2：1，温度：60℃，pH值＞10，反应时间为1h的条件下，所制备的磁性PF微球及磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的粒径均一，粒径范围为10～20nm，具有较高的磁响应性，TEM表明其呈微球状。 (2)研究了PF凝胶制备条件、磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的制备条件及磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球固定化牛血清白蛋白的固定条件等对磁性微球固定蛋白载量的影响。确定PF凝胶的最佳合成条件为：温度：90℃，反应时间：1h，甲醛：30.0mL，对苯二酚：11.0g，盐酸：4mL。当采用如上的制备条件时，所制得的PF凝胶具有较大的蛋白固载量。当PF添加量为2g／0.01mol，pH值等于4，固定时间为3h时，所制磁性PF微球的蛋白固载量最高。制备磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的最佳条件为：聚乙烯醇缩丁醛添加量：0.8g／0.01mol，pH：6，固定时间：3h，这时可取得最好的蛋白固定效果。由实验结果可看出，磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球具有较高的蛋白固载量，可作为优良的载体对蛋白质加以固定。 (3)研究了磁性PF微球和磁性聚乙烯醇缩丁醛微球固定化α-淀粉酶的固定条件对磁性固定化酶活性及蛋白载量的影响，确定并比较了自由酶和磁哈尔滨工程大学硕士学位论文性固定化酶的最适应用条件、稳定性等理化性质。采用吸附交联法制备磁性PF微球固定化。一淀粉酶时最佳固定条件为pH:5.n，固定温度:10℃，吸附时间:Zh，交联时间:4h，叨(戊二醛):0.05%，给酶量:15mL。磁性聚乙烯醇缩丁醛微球的活化条件为在*(戊二醛)为4%，pH值为6.97的缓冲溶液中背光振荡4h后静置过夜。固定条件如下:pH:6.07，固定温度:10℃，固定时间:3h，戊二醛质量浓度:0.025%，给酶量:巧mL。此时所制磁性固定化酶有较高的催化活性。 实验结果证明，Q一淀粉酶固定在磁性高分子微球上后，其分子结构没有改变，仍具有催化活性。比较磁性固定化Q一淀粉酶与自由酶的应用条件可知磁性固定化酶具有较高的最佳应用温度，对变性剂的抵抗能力大为提高，可以在更宽的温度范围、pH范围内发挥催化作用，并且在较长时间的贮存后，固定化酶仍具有较高的活性。此外磁性固定化Q一淀粉酶操作方便，易于与反应体系分离，可重复使用。因此，我们认为磁性PF微球与磁性聚乙烯醇缩丁醛微球是两种可用于制备固定化酶的优良载体，将Q一淀粉酶固定在磁性微球上对。一淀粉酶的工业化应用具有很大的现实意义及实用价值。
李黎, 马力, 李鹤[2]2007年在《磁性微球研究进展及其在固定化酶中的应用》文中提出磁性高分子微球是最近发展起来的一种新型功能高分子材料,它作为酶、细胞、药物等的载体被广泛地应用到了生物工程、细胞学和生物医学等领域。本文对磁性高分子微球的研究现状进行了综述,介绍了磁性微球的制备、性质,重点讨论了其用于酶的固定化研究,各种固定化酶的方法并指出了该领域今后的研究方向。
陈娜[3]2016年在《借助间隔臂进行色素配基功能化的磁性微球的制备及应用》文中指出磁性高分子微球以其粒径小,比表面积大,分散性好,具备超顺磁性,可在外加磁场下实现快速分离等特点倍受关注,被广泛应用于细胞分离、靶向给药、固定化酶、蛋白分离等诸多领域。本文研究了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球(PMMA)的制备、修饰及应用,主要包括以下几个部分。(1)采用悬浮聚合法,以油酸修饰的Fe3O4为磁核,甲基丙烯酸甲酯(MMA)为单体,成功制备了粒径分布在10-25μm之间、单分散性良好的PMMA磁性微球。然后通过水解微球表面的酯基,使其表面携带丰富的羧基基团。(2)将多种间隔臂链乙二胺(EDA)、聚乙二醇400(PEG 400)、聚乙烯醇(PVA)接枝到羧基化的PMMA磁性微球表面,然后将色素配基汽巴蓝Cibacron Blue-F3GA(CB)分子修饰在微球的间隔臂链上,制得了叁种汽巴蓝功能化的聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球(CB-EDA-PMMA、CB-PVA-PMMA、CB-PEG 400-PMMA)。(3)以CB功能化磁性微球为载体,亲和吸附固定化牛血清白蛋白(BSA),考察了吸附固定化过程中各种因素对固定化率的影响,结果显示,微球表面CB修饰密度、初始BSA浓度、pH值、离子强度对微球吸附BSA有显着影响;在吸附-解吸附实验中,该CB功能化磁性微球表现出良好的重复使用性。(4)在此基础上进一步研究了CB功能化磁性微球对脂肪酶Candida rugosa lipase(CRL)的固定化效果。考查了载体表面CB修饰密度对固定化酶活性的影响,发现酶比活随着载体表面CB修饰密度的增加而逐渐降低。进而,实验优化了脂肪酶的固定化条件,即在给酶量为3 mg/g微球,pH=7.0的条件下,固定化酶的比活和活性回收率最高。最后还研究了脂肪酶的最适温度和pH稳定性,发现固定化酶的最适温度范围和pH耐受性均比游离酶显着提高。
李一鸣[4]2017年在《游离酶固定化及其水解污泥效果研究》文中认为随着城市化进程的发展和人民生活水平的不断提高,对水的需求量也一直呈加速上升趋势,污水处理厂的工作负荷越来越大,产生的剩余污泥也越来越多。剩余污泥的含水率很高,因此污泥脱水是处理污泥中的一道重要环节。降低污泥中的EPS含量,破坏其絮体结构,释放其中的有机质和水分,将对提高污泥的脱水性能起到积极的作用。固定化酶具有易回收、易储藏、可降低成本等优势,但游离酶的活性很容易受到反应体系中的p H、温度、离子浓度等因素的影响,可能会使部分游离酶失活,导致固定化酶酶活降低。目前主流的酶固定化载体有氧化石墨烯、壳聚糖、高分子聚合物,凝胶载体,多孔活性炭,纳米金刚石、介孔氧化硅以及玻璃珠等。但是这些载体在回收上存在困难,需要通过离心、沉降等复杂操作。因此,本研究中选用磁性材料作为载体,增强固定化酶的可回收性。但直接使用磁性Fe3O4细颗粒很难实现对生物分子高效稳定的固定。故还需要在磁性颗粒表面包覆纤维素,这样一方面改善了细颗粒的分散性和相容性;另一方面改变了细颗粒的表面活性,增加了可供交联的活性基团。本课题选用纤维素基磁性纳米颗粒作为载体,以戊二醛作为交联剂,利用醛基与蛋白质中的氨基能够通过耦合实现稳定交联,制作可磁力回收的固定碱性蛋白酶和α-淀粉酶酶,实现酶的回收,降低酶水解污泥的生产成本。通过考察固定化酶在不同条件下的酶活性和酶固载率来考察fe3o4的固载效果。之后通过比较污泥水解前后的cod、nh4+-n、还原糖、vss、tss等多项指标来考察其水解污泥的实际效果。具体研究内容如下:(1)使用水热合成法制备微米级的磁性fe3o4颗粒,并在其表面包覆纤维素以增加可交联的活性基团。将制备好的磁性颗粒作为固载酶的载体。通过vsm、sem、xrd等方法,对磁性fe3o4颗粒进行表征。结果表明所制备的fe3o4为粒径在0.8-4μm之间,球形圆滑,具有超顺磁性的磁性细颗粒。(2)以磁性颗粒为载体,用戊二醛交联法分别制备固定化碱性蛋白酶和固定化淀粉酶。结果表明在温度为25℃,ph值为8,酶用量为600μl,戊二醛浓度为2%,交联时间4h,吸附时间1h,固定化碱性蛋白酶和淀粉酶拥有最佳的酶活68.71%和67.51%。(3)将在最佳条件下制备的固定化酶用于催化水解剩余污泥。通过检测scod/tcod、vss去除率、氨氮浓度变化和还原性糖浓度变化等指标,研究固定化酶对污泥的催化水解效果。结果在使用碱性蛋白酶催化水解后,scod/tcod比值上升了19.1%,vss去除率为27.4%,还原性糖浓度上升了26.7mg·g-1,氨氮浓度上升了58.4 mg·L~(-1);在使用碱性蛋白酶催化水解后SCOD/TCOD比值上升了25.4%,VSS去除率为35.3%,还原性糖浓度上升了37.3mg·L~(-1),氨氮浓度上升了60.2 mg·L~(-1)。
牛海滨[5]2009年在《硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定及其酶固定化方法的研究》文中指出硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfate lyase, ChSase)具有多种药用价值,尤其在制备低分子量硫酸软骨素方面有着广阔的应用前景。本论文对ChSase产生菌的筛选、菌株的鉴定及其产酶特性、酶学性质与酶的固定化方法做了系统的研究。利用快速平板筛选法从鲤鱼鱼肠标本中筛选出一株产ChSase活性较高的菌株N235,通过形态学观察和生理生化试验,以及对该菌株16srRNA基因序列的分析,将菌株N235归属为温和气单胞菌；对ChSase的表达方式和菌株产酶特性的研究表明,ChSase为胞外酶,菌株N235在30℃发酵36h时产ChSase活性达到最高；采用硫酸铵沉淀法制备了粗酶液,并考察了ChSase的酶学性质。利用制备的粗酶液为原料,分别使用明胶和海藻酸钠、大孔树脂、磁性PF微球为载体,进行ChSase固定化方法的研究。结果表明：(1)明胶和海藻酸钠协同包埋固定化ChSase的优化条件是：明胶浓度10%,海藻酸钠浓度2%,氯化钙浓度4%,加酶量1U／ml体系,交联剂戊二醛浓度0.05%-0.07%,交联时间10min；利用此条件获得的固定化酶的酶学性质为：最适温度45℃,最适pH 7.5,表观米氏常数7.06×10-2g/L,具有一定的操作稳定性。(2)大孔树脂吸附固定化ChSase的优化条件是：吸附温度15℃,吸附时间6 h,吸附pH7.0,加酶量150U／g树脂,交联剂戊二醛浓度0.01%,交联时间3h,交联温度4℃；利用此条件获得的固定化酶的酶学性质为：最适温度40℃-50℃,最适pH 7.0,表观米氏常数1.46×10-1 g/L,具有较好的操作稳定性。(3)磁性PF微球固定化ChSase的优化条件是：对苯二酚8.2g,甲醛15ml,盐酸2ml制备PF凝胶；PF凝胶1.5g制备磁性PF微球；固定温度20℃、固定时间8h、加酶量67.3U／g磁性PF微球制备固定化酶；利用此条件制备的固定化酶的酶学性质为：最适温度50℃,最适pH 8.0,表观米氏常数5.23×10-1g/L,具有良好的操作稳定性。
鹿波[6]2007年在《固定化酶的制备与酪蛋白合成类蛋白的研究》文中研究表明固定化酶可以提高酶的稳定性并增加酶的使用次数，以及容易与产物和底物分离等优点而被广泛深入的研究。但目前常用的固定化方法在制备固定化酶时酶活损失较大，且载体常常不可重复使用或载体的再生操作复杂，限制了固定化酶的产业化应用。本文针对目前固定化酶方法的不足之处提出了相应对策并对新的酶固定化方法和载体进行了探索。本文选用Alcalase碱性内切酶和胰蛋白酶作为固定化对象，它们是一种来源广泛的蛋白酶，在食品、轻纺、医学等领域有着广泛的应用。研究了磁性Fe_3O_4纳米粒子、活性炭及Fe_3O_4／活性炭复合粒子作为载体，采用吸附法制备固定化酶。叁种载体吸附酶活力比较：C＞Fe_3O_4／C＞Fe_3O_4，沉降速度恰好相反。以纳米Fe_3O_4纳米粒子和活性炭粒子为原料，用化学表面修饰技术使Fe_3O_4粒子和炭粒子表面功能化，将乙二氨基以共价键方式偶联在Fe_3O_4粒子和炭粒子的表面，制备出纳米高分子络合剂。以此络合剂作为载体制备固定化酶。试验确定这两种载体固定化Alcalase碱性内切酶和胰蛋白酶的固定化条件和固定化酶的性质。采用液相沉淀法在磁性Fe_3O_4纳米粒子的表面包覆了一层SiO2膜，制备磁性较强的纳米Fe_3O_4／SiO_2复合粒子，作用此载体制备固定化酶。通过试验确定这两种载体固定化Alcalase碱性内切酶和胰蛋白酶的固定化条件。采用正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-氨丙基叁乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，这种颗粒大小均匀，氨基含量和颗粒大小可控。此颗粒经戊二醛处理后，采用共价法固定Alcalase碱性内切酶和胰蛋白酶。固定化酶热稳定性，pH耐受性，贮存稳定性都明显高于游离酶，表明此颗粒可作为一种优良的酶固定化载体。但是重复使用性不高，而且不易分离。研究了Alcalase碱性内切酶和胰蛋白酶对酪蛋白的水解效果，采用叁因素二次正交回归设计，对水解反应中pH、温度(T)、酶-底物浓度比([E]／[S])、叁个因素对水解度的影响，建立了回归模型。通过F检验，T检验和应用验证，说明通过二次旋转正交回归设计建立的模型，不仅较好地反映了蛋白水解反应体系运行的真实规律，而且与实际情况吻合较好。Alcalase碱性内切酶水解酪蛋白时，叁个因素对水解度的因子贡献率是：T＞pH＞[E]／[S]，其最优水解条件为：[E]／[S]=2.5％、pH=9.5、T=50℃。胰蛋白酶水解酪蛋白时，叁个因素对水解度的因子贡献率是：T＞pH＞[E]／[S]，其最优水解条件为：[E]／[S]=0.4％、pH=8.3、T=45℃。研究了类蛋白反应中pH、温度(T)、酶-底物浓度比([E]／[S])、底物浓度四个因素对合成率的影响，通过正交试验和级差分析可知：影响Alcalase内切酶催化合成类蛋白的产率的主次关系为：pH＞给酶量(酶与底物比)＞温度＞底物浓度。确定类蛋白合成的最佳工艺条件为：pH=5、[E]／[S]：2％、温度为40℃、底物浓度为40％，类蛋白合成率为71.4％。影响胰蛋白酶催化合成类蛋白的产率的主次关系为：pH＞给酶量(酶与底物比)＞温度＞底物浓度。确定类蛋白合成的最佳工艺条件为：浓度40％、温度40℃、pH值=5、[E]／[S]=0.5％，类蛋白合成率为64.37％。对类蛋白的起泡性与泡沫稳定性、乳化性与乳化稳定性进行了研究，并就几种因素对类蛋白物质的功能特性的影响进行了讨论，从结果可以看出，类蛋白物质的功能特性都有了一定程度的改善。
贾鹏翔, 刘雪莹, 刘京龙, 焦利敏, 汤克勇[7]2004年在《固定化酶及其在化工等领域中的应用》文中研究说明简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术)及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,展望了固定化酶技术在皮革行业中的研究与应用前景。对于皮革工业的酶技术具有一定的借鉴意义和参考价值。
吕洋[8]2014年在《磁性固定化α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的控制与应用》文中认为磁性微球作为一种新型复合材料,具有表面可设计性、靶向性、可重复回收利用等优点,近年来被广泛应用于学术研究中。通过将磁性微球与戊二醛的结合,可以连接到靶向性药物上,从而使其功能得到显着的发挥。本课题是以玉米淀粉为初始原料,通过在淀粉酶的作用下发生酶解反应,从而得到多孔淀粉微球。实验中,通过对酶解的条件进行优化,发现多孔淀粉形成的最佳条件是在温度50℃、pH为3.5、酶的添加量为1mL/20g、酶解时间在24小时左右。利用共沉淀法,将Fe2+、Fe3+的混合溶液在弱碱的作用下,制得具备磁性的颗粒Fe3O4,进而将Fe3O4与多孔淀粉混合,利用多次离心震荡,将其注入到多孔淀粉微球的毛细孔中,从而使该淀粉微球具有磁响应性,多次洗涤后,得到所需的磁性微球。以磁性多孔淀粉微球作为载体,通过共价结合法,将α-乙酰乳酸脱羧酶固定在载体表面,从而得到固定化ALDC。通过进一步研究,发现在酶加量为lOmL/g、戊二醛加量为总体积1%时,酶固定化效果最佳,固定化ALDC的蛋白载量为65.59 mg·g-1,比活为745.39 U/mg-1,回收率为40.85%。此外,发现固定化ALDC在25℃、pH 6.0环境中,酶的活性最高,并具有一定的热稳定性和pH稳定性。本课题不仅仅局限于α-乙酰乳酸脱羧酶这一种功能酶的单一研究,而是在实验中印证磁性微球在当代自然科学领域所体现的价值。相信随着科技的进步,磁性微球必将在各个领域发挥其独特的作用,也会为了今后的工业化生产提供理论依据。
王卫[9]2005年在《磁敏性羟基微球的构建及在固定青霉素酰化酶中的应用》文中研究指明固定化酶可以提高酶的稳定性并增加酶的使用次数,以及易与产物和底物分离等优点而被广泛深入的研究。但目前常用的固定化方法在制备固定化酶时酶活损失较大,限制了固定化酶的产业化应用。本文针对目前固定化酶方法的不足之处提出了相应解决方法,并通过对用于固定酶的磁敏性载体及固定化过程进行了深入细致研究,取得有益的成果。 本文采用悬浮聚合法合成了一系列以磁性Fe_3O_4为核心的甲基丙烯酸羟乙酯-苯乙烯共聚球状磁性微球,经环氧氯丙烷活化,制备活化度达到1600μmol/g,粒径为120～200μm的微球。通过对不同交联度的活化微球进行固定化青霉素酰化酶实验,发现交联度30%的微球固定化酶效果最优,并进一步对固定化青霉素酰化酶的条件进行了研究,得到了较好的固定化参数:给酶量为2000U/g(干载体),反应时间为24h,反应温度35℃,pH为8.0。在此条件下进行酶固定化,固定化酶活性为782.2U/g(干载体),固定化效率88.72%,活性回收率为33.63%;水解青霉素G钾盐的最适温度为45℃,最适PH为8.5;固定化酶的储存和操作稳定性良好。除此之外,测定了酶促反应的动力学常数:溶液酶和固定化酶的米氏常数,分别为1.188×10~(-5)mol/L和5.879×10~(-4)mol/L,苯乙酸的竞争性抑制常数为2.685×10~(-4)mol/L。应用苯乙酸作为酶定向化固定试剂,使酶固定化过程中活性回收比同等条件下不加苯乙酸的提高8.35%。 通过研究,最终获得了一种磁敏性、高性能的青霉素酰化酶载体和应用酶竞争性抑制剂作为酶定向化固定的方法,不仅有一定的理论意义,而且拥有巨大的经济价值,降低固定化青霉素酰化酶的生产成本将大力促进我国β-内酰胺类抗生素的产业发展。
顾旭炯[10]2006年在《双酶体系的共固定化及其动力学研究》文中指出本文选取工业上较为常用、价格低廉的硅藻土和海藻酸钙为载体分别用吸附法和包埋法共固定化α-淀粉酶和糖化酶双酶体系。其方法简单，操作简便，成本低廉，更适合工业化大生产。 本文研究了双酶比例和固定化条件对两种共固定化酶反应速率的影响。得到硅藻土共固定化双酶体系的最佳共固定化条件为：载体(g)∶糖化酶(U)∶α-淀粉酶(U)=1∶100∶160；温度为5℃-15℃；pH为4.5-5.5。海藻酸钙共固定化双酶体系的最佳共固定化条件为：海藻酸钠浓度为3％-4％，CaCl_2浓度为2％；酶浓度为糖化酶20U／ml，α-淀粉酶24U／ml；糖化酶(U)∶α-淀粉酶(U)=1∶1.2；温度为50℃-70℃；pH为4.0-5.5。并比较了两种共固定化酶的热稳定性、pH稳定性、储藏稳定性和操作稳定性，得出两种共固定化酶的最适反应温度分别为50℃-60℃(硅藻土)和55℃-65℃(海藻酸钙)；最适反应pH均为5.0；其米氏常数K_m为16.830mg／ml(硅藻土)和10.467mg／ml(海藻酸钙)。 而共固定化酶的动力学研究以硅藻土共固定化酶为研究对象，是建立在游离双酶协同水解淀粉动力学和固定化酶在受产物抑制时的动力学基础上，并提出了共固定化酶的动力学模型：协同作用阶段α-淀粉酶的水解作用存在外扩散阻力和内扩散阻力，而糖化酶仅受到内扩散阻力；协同作用结束后糖化酶的水解反应同时受到外扩散阻力和内
参考文献：
[1]. 磁性高分子微球固定化α-淀粉酶的研究[D]. 吴颉. 哈尔滨工程大学. 2002
[2]. 磁性微球研究进展及其在固定化酶中的应用[J]. 李黎, 马力, 李鹤. 现代食品科技. 2007
[3]. 借助间隔臂进行色素配基功能化的磁性微球的制备及应用[D]. 陈娜. 河北大学. 2016
[4]. 游离酶固定化及其水解污泥效果研究[D]. 李一鸣. 东华大学. 2017
[5]. 硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定及其酶固定化方法的研究[D]. 牛海滨. 沈阳药科大学. 2009
[6]. 固定化酶的制备与酪蛋白合成类蛋白的研究[D]. 鹿波. 东北农业大学. 2007
[7]. 固定化酶及其在化工等领域中的应用[J]. 贾鹏翔, 刘雪莹, 刘京龙, 焦利敏, 汤克勇. 皮革科学与工程. 2004
[8]. 磁性固定化α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的控制与应用[D]. 吕洋. 大连工业大学. 2014
[9]. 磁敏性羟基微球的构建及在固定青霉素酰化酶中的应用[D]. 王卫. 湖南师范大学. 2005
[10]. 双酶体系的共固定化及其动力学研究[D]. 顾旭炯. 浙江工业大学. 2006