胡勇(苏州工业园区娄葑医院内科江苏苏州215007)
【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）33-0112-02
维甲酸具有诱导k562细胞向粒细胞系分化的作用。1986年,Huang等[1]首次报道用全反式维甲酸（ATRA）诱导治疗急性早幼粒细胞白血病(APL),缓解率明显升高，揭开了ATRA诱导肿瘤细胞分化的序幕。维甲酸是维生素Ａ的自然衍生物，同时也是维生素Ａ的生物活性形式，它可以通过诱导细胞分化而治疗恶性肿瘤。全反式维甲酸（ATRA）、9顺式维甲酸(9ｃRA)、13顺式维甲酸(13ｃRA)等对细胞的作用主要通过核内维甲酸受体(RARS)和视黄醇Ｘ受体(RXRS)起作用[2]。
O-聚糖在肿瘤细胞中其结构会发生异常，而且与癌细胞的表型及生物学特性密切相关，研究它们在肿瘤细胞中的变化情况可揭示糖基化和肿瘤的发生、发展之间的内在联系。多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶（ppGalNAcTs）（EC2.4.1.4）催化O-聚糖合成的第一步[2]，将UDPGalNAc上的GalNAc基因转移至蛋白质多肽链上特定序列中的Thr和Ser的羟基上而合成GalNAcα-O-Ser/Thr多肽。该酶在1976年首次由Mcgarie和Roseman在绵羊的颌下腺中发现，90年代后，已有多种ppGalNAc-T分别在富有粘蛋白的组织中提纯和克隆。现已知ppGalNAc-Ts是一个大家族，以被克隆的先后为序，目前已有14种（T1-T14）ppGalNAc-T问世[345]。
根据报道，在肿瘤细胞诱导分化中，其表面的糖链和糖脂会发生改变，从而导致糖基转移酶改变。但是这些主要集中在N-糖基化。对于催化O-聚糖合成的ppGalNAcTs在肿瘤的诱导分化中的作用研究甚少。
1材料和方法
1.1试剂全反式维甲酸（Sigma）；SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)；Rnase-FreeDnase(Promega)；ABI7000荧光PCR定量分析仪(AppliedBiosystems)。
1.2细胞来源
A549购自上海细胞研究所
1.3细胞培养A549细胞株用含10%小牛血清的1640培养基,置37℃、5%CO2培养箱内培养，生长至对数生长期时进行细胞分组。
1.4细胞分组将细胞分成4组，
第一组，对照组，加等体积的培养基；
第二组，10-8mol/L的全反式维甲酸；
第三组，10-7mol/L的全反式维甲酸；
第四组，10-6mol/L的全反式维甲酸；
1.5细胞收集细胞加药后继续培养72小时，两天换液一次，然后收集细胞，PBS洗两次。
1.6引物设计采用ABI7000荧光PCR定量分析仪专用软件合成。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。（如下表）
糖基转移酶和β-actin荧光定量PCR引物序列
目的基因名称引物序列扩增cDNA
长度
PpGalNAcT2F：5′-CGGAGCGCCCCTCTTC-3′66bp
R：5′-TTGTCGCTGGGTGTCACTCA-3′
PpGalNAcT3F：5′-TGCTTTCGCAAGTGACAGGAT-3′70bp
R：5′-CAATACATTCAGGAGGTCGAGTGT-3′
PpGalNAcT4F：5′-TTTGTCTCGACCGCTTTATAAGAA-3′62bp
R：5′-TTCCCCCACTCCCCAAGT-3′
β-actinF：5′-TCCACCTTCCAGCAGATGTG-3′75bp
R：5′-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’
1.7实时定量PCR细胞ppGalNAcTs表达的变化采用实时PCR法（按说明书）
由ABI7000荧光PCR定量分析仪专用软件SDS软件，分别获得样本基因和参照基因CT的平均值，即均值CT，用处理组样本基因的均值CT减去处理组参照基因的均值CT，得到ΔCT（1），即ΔCT（1）=处理组样本基因均值CT－处理组参照基因的均值CT。同样，用对照组样本基因的均值CT减去对照组参照基因的均值CT，得到ΔCT（2），即ΔCT（2）=对照组样本基因均值CT－对照组参照基因的均值CT，然后用ΔCT（1）－ΔCT（2），得到ΔΔCT，即ΔΔCT=ΔCT（1）－ΔCT（2），最终，处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式2－ΔΔCT计算得到。
2结果
1.ATRA对A549糖基转移酶的影响经过全反式维甲酸作用后，A549细胞中ppGalNAcT2表达量，在10-7比10-8药物浓度时没有明显的上升，但在10-６药物浓度时ppGalNAcT2表达量比对照组上升了约7倍。pp-GalNAcT4的表达量在全反式维甲酸作用前后没有显著的变化，这种糖基转移酶对全反式维甲酸不敏感。(图1)
Table1D:A549细胞株ppGalNAcT2基因
RealtimeRT-PCR扩增结果
各加药组T2CTβ-actinCTΔCT（Avg.
T2-Avg.
β-actinCT）ΔΔCT(Avg.
ΔCT－Avg.
ΔCT未加药组)2－ΔΔCT
对照组28.47±0.2513.22±0.0515.25
10-8mol/L
药物组21.60±0.1412.19±0.109.41－5.8457.28
10-7mol/L
药物组22.07±0.3812.76±0.179.31－5.9461.39
10-6mol/L
药物组20.93±0.2212.50±0.128.43－6.82112.99
Table1E:A549细胞株ppGalNAcT3基因
RealtimeRT-PCR扩增结果
各加药组T3CTβ-actinCTΔCT（Avg.
T3－Avg.
β-actinCT)ΔΔCT(Avg.
ΔCT－Avg.
ΔCT未加药组)2－ΔΔCT
对照组30.76±0.2913.22±0.0517.54
10-8mol/L
药物组29.68±0.2412.19±0.1017.49－0.051.04
10-7mol/L
药物组30.70±0.2412.76±0.1717.940.40.76
10-6mol/L
药物组31.71±0.3312.50±0.1219.211.670.31
Table1FA549:细胞株ppGalNAcT4基因
RealtimeRT-PCR扩增结果
各加药组T4CTβ-actinCTΔCT（Avg.
T4－Avg.
β-actinCT)ΔΔCT(Avg.
ΔCT－Avg.
ΔCT未加药组)2－ΔΔCT
对照组30.22±0.1413.22±0.0517.00
10-8mol/L
药物组27.51±0.2912.19±0.1015.32－1.683.20
10-7mol/L
药物组27.51±0.4112.76±0.1714.75－2.254.76
10-6mol/L
药物组27.38±0.3112.50±0.1214.88－2.124.35
Table1:AlterationofacetyigiucosaminytransferaseexpressionsinA549cellsafterthetreatmentofSTRAwithvariousconcentration.
A:realtime-PCRprofileofandpp-GalNAcT2,-T4,
B:quantificationoftheresultsinA.
1:Cellstreatedwith10-8mol/LSTRA;2:Cellstreatedwith10-7mol/LSTRA;3:Cellstreatedwith10-6mol/LSTRA;
3讨论
在全反式维甲酸作用后，不同的糖基转移酶的表达量有完全不同的改变。结果显示，T2、T3、T4，对全反式维甲酸的反应方式完全不同，这些表明T2、T3、T4的调节机制不同。如在全反式维甲酸作用A549后，T2升高也较明显，而T3，T4在任何剂量的全反式维甲酸作用下改变均不明显，不同于其他糖基转移酶，引起这种现象的机制如何，目前还不清楚，有待于进一步研究。在全反式维甲酸的诱导下，不同的糖基转移酶表达变化不同，说明不同的糖基转移酶对全反式维甲酸的反应机制不同。
pp-GalNAc-T1和T2在大多数人类组织中广泛分布。然而，pp-GalNAc-T3发现主要存在于人类的睾丸、肾、消化道以及生殖系统。pp-GalNAc-T4主要高表达于胃及结肠，低表达于小肠、泌尿生殖器官和肺[6]。目前，只有T1和T2被报道在正常白细胞中表达，T3、T4、T5、T7未见报道在正常白细胞中表达[7，8，9]。因此，后面的四种亚型pp-GalNAc-Ts可能只有在白血病细胞株中表达。
pp-GalNAc-T1、T2、T3对含有苏氨酸和/或丝氨酸的多肽有较宽的底物谱，他们对多肽底物的选择有不同，但是也有部分是重叠的。多肽的糖基化作用，依赖于粘蛋白（MUC1）上的串联的重复的电势位点，即GalNAc上的三个酶连接的位点。然而，这三个pp-GalNAc-Ts对多肽的反应，在MUC1上有不同的位点[10]。当串联重复的MUC1多肽作为底物时，它会被T1、T2、T3的重组子广泛糖基化。最多为6、8及11GalNAc合成一体，被T1、T2、T3各自糖基化，并且只有T3能完全糖基化在连续的序列包括3个及5个苏氨酸残基在MUC2串联重复单元中[11]。这个结果提示：在合成集簇糖类抗原时，只有T3能O-GalNAc糖基化集簇苏氨酸。pp-GalNAc-T4能在T1、T2、T3催化后进一步糖基化粘蛋白（MUC1）中剩余的苏/丝氨酸残基，表明pp-GalNAc-T4可补充其他pp-GalNAc-Ts完成后的MUC1串联重复O-糖基化作用。换句话说，pp-GalNAc-T4不同于pp-GalNAc-T1、T2、T3，可以利用已经GalNAc糖基化的肽链作为其底物，但是pp-GalNAc-T4也可以催化未糖基化的多肽[8]。相反，pp-GalNAc-T7没有严格的底物特异性。pp-GalNAc-T7对于部分的GalNAc糖基化受体底物有明显的排他特异性，并且对于没有糖基化的多肽，pp-GalNAc-T7没有活性。pp-GalNAc-T7被认为是O-糖基化起始步骤中的随动装置的酶[9]。从上面的讨论中，我们可以知道，糖基化作用在全反式维甲酸作用后，在A549细胞中表达是升高的。
参考文献
[1]HuangME,YeYc,ChenSR,etal.Useofall-transretinoicacidinthetreatmentofacutepromyelocyticLeukemia[J].Blood,1988,72(2):267.
[2]GudasLJ,Retinoids,retinoic-responsivegenes,celldifferentiationandCancer[J].CellGrowthDiff,1992,3(9):655.
[3]CollinsSJ.TerminaldifferentiationofhumanpromyelocytieLeukemiacellsinducedbydimethyisulfoxideandotherpolarcompounds[J].ProcNatlAcadSciUSA,1978,75(5):2458.
[4]BrockhausenI.PathwayofO-glycanbiosynthesisincancercells.BiochimBiophysActa.1999,1473:67-95.
[5]McGuireEJ,RosemanS.Enzymaticsynthesisoftheprotein-hexaminelinkageinsheepsubmaxillarymucin.JBiolChem1967;242:3745-3747.
[6]DongS,ChenSJ,TweardyDJ.Cross-talkbetweenretinoicacidandSTAT3signalingpathwaysinacutepromyelocyticleukemia[J].Lymphoma,2003,44(12):2023.
[7]BennettEP,HassanH,ClausenH.CDNAcloningandexoressionofanovelhumanUDP-N-acetyl--D-galactosamine:polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferase.JBiolChem.1996;271:17006-17012.---T3.
[8]BennettPC,HassanH,MandelU,MirgorodskayaE,RoepstorffP,BurchellJM,Taylor-PapadimitriouJ,HollingsworthMA,MerkxG,vanKesselAG,EibergH,SteffensenR,ClausenH.CloningofahumanUDP-N-acetyl--D-galactosamine:polypeptideN-acetylgalactosaminyl-transferasethatcomplementsotherGalNAc-transferasesincompleteO-glycosylationoftheMUC1tandemrepeat.JBiolChem1998;273:30472-30481.---T4.
[9]BennettEP,HassanH,HollingworthMA,ClausonH.AnovelhumanUDP-N-acetyl-D-galactosamine:polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferase,GalNAc-T7,withspecificallyforpartialGalNAc-glycosylatedacceptorsubstrates.FEBSLetter1999;460:226-230.---T7.
[10]王志杰。维甲酸化学预防肺癌的研究进展[J]。国外医学肿瘤学分册，1998，25（2）：106.
[11]HoughtonJ,FoxJG.Gastriccancer:laboratorybenchtoclinic[J].JGastroenterol.Hepatol,2002,17(4):495.