曾麒燕[1]2004年在《Ⅰ型磷酸酶的新型抑制亚基(IPP-2)的抗肿瘤作用及机制研究》文中研究指明我们利用cDNA文库大规模测序和EST同源比较的方法,从正常人骨髓基质细胞中分离到一种新型全长基因,全长为1 637 bp,含348 bp编码区,编码116个氨基酸,同源性比较提示属于Ⅰ型磷酸酶的抑制亚基IPP-1(inhibitor of protein phosphatase 1)家族,因此将该新基因命名为IPP-2。首先,我们构建了人野生型IPP2(wt)和突变活化型IPP2真核表达载体(shI-1)。其次将野生型、活化
曾麒燕[2]2004年在《Ⅰ型磷酸酶的新型抑制亚基（IPP2）的抗肿瘤作用及其机制研究》文中研究指明蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着重要生命活动的所有过程，包括细胞增殖、分化、发育、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生，而且蛋白磷酸化也是胞浆内信息和核内信息调控的必经环节。过去对蛋白质可逆性磷酸化的研究主要集中在蛋白激酶(protrin kinase，PK)的调控方面。现在认为蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP)和PK一样受到严密调控，同样起重要的作用。 Ⅰ型蛋白磷酸酶(PP1)，通过去磷酸化蛋白调节机体代谢、细胞分化以及信号转导等。它由催化亚基和调节亚基组成，后者决定磷酸酶的底物特异性，活性以及亚细胞定位。目前已发现多个PP1的抑制蛋白，其中Ⅰ型磷酸酶抑制因子(IPP1)是第一个发现调节蛋白磷酸酶活性的内源性分子，它特异性抑制Ⅰ型磷酸酶活性，在骨骼肌、脑、脂肪组织、肾脏等高表达。蛋白激酶A(PKA)磷酸化IPP1的35位苏氨酸，为IPP1发挥其抑制磷酸酶的功能所必须，引起广泛的细胞应答如影响细胞周期、基因表达、糖代谢以及脂类代谢、突触可塑性等。可见，IPP把蛋白激酶和蛋白磷酸酶连接起来，调节细胞的信号转导。 免疫组化表明在肝癌细胞、恶性成骨瘤和软组织瘤，骨肉瘤、恶性皮肤纤维瘤、脂肪肉瘤中，PP1表达上调，PP1活性也随之升高，表明PP1的过表达可加速恶性肿瘤的生长。而用PP1的抑制剂冈田酸和花萼海绵诱癌素A可增强TNF诱导的凋亡并引起PP1、PP2A羧基末端修饰如去甲基化；周期肽nodularin和微囊藻素LR可诱导人乳腺癌细胞MEF—7以caspase-3依赖的方式凋亡。PP1与细胞周期的关系较为密切：在G1期和S期，PP1存在于胞浆；在G2期则部分向核内聚集；在M期与染色体紧密结合并能促进有丝分裂的完成。PP1基因的突变、反义寡核苷酸或PP1的抑制剂可通过影响纺锤体组装，诱导有丝分裂停滞而延迟有丝分裂进程；或使染色体过度凝集导致姊妹染色体分离异常最终导致多倍体生成而抑制细胞生长。表明PP1、PP2A可维持正常的有丝分裂。第二军医大学博士学位论文中文摘要 我们利用cDNA文库大规模测序和EST同源比较的方法，从正常人骨髓基质细胞中分离到一种新型全长基因，全长为1637bp，含348bp编码区，编码116个氨基酸，与其他分子的同源性比较，提示其可能属于I型磷酸酶的抑制亚基Ippl(inhibitor of protein pho印hatasel)家族，尤其在N端功能区与人Ippl高度同源，因此将该新基因命名为IppZ(inhibitor ofprotein phosphataseZ)。 本课题以人宫颈癌细胞HeLa为实验模型，研究了IPPZ对其生长的影响，并探讨其相关作用机制。具体包括:l)筛选稳定表达IPPZ的野生型和持续活化型的HeLa细胞株;2)稳定表达IPPZ的野生型和持续活化型的HeLa细胞株的增殖和迁移实验;并通过荷瘤裸鼠体内实验观察其对HeLa细胞生长的体内抑制作用3)FACS分析其细胞周期的变化;4)利用W七stem blot和免疫共沉淀等方法分析其细胞周期调控蛋白的变化5)进一步探讨了相关的信号传导途径。 我们构建了人野生型IPPZ真核表达载体(IPPZ/WT)和突变活化型IPPZ真核表达载体(IPPZ/SHI一2)。该型为短片段持续活化型，编码第8一60位氨基酸，其中第40位苏氨酸突变为天冬氨酸。 为了研究IPPZ对HeLa细胞生长的影响，我们将IPPZ的野生型、活化型及对照空质粒分别转染HeLa细胞，获得稳定表达细胞株，Rl’- PCR及W七stem blot证实其基因转染成功。利用3H一TdR掺入法、软琼脂克隆形成实验和迁移实验对其生长、迁移能力进行分析，结果表明，与对照组相比，转染IPPZ活化型的HeLa细胞(HeLa一IPPZ/S Hl一2)的生长受到显着抑制，其克隆形成能力和迁移能力均显着下降。然后，观察了IPPZ在体内的抑瘤效果，将稳定转染的HeLa细胞在裸鼠体内进行了致瘤性观察，结果表明，HeLa一I即2/SHI一2和HeLa一IPPZ/WT的致瘤性明显下降，而且前者的抑瘤效果更显着。此外，应用在体电脉冲技术(i n vivoelectroporation)将真核表达质粒进行裸鼠瘤体内基因导入，结果表明，IPPZ活化型(IPPZ/SHI一2)基因治疗组的荷瘤裸鼠的生存期明显延长。表明，IPPZ对HeLa细胞的生长具有体内外抑制作用. 为了阐明IPPZ对HeLa细胞的生长抑制作用的机制，本研究对工PPZ瞬时表达和稳定表达的HeLa细胞均进行了细胞周期分析。结果表明IPPZ活化型(IPPZ/SHI一2)的瞬时表达可导致HeLa细胞GZ/M期细胞比例升高。对IPPZ稳定表达的HeLa细胞，我们首先采用血清饥饿法，分析恢复血清后的细胞周期的第二军医大学博士学位论文中文摘要进程。结果显示，在72小时内，HeLa-IPPZ/S Hl一2所经历的周期次数较其他组少，而且从总的趋势看，HeLa一IPPZ/S Hl一2的G2/M期细胞比例升高(尤其在恢复血清后的12小时内)，S期比例降低。HeLa-IPPZ/WT在72小时内的周期次数介于HeLa一IPPZ/SHI一2与对照组之间。表明IPPZ的活化型(IPPZ/SHI一2)和野生型 (IPPZ/WT)的稳定表达均可影响HeLa细胞的细胞周期进程，使细胞周期时间延长，因而可导致HeLa细胞增殖缓慢，但前者对细胞周期进程的影响更强，因而解释了在裸鼠的体内致瘤实验中IPPZ/S Hl一2的抑瘤作用更强的原因。此外由于IPPZ/SHI一2的稳定表达还可使HeLa细胞的
王晓健[3]2004年在《人骨髓基质细胞来源的新分子hPEBP4和IPP2的克隆与功能研究》文中认为骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)是造血微环境的重要组成部分，它不仅为造血干细胞的生长提供附着场所，而且还通过与造血干细胞的直接接触和分泌多种生长因子，调节和影响造血干细胞和免疫前体细胞的成熟和分化。因此，从BMSC中寻找新型免疫分子将有助于深入认识BMSC的生物学和免疫学功能，阐明其作用的分子机理，获得参与其功能有关分子的重要信息，从而从分子和基因水平上对二者独特的功能作用机制有更深入和全面的了解。本文所研究的hPEBP4就是通过对人BMSC cDNA文库进行大规模随机测序获得的新分子。 第一部分、hPEBP4的克隆和序列分析、组织细胞分布和细胞定位研究 磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)蛋白是一类能与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)结合的蛋白。该家族的所有成员都含有与PE结合的保守区域(PBP)。经大规模随机测序和同源比较，我们从人BMSC cDNA文库中分离到一个新EST(C781)，其全长cDNA为874 bp，编码227氨基酸的蛋白。该蛋白在核酸和氨基酸水平上与人磷脂酰乙醇胺结合蛋白高度同源，含有PBP保守区域。根据该家族的命名法和当时已经报道的PEBP家族序列，该全长新基因被命名为hPEBP4。hPEBP4序列已经在GenBank／EMBL数据库登录，序列号为AY037148。并申请国家发明专利，国家发明专利申请号为02136524.6。 同源比较和多肽结构分析显示，hPEBP4蛋白在75位到195位为磷脂酰乙醇胺结合保守区域。Pro97，Asp98，Pro100，His112和Arg149为PEBP家族中的保守氨基酸，涉及到决定PEBPs配体结合位点的基本结构。氨基酸残基(91-117)和(141-153)是PEBP4s亚家族中两个主要的高度保守区。氨基酸残基91-101(包括cis Pro100)组成结合区的边缘。而96-98和100残基形成的Asp-Pro-Asp-x-Pro基序为PEBP家族所有成员都含有的保守序列。Asp96和His112存在于结合口袋的底部。浙江大学.博士学位论文上篇.中文摘要146一149残基和Gly一x一His.Arg残基组成第二个高度保守区域。141一153之间的保守区域形成结合口袋另一边。hPEBP4的这些结构特征提示hPEBP4含有PE结合区域。 RT-PCR结果显示hPEBP4在B淋巴瘤NAMALW人和Daudi细胞，前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌细胞中高表达。N。找hem杂交结果显示，hPEBP4 mRNA在正常成人组织中辜丸，心脏，骨骼肌和胸腺高表达，在肺，肝，脑，脊髓，肾上腺，骨髓低表达。在正常脑组织中，我们检测的每一部分(包括杏仁核、尾状核、脐服体、海马及丘脑)均高表达hPEBP4。肺癌A549细胞和结肠腺癌LoVo细胞不表达hPEBP4，经TNFa刺激8小时后开始表达，12小时达到高峰。这提示hPEBP4在对外界刺激应答时发挥一定的作用，可能保护细胞免受不利因素的损害。同时我们构建了hPEBP4完整编码区以及PBP保守区域缺失印75 PEBP4)的C端融合荧光蛋白(GFP)的真核表达载体，并在HEK293细胞中进行了瞬时表达，进行亚细胞定位研究。Confocal显微镜分析结果显示，hPEBP4分子在正常情况下与溶酶体共定位，但经TNFa刺激后转位到细胞膜上。缺失PBP保守区域的p75PEBP4虽然也定位于溶酶体，但TNFa刺激后不转位到膜上，这与文献报道受到外界刺激时，PE结合区域(accession Ps01220)介导PEBPs转位到膜上是一致的。 为了检测hPEBP4在组织细胞中的蛋白表达，我们采用GST融合表达系统，利用原核表达载体pGEX一ZT将hPEBP4与日本血吸虫GST基因以融合形式在E.coli宿主菌中进行了化学诱导性高水平分泌表达。磷脂酞乙醇胺结合保守区域位于hPEBP4的75位到195位，为了提高抗体的特异性，避免所产生抗血清的交叉反应性，我们选择了hPEBP4与同源分子相似性最低的N端1一99个氨基酸的蛋白作为免疫家兔的抗原。所表达的可溶性融合蛋白以谷肤甘肤sePharose 4B进行了亲和层析纯化。纯化得到的融合蛋白保持了原有的抗原性，免疫家兔获得了多克隆抗血清。免疫血清以饱和硫酸馁沉淀及A蛋白亲和层析进行了纯化。经W匕ste爪印迹分析证明该免疫血清具有较好的免疫学活性和抗原优先性。利用该抗体，我们检测了hPEBP4在人类正常乳腺组织和乳腺癌组织的表达。结果提示hPEBP4在乳腺癌组织高表达，而在正常组织不表达。同时Rl’- PCR也证实了同样的结果。第二部分、hPEBP4的生物学功能研究及机制探讨浙江大学·博士学位论文上篇·中文摘要 在第一部分研究中，我们发现TNFa能诱导hPEBP4在A549细胞和LoVo细胞中表达的上调，以及从溶酶体到细胞膜的转位，因此，我们选择TNFa敏感的L929细胞，研究hPEBP4的生物学功能。hPEBP4在L929细胞中的过表达能抑制TNFa刺激和Ras过表达所引起的MEKI和ERK的活化，但不影响Raf-1活化。免疫共沉淀及体外结合试验证实了hPEBP4能与Raf-1和MEKI相互作用。共聚焦显微镜进一步证实，在TNFa刺激下，hPEBP4离开溶酶体，转位到细胞膜上，与raf-l或者MEKI发生共定位，而PBP保守区域缺失的突变体p75PEBP4，对MEKI和ERK活化没有作用，也不能与raf-1和MEK相互作用。P75PEBP4和hPEBP4都定位于溶酶体，但侧Fa
参考文献：
[1]. Ⅰ型磷酸酶的新型抑制亚基(IPP-2)的抗肿瘤作用及机制研究[C]. 曾麒燕. 第八届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集. 2004
[2]. Ⅰ型磷酸酶的新型抑制亚基（IPP2）的抗肿瘤作用及其机制研究[D]. 曾麒燕. 第二军医大学. 2004
[3]. 人骨髓基质细胞来源的新分子hPEBP4和IPP2的克隆与功能研究[D]. 王晓健. 浙江大学. 2004