番茄响应镉胁迫相关基因SlJMJ的克隆及功能验证

论文摘要

植物在生长发育过程中会受到多种非生物胁迫的威胁,其中包括重金属胁迫,重金属离子由于具有隐蔽性强,毒性大等特点,严重影响着植物的生长发育。茄科植物番茄（Solanum lycopersicum）作为重要蔬菜作物之一,主要采用设施栽培方式,生长期长、复种指数高,肥料和农药的过量施用严重,导致番茄栽培地土壤质量退化严重,重金属残留等问题日益突出。因此随着番茄需求量的增高,研究番茄响应Cd胁迫的分子机制迫在眉睫。SlJMJ是组蛋白去甲基化酶,众多学者研究参与拟南芥等植物干旱、冷害和盐胁迫的过程,但对其在植物耐受镉胁迫的响应鲜有报道。本文以番茄为试验材料,克隆SlJMJ基因,对酵母进行遗传转化和对拟南芥进行遗传转化,初步探讨该基因的功能,这对于研究组蛋白去甲基化酶JMJ在植物抗重金属方面的功能具有一定的意义,期望为进一步揭示组蛋白去甲基化酶基因在植物非生物胁迫中的作用提供一定的理论依据。获得的主要研究成果如下:1.SlJMJ基因的克隆与序列分析克隆获得番茄SlJMJ基因,序列分析结果显示,SlJMJ基因全长1254bp,编码417个氨基酸,含有包含JmjC结构域,属于JmjC domain only亚家族。2.SlJMJ基因在重金属Cd胁迫下的表达分析对番茄幼苗分别进行不同浓度重金属Cd（0、10、20、30 mmol/L）处理后进行取材,及番茄进行重金属Cd（10 mmol/L）处理后喷施EBL后0、3、6、12h取材。通过qRT-PCR分析SlJMJ基因的表达模式,结果表明,SlJMJ基因在Cd处理浓度为10 mmol/L时显著上调且Cd胁迫后喷施EBL后6 h达到最大值。3.SlJMJ基因的转录活性分析利用酵母单杂交系统,构建了重组质粒pGBKT7-SlJMJ,转入酵母菌AH109中,融合载体pGBKT7-SlJMJ能在SD/-Trp-His缺失培养基上生长,并在含有X-α-Gal的SD/-Trp-His的缺失培养基上呈现出蓝色,表明SlJMJ蛋白有转录激活活性。4.SlJMJ基因的酵母遗传转化及抗逆分析构建到酵母表达载体pYES2-SlJMJ中,转化酵母细胞,并对转基因酵母进行盐（400、500、600 mmol/L）、干旱（0.5、1、1.5 mol/L）及重金属Cd（5、15、25μmol/L）等胁迫处理,通过观察酵母生长状况发现转基因酵母对盐、干旱、Cd胁迫均表现出一定的耐受性。5.SlJMJ基因拟南芥的遗传转化构建了pBI121-SlJMJ植物过表达载体,利用农杆菌花絮侵染法对模式植物拟南芥进行遗传转化。对抗性拟南芥植株进行分子鉴定（PCR）,鉴定结果获得了拟南芥阳性苗3株,收获T2代。经重金属Cd胁迫处理,与野生型相比,OE-SlJMJ转基因拟南芥枝叶粗壮,鲜重增加,SlJMJ基因表达量显著升高。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 重金属镉的理化性质及污染来源和现状

1.2 重金属污染对植物的影响

1.3 油菜素内酯在植物重金属胁迫响应中的作用

1.4 植物组蛋白甲基化研究进展

1.4.1 组蛋白修饰

1.4.2 JMJC蛋白的分类与功能

1.5 研究的目的与意义

1.6 技术路线

第2章番茄SlJMJ基因的克隆与序列分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料与试剂

2.2.2 番茄总RNA的提取及cDNA的合成

2.2.3 引物与PCR反应体系

2.2.4 DNA片段与克隆载体的连接

2.2.5 SlJMJ基因生物信息学分析

2.3 结果与分析

2.3.1 番茄总RNA提取

2.3.2 番茄SlJMJ基因序列扩增及验证

2.3.3 SlJMJ基因序列生物信息学分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章番茄SlJMJ基因在重金属Cd胁迫下的表达模式分析

3.1 引言

3.2 .材料与方法

3.2.1 实验材料与试剂

3.2.2 番茄材料的处理

3.2.3 提取番茄总RNA及反转录cDNA

3.2.4 q RT-PCR扩增

3.3 结果与分析

3.3.1 RNA、cDNA质量检测

3.3.2 重金属Cd胁迫下番茄幼苗SlJMJ基因的表达模式分析

3.3.3 外源喷施EBL处理Cd胁迫下番茄幼苗SlJMJ基因表达模式分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章番茄SlJMJ基因的的转录活性分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料与试剂

4.2.2 番茄总RNA提取和cDNA合成

4.2.3 pGBKT7-SlJMJ融合载体的构建

4.2.4 番茄SlJMJ转录活性分析

4.3 结果与分析

4.3.1 PCR扩增全长

4.3.2 SlJMJ酵母中转录激活活性分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

第5章番茄SlJMJ基因的酵母遗传转化及抗逆分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 构建酵母表达载体p YES2-SlJMJ

5.2.3 重组酵母的逆境胁迫实验

5.2.4 重组酵母逆境胁迫下的存活率

5.3 结果与分析

5.3.1 酵母表达载体的构建

5.3.2 番茄SlJMJ转基因酵母抗逆性分析

5.3.3 番茄SlJMJ转基因酵母逆境胁迫下存活率

5.4 讨论

5.5 本章小结

第6章番茄SlJMJ基因对拟南芥的遗传转化

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料与试剂

6.2.2 植物表达载体pBI121-SlJMJ的构建

6.2.3 pBI121-SlJMJ对农杆菌的转化

6.2.4 花絮侵染法转化拟南芥

6.2.5 转基因拟南芥植株的筛选与PCR鉴定

6.2.6 重金属Cd胁迫转基因拟南芥表型分析

6.2.7 重金属Cd胁迫转基因拟南芥基因表达分析

6.3 结果与分析

6.3.1 番茄植物表达载体pBI121-SlJMJ的构建

6.3.2 pBI121-SlJMJ转化农杆菌的重组子鉴定

6.3.3 转SlJMJ基因拟南芥的筛选与鉴定

6.3.4 重金属Cd胁迫下转基因植株的表型观察

6.3.5 重金属Cd胁迫下拟南芥SlJMJ基因诱导表达

6.4 讨论

6.5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙维悦

导师: 金晓霞

关键词: 番茄,组蛋白去甲基化酶,基因,非生物胁迫,遗传转化

来源: 哈尔滨师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 哈尔滨师范大学

基金: 黑龙江省自然科学基金C2017039

分类号: Q943.2;S641.2

总页数: 72

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