KIF3A和KIF18A在优雅蝈螽精子形成中的作用分析

论文摘要

优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa Brunner von Wattenwyl隶属于直翅目Orthoptera螽斯科Tettigoniidae,俗称蝈蝈。优雅蝈螽雄性个体较大,体型粗壮,容易饲养。其精子形状似箭头,顶体复合体结构复杂,顶体复合体之下的细胞核在光学显微镜下清晰可见,是研究螽斯科昆虫精子形成的理想材料。本文首先通过基因克隆和生物信息学手段对KIF3A（kif3a）和KIF18A（kif18a）进行鉴定。其次,应用RNA干扰、实时荧光定量PCR、冰冻切片与免疫荧光、石蜡切片片与PAS染色技术分析kif3a和kif18a基因沉默后对优雅蝈螽精子形成的影响。为研究驱动蛋白在直翅目昆虫精子形成中的作用奠定基础。分析比较本实验室建立的优雅蝈螽四个转录组中驱动蛋白基因的表达量,选择KIF3A和KIF18A作为研究对象,克隆得到kif3a和kif18a基因,并进行生物信息学分析。Kif3a基因cDNA序列长3590bp,包括一个长2130bp的开放阅读框,编码709个氨基酸残基组成的多肽链。预测其多肽链的分子量为80.33KD,等电点为5.35。Kif18a基因cDNA序列长6766bp,包括一个长4674bp的开放阅读框,编码1557个氨基酸残基组成的多肽链。预测其多肽链的的分子量为171.25KD,等电点为8.62。通过不同物种的KIF3A和KIF18A氨基酸序列比对发现,它们的ATP结合位点和微管结合位点都是高度保守的。分子进化树分析结果表明,优雅蝈螽KIF3A和KIF18A在进化上比较保守。通过RNA干扰技术研究KIF3A和KIF18A对优雅蝈螽精子形成中微丝和微管蛋白的影响。与正常组相比,dskif3a和dskif18a处理组在菱形期、柱形期、精子形态构建关键期、成熟前期（精细胞变形期）都出现了变化。在菱形期,对照组中,精细胞整体形态基本呈菱形,顶体复合体中的微丝呈三个点状,中间的荧光强度最弱,两端的荧光强度较强,顶体本体开始形成,顶体本体两侧的微管荧光强度增强,可能是manchette-like结构开始形成。在dskif3a处理组中,中间的点状微丝聚集斑荧光强度增强。而在dskif18a处理组中,精细胞形态发生明显变化,顶体本体两侧没有出现较亮的微管荧光信号,顶体复合体中只有两个点状的微丝荧光信号,中间的点状结构消失,细胞核形态发生明显变化,呈半圆形。在柱形期,与对照组相比,dskif3a处理组中,顶体复合体前端变尖且微管荧光信号消失,中间一束的微丝聚集斑变弱,趋于消失,而dskif18a处理组中,顶体复合体两侧较亮的微管结构发生变化。两处理组中,细胞核的形态都未见明显的变化。在精子形态构建关键期,在对照组中可明显的看到细胞核周围由纵向排列的微管即manchette-like结构包围,在dskif3a和dskif18a处理组中,都观察到顶体复合体周围的微管及细胞核周围的微管均受到影响,类似断裂,顶端囊微管消失。在dskif3a处理组中细胞核变得不均匀,部分细胞核区域荧光强度减弱。而在dskif18a处理组中未见细胞核有明显变化。在成熟前期,与对照组相比,dskif3a处理组中,细胞核周围的微管出现了几个空泡状的小圆圈,圆圈内部的微管结构消失,尾部鞭毛断裂,细胞核的形态未发生明显变化。在dskif18a处理组中,细胞核周围的微管及微丝也出现部分消失的情况,细胞核膨大,发生明显的形态变化。在两处理组的PAS染色中,细胞核变得不均匀,能明显的观察到内部的颗粒状物质。综合本实验研究结果,得出如下结论:1.本文鉴定和分析了kif3a和kif18a基因。荧光定量结果表明,kif3a和kif18a基因在优雅蝈螽雄性成虫精巢组织中表达量最高。2.分别注射dskif3a和dskif18a后,kif3a mRNA和kif18a mRNA均在第四天时表达量最低,即干扰时间为96h时,干扰效果最为显著。3.RNAi后,优雅蝈螽精子发育紊乱,微管结构出现明显变化。推测驱动蛋白KIF3A和KIF18A在优雅蝈螽精子形成中可能具有捆绑微管的作用。

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摘要

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第1章引言

1.1 优雅蝈螽生物学特征概述

1.1.1 优雅蝈螽生物学性质

1.1.2 优雅蝈螽精子基本结构

1.1.3 优雅蝈螽精子形成

1.2 细胞骨架及KIF3A、KIF18A的概述

1.2.1 微管

1.2.2 微丝

1.2.3 KIF3A和 KIF18A

1.3 国内外研究进展

1.3.1 精子形成中相关驱动蛋白作用的国内外研究进展

1.3.2 KIF3A国内外研究进展

1.3.3 KIF18A国内外研究进展

1.4 研究目的及意义

第2章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验昆虫

2.1.2 实验试剂与仪器

2.2 实验方法

2.2.1 在精巢组织中筛选高表达的驱动蛋白基因及qPCR验证

2.2.2 KIF3A和 KIF18A基因与蛋白序列分析

2.2.3 精巢总RNA提取

2.2.4 第一条cDNA链合成

2.2.5 dsRNA对应的目的片段及引物的设计

2.2.6 目的片段的扩增

2.2.7 克隆载体的构建

2.2.8 双酶切反应

2.2.9 干扰载体的构建

2.2.10 dsRNA的合成

2.2.11 RNAi处理

2.2.12 干扰效果的qPCR验证

2.2.13 干扰效果的免疫荧光观察

2.2.14 干扰效果的PAS观察

第3章结果

3.1 优雅蝈螽转录组个体不同部位驱动蛋白基因表达结果

3.2 kif3a、kif18a基因在不同组织中qPCR结果

3.3 KIF3A及 KIF18A基因及蛋白序列分析结果

3.3.1 kif3a、kif18a基因cDNA序列分析

3.3.2 KIF3A、KIF18A蛋白结构域分析

3.3.3 二级结构预测

3.3.4 三级结构预测

3.4 分子进化树分析结果

3.5 重组克隆载体与干扰载体空载双酶切反应结果

3.6 干扰载体构建

3.7 干扰后qPCR结果

3.8 干扰后精巢组织涂片及切片观察结果

第4章讨论及结论

4.1 讨论

4.2 小结

4.3 研究展望

参考文献

附录 Ⅰ

附录 Ⅱ

致谢

攻读学位期间取得的科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王乐

导师: 常岩林

关键词: 优雅蝈螽,精子形成,精细胞,微管蛋白,微丝

来源: 河北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河北大学

分类号: Q965

总页数: 86

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