论文摘要
环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌中普遍存在的一种第二信使。作为细菌信号传导途径的重要组成部分,c-di-GMP可直接结合不同类型的受体分子,广泛调控多种重要的生命活动,如运动性、生物膜形成与抗生素合成等。鸟苷酸环化酶（Diguanylate cyclase,DGC）和磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）分别负责c-di-GMP的合成和降解,从而协同控制胞内c-di-GMP的水平。通常,含有GGDEF氨基酸基序的蛋白具有鸟苷酸环化酶活性,能催化GTP产生c-di-GMP。而含有EAL或HD-GYP基序的蛋白具有磷酸二酯酶活性,能将c-di-GMP水解为5’-磷酸鸟苷酸-（3’-5’）-鸟苷（pGpG）或鸟苷酸（GMP）。链霉菌（Streptomyces）是一类高GC含量的革兰氏阳性菌,具有复杂的形态分化过程和强大的次级代谢能力,能产生众多具有生物学活性的次级代谢产物,如抗生素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物等。研究表明,链霉菌的次级代谢与形态分化过程受到多层次严格调控,如双组份系统和c-di-GMP介导的信号通路。现有链霉菌中关于c-di-GMP参与形态分化与次级代谢的调控研究仅限于模式菌株--委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）与天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）,而且其研究还处于起始阶段。例如,天蓝色链霉菌基因组中编码10个可能的c-di-GMP代谢酶,但目前仅有4个功能被鉴定。因此,系统研究天蓝色链霉菌中功能未知的c-di-GMP代谢酶并全面揭示它们参与形态分化或次级代谢的调控网络不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。在本研究中我们运用基因缺失或过表达方法,对天蓝色链霉菌中6个功能未知的c-di-GMP代谢酶进行了鉴定。表型分析显示所有缺失突变菌的生长和抗生素合成均未受到显著影响。然而,过表达菌株中2个展现出明显的表型变化。一方面,过表达cdgD（SCO5345）完全阻断了菌株在R2YE或MS培养基中孢子的形成,并在R2YE中显著抑制放线紫红素（Actinorhodin,ACT）和灵菌红素（Prodigiosin,RED）的合成。另一方面,cdgC（SCO5511）过表达后菌株在MS培养基中ACT产量显著提升,但形态分化未受影响。随后,本研究对CdgD的功能进行了深入探究。定点突变实验证明含有突变的GGDEF基序的CdgD完全丧失其调控功能。cdgD过表达后胞内c-di-GMP浓度比野生型菌株高13-27倍。体外酶活实验证明CdgD能有效催化GTP形成c-di-GMP。这些结果充分表明CdgD是一个新的鸟苷酸环化酶。进一步,本研究将天蓝色链霉菌来源的cdgD在两种重要的工业链霉菌-始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）和吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中进行了异源过表达,其形态分化和相应合成的抗生素--普那霉素I或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生物合成均受到了显著抑制。这些结果初步证明c-di-GMP介导的形态分化与次级代谢的信号调控途径在链霉菌属中是保守的。最后,体内定点突变实验初步证明含有突变的GGDEF基序的CdgC过表达后不再显著提升ACT产量,初步表明CdgC是一种鸟苷酸环化酶。有趣的是,cdgC过表达促进ACT合成,但并没有引起胞内c-di-GMP浓度的明显变化,其具体机制有待进一步研究。综上所述,我们在天蓝色链霉菌中鉴定了2个新的鸟苷酸环化酶CdgC与CdgD,并系统研究了它们对菌株形态分化或次级代谢的调控功能。其次,我们也证明c-di-GMP介导的信号转导通路对工业链霉菌生长与抗生素合成均发挥重要作用。最后,cdgC过表达后ACT产量大幅上调,这是首次观察到鸟苷酸环化酶在链霉菌次级代谢过程中发挥正向调控作用,其具体机制有待进一步研究。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 刘小草
导师: 姜卫红,王刚
关键词: 天蓝色链霉菌,鸟苷酸环化酶,形态分化,次级代谢
来源: 河南大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 河南大学
分类号: Q93
总页数: 79
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