一、AA方案治疗急性髓性白血病20例分析（论文文献综述）
郭雯铮[1]（2021）在《TKI时代Ph阳性白血病患者疗效观察及耐药患者ABL激酶区突变分析》文中进行了进一步梳理目的:Ph染色体阳性白血病最常见的类型为慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukaemia,CML）和Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph chromosome-Positive acute lym Phocytic leukemia,Ph+ALL）。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine protein kinase inhibitors,TKI）的问世,已经彻底改变了CML的治疗方法,现在预期寿命接近普通人群,但在治疗的过程中有部分患者在某个时间点产生了TKI耐药。对Ph+ALL患者来说,TKI改善了只使用标准化学疗法治疗时治愈率不到5%的现状,现其完全缓解率（CR）可达90%以上,5年总生存率（OS）为40%-60%。然而,TKI耐药及疾病进展,尤其是Ph+ALL患者的高累积复发率仍然是这两类白血病患者预后不良的重要影响因素。本研究旨在对这两类患者基本临床特征、TKI用药的疗效、最主要的耐药原因ABL激酶区突变及所发现的新ABL基因异常剪接体进行了探索与分析。方法:1.收集CML及Ph+ALL患者的基本信息,随访信息及骨髓血标本并提取RNA保存,记录其临床特征,用药信息,分析此类患者的用药疗效,分子学反应,生存情况。2.Sanger一代测序法检测CML和Ph+ALL患者耐药复发时ABL激酶区突变。PAGE凝胶电泳对PCR产物进行筛选。3.实时荧光定量PCR（q-PCR）和微滴式数字PCR（dd-PCR）检测BCR-ABL融合基因表达水平。4.T-A克隆测序分析ABL激酶区双突变的组成。结果:1.82.7%的CML患者使用一代TKI作为初始治疗药物,19.6%的CML患者对TKI耐受,其余患者都出现了不同的不良反应,其中水肿（24.8%）为主要的不良反应。在14例达MR4.5后停药的患者中,有2例（14.3%）停药36个月时仍处于无治疗缓解（TFR）。2.CML患者在治疗3个月时,与使用一代TKI相比,二代TKI达早期分子学反应（EMR）率更高（P=0.04）;达主要分子学缓解（MMR）率无统计学差异（P=0.15）。在治疗12个月时,与一代TKI相比,二代TKI达深层分子学反应（DMR）率更高（P=0.03）;达MMR率无统计学差异（P=0.097）。与达MMR组相比,未达MMR组更多的服用国产TKI治疗（P=0.015）;白细胞计数更高（P=0.031）;异常染色体更多（P=0.01）;截止随访日期达到MR4.5的人数更少（P=0.004）。3.在CML耐药患者中ABL激酶突变的发生率为44.2%。突变集中的主要区域P-Loop区和与TKI直接结合区。D391G,p.Pro230Alafs*14,p.Val304Argfs*13,p.Asp363＿386Argdel24aa p.Gly372＿447Glndel76aa为首次发现的新突变类型。4.在Ph+ALL耐药复发患者中ABL激酶突变的发生率为63.9%。突变集中的主要区域P-Loop区和与TKI直接结合区。V338M,G426E,p.Val304Argfs*13,p.Asp363＿386Argdel24aa,p.Val371Hisfs*29为首次发现的新突变类型。5.Ph+ALL复发患者中存在高达58%的P190和P210共表达率。共表达P190和P210的Ph+ALL复发患者两种不同的转录本ABL激酶区突变负荷不同,且与其各自的BCR-ABL融合基因水平呈正相关。6.具有重现性的p.Asp363＿386 Argdel24aa剪接体在健康对照组、CML初发组、CML复发组、初发Ph+ALL、复发Ph+ALL中的发生率分别为:0%（0/60）,3.3%（1/30）,3.3%（1/30）,0%（0/20）,0%（0/20）。结论:1.在CML患者中,使用二代TKI比一代TKI更多的达到EMR及DMR;治疗12个月达到MMR的患者更容易实现MR4.5。2.ABL激酶突变在CML耐药及Ph+ALL耐药复发患者中存在较高的发生率,且突变类型以点突变为主,异常剪接体可能参与这一过程,新型剪接体p.Asp363＿386 Argdel24aa在耐药Ph+白血病患者中具有重现性,可能与TKI耐药相关。3.在P210和P190共表达的Ph+ALL中,ABL激酶区突变负荷在两种不同转录本中呈现不同比例,且与其各自的BCR-ABL融合基因水平呈正相关。
杨明月[2]（2021）在《红细胞分布宽度在初诊骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、急性白血病、慢性粒细胞白血病中的临床分析》文中研究表明目的分析红细胞分布宽度（Red blood cell distribution width,RDW）在初诊骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndromes,MDS）、再生障碍性贫血（Aplastic anemia,AA）、急性白血病（Acute leukemia,AL）、慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）中的分布特征,进一步探讨RDW在初诊MDS、AA、AL、CML中的诊断及鉴别诊断意义。方法收集2002年至2021年兰州大学第一医院血液科初诊为MDS（90例）、AA（67例）、AL（102例）、CML（111例）的患者以及正常对照组（76例）的临床资料。以本院实验室检测参考值:RDW-CV（10.9～15.4%）及RDW-SD（39～46f L）为标准,分为低RDW组、正常RDW组、高RDW组。回顾性分析了四种疾病的RDW值分布,进一步分层分析了AA中（非重型/重型/极重型）、AL中（ALL/AML）疾病类型与RDW的关系,对四种疾病与对照组的RDW水平进行了比较分析,探索了MDS、AML（非APL）预后危险度分层与RDW的相关性。结果1.一般资料:正常对照组年龄中位数为64岁（17～85岁）,男性28例（36.8%）,女性48例（63.2%）。MDS组年龄中位数为56.5岁（2～84岁）,男性49例（54.4%）,女性41例（45.6%）。AA组年龄中位数为28岁（2～82岁）,男性39例（58.2%）,女性28例（41.8%）。AL组年龄中位数为48岁（2～78岁）,男性61例（59.8%）,女性41例（40.2%）;其中,AML年龄中位数为51岁（3～78岁）,ALL年龄中位数为13岁（2～72岁）。CML组年龄中位数为45岁（2～83岁）,男性63例（56.8%）,女性48例（43.2%）。MDS、AA、AL、CML四种疾病中的男性占比均高于女性。MDS、AA、AL、CML之间的男女分布比较无统计学差异（χ2=0.597,P=0.897）。2.MDS-MLD有53例（58.9%）,MDS-EB-2有14例（15.6%）,MDS-EB-1有13例（14.4%）,MDS-RS-MLD有5例（5.6%）,MDS-SLD有2例（2.2%）,MDS-RS-SLD、MDS-U、MDS伴单纯del（5q）各1例。AA中非重型有27例（40.3%）,重型有31例（46.3%）,极重型有9例（13.4%）。AL中ALL有29例（28.4%）,AML-M4有21例（20.6%）,AML-M2有20例（19.6%）,AML-M5有15例（14.7%）,AML-M3（APL）有14例（13.7%）,AML-M1有3例（2.9%）。111例CML均处于CP期。3.MDS、AA、AL、CML的RDW值分布:（1）MDS、AA、AL、CML患者的高RDW-CV分别有72例（80%）、30例（44.8%）、71例（69.6%）、105例（94.6%）,正常范围RDW-CV分别有18例（20%）、37例（55.2%）、31例（30.4%）、6例（5.4%）,低RDW-CV均为0例。与对照组相比,MDS、AA、AL、CML的RDW-CV均升高（χ2分别为103.546、39.612、84.321、159.865,P值均为0.000）。（2）MDS、AA、AL、CML患者的高RDW-SD分别有88例（97.8%）、45例（67.2%）、94例（92.2%）、111例（100%）,正常范围RDW-SD分别有2例（2.2%）、15例（22.4%）、8例（7.8%）、0例,低RDW-SD分别为0例、7例（10.4%）、0例、0例。与对照组相比,MDS、AA、AL、CML的RDW-SD均升高（χ2分别为100.808、47.196、90.366、125.891,P值均为0.000）。4.AA中（非重型/重型/极重型）、AL中（ALL/AML）疾病类型与RDW的关系:（1）AA中非重型、重型、极重型的RDW-CV水平分别为15.30±2.06%、15.57±2.31%、13.43±1.33%,RDW-SD水平分别为56.54±11.67f L、53.58±11.25f L、42.26±6.34 f L,三组间在RDW-CV和RDW-SD水平上差异均有统计学意义（F分别为3.676、5.779,P值分别为0.031、0.005）。非重型、重型的RDW-CV均高于极重型（P值分别为0.024、0.009）。非重型、重型的RDW-SD均高于极重型（P值分别为0.001、0.008）。（2）AL中ALL、AML患者的RDW-CV水平分别为17.53±2.61%、16.66±2.79%,RDW-SD水平分别为58.28±11.56f L、59.67±10.33f L,两组间在RDW-CV和RDW-SD水平上差异均无统计学意义（P值分别为0.148、0.554）。5.MDS、AA、AL、CML的RDW水平与对照组比较:（1）MDS、AA、AL、CML患者的RDW-CV水平分别为18.19±3.14%、15.18±2.19%、16.90±2.76%、18.32±2.02%,均明显高于正常对照组的13.29±0.85%,差异有统计学意义（P值均为0.000）。（2）MDS、AA、AL、CML患者的RDW-SD水平分别为67.70±11.63f L、53.25±11.71f L、59.27±10.65f L、60.64±6.32f L,均明显高于正常对照组的44.53±3.08f L,差异有统计学意义（P值均为0.000）。6.RDW水平在MDS、AA、AL、CML之间的比较:（1）MDS、AL、CML组的RDW-CV水平分别为18.19±3.14%、16.90±2.76%、18.32±2.02%,均高于AA组的15.18±2.19%,P值均为0.000。MDS、CML组的RDW-CV均高于AL组,P值分别为0.003、0.000。（2）MDS、AL、CML组的RDW-SD水平分别为67.70±11.63f L、59.27±10.65f L、60.64±6.32f L,均高于AA组的53.25±11.71f L,P值分别为0.000、0.001、0.000。MDS组的RDW-SD高于AL、CML组,P值均为0.000。7.MDS、AML（非APL）预后危险度分层与RDW的相关性:（1）MDS中能进行预后危险度分层（IPSS评分）的有82例:低危有6例（7.3%）,中危-1有60例（73.2%）,中危-2有14例（17.1%）,高危2例（2.4%）。预后低危、中危-1、中危-2、高危患者的RDW-CV水平分别为17.55±4.02%、18.27±2.96%、17.24±3.52%、17.35±2.62%,RDW-SD水平分别为64.72±10.14f L、68.56±11.68f L、64.41±12.86f L、68.65±1.34f L,四组危险度分层之间RDW-CV和RDW-SD水平相比差异均无统计学意义（F分别为0.488、0.607,P值分别为0.691、0.612）。MDS预后危险度分层与RDW之间无相关性。（2）AML（非APL）中能进行预后危险度分层的有38例:良好9例（23.6%）,中等8例（21.1%）,不良有21例（55.3%）。预后良好、中等、不良的RDW-CV水平分别为16.77±2.17%、15.40±2.11%、17.37±3.51%,RDW-SD水平分别为59.44±8.36f L、58.01±7.55f L、62.78±9.63f L,三组危险度分层之间RDW-CV和RDW-SD水平相比差异均无统计学意义（F分别为1.247、0.994,P值分别为0.300、0.380）。AML（非APL）预后危险度分层与RDW之间无相关性。结论1.MDS、AA、AL、CML的RDW-CV和RDW-SD水平均升高。2.非重型、重型AA的RDW-CV、RDW-SD水平均高于极重型AA。3.虽然AL（ALL、AML）的RDW-CV、RDW-SD水平均升高,但ALL、AML两者间的RDW-CV、RDW-SD水平无差异。4.MDS、AL、CML的RDW-CV、RDW-SD均高于AA。MDS、CML的RDW-CV高于AL。MDS的RDW-SD高于AL、CML。5.MDS、AML（非APL）的预后危险度分层均与RDW值无关。
张琛[3]（2020）在《骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究》文中研究说明第一部分急性髓性白血病骨髓微环境中神经破坏与Th免疫失衡的研究研究背景急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一组异质性恶性疾病,其特征是白血病干细胞和/或祖细胞的过度增殖造成大量白血病细胞累积并抑制正常造血。即使采用目前临床应用强化的化疗方案和干细胞移植,AML的总体生存率仍然很差。恶性白血病细胞的微环境会被重塑成有利于白血病生存的环境,这样的骨髓微环境可以保护AML细胞免受化疗药诱导的细胞死亡。探究骨髓微环境中可以促进白血病发生发展、保护白血病细胞免受化疗药杀伤的因素,以期能够发现针对AML治疗的有效靶点。骨髓局部区域里的交感神经系统与造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSC）通过直接接触或者通过分泌细胞因子的形式,调节骨髓龛内造血干细胞的存活和休眠状态的转化来调控骨髓的正常造血功能。当破坏小鼠交感神经后,使骨髓局部缺乏交感失神经分布,会使得骨髓中造血干细胞数量的急剧下降,使正常的造血功能受到一定程度的抑制。骨髓局部的交感神经组织对骨髓中的造血和免疫平衡的维持具有极为重要地调控作用。然而,骨髓交感神经损伤与血液系统疾病的发生发展也有着密不可分的关系。有研究发现骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative Neoplasms,MPN）患者及模型小鼠的骨髓中,交感神经纤维有明显受损,这些损伤可以使得正常HSC的凋亡。CD4+T细胞是免疫系统中一个不可忽略的组成成分,其分化的Th（T helper）亚群在许多实体瘤的发生发展中也扮演着关键的角色。课题组前期发现AML患者骨髓中交感神经特异性分子酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、Nestin等的表达水平与Th细胞分泌的特异性细胞因子IL-17A表达呈正相关,而与Foxp3/IL-17A比值呈负相关。因此,我们推测在AML的发生发展中,骨髓交感神经发生病理性改变,引起骨髓区域微环境Th细胞免疫网络的异常,造成骨髓微环境中免疫平衡受到抑制,进而使得白血病病程进展。然而,AML中骨髓交感神经损伤是通过何种机制改变骨髓Th细胞免疫网络,以及Th细胞免疫异常如何促进白血病细胞的发生发展,这些问题亟待进一步研究。研究目的1.明确AML患者骨髓局部存在神经破坏并分析其与患者临床特征之间的相关性。2.检测骨髓局部微环境中Th亚群的改变,明确在AML患者中存在骨髓Th亚群的免疫失衡,并通过系统生物学的分析推测其中作用的关键点。3.探究在白血病动物模型中破坏交感神经后,其Th的变化情况。4.应用髓腔注射的方法,破坏白血病动物模型骨髓局部的交感神经,旨在明确骨髓局部神经受到破坏后对白血病发生发展的作用。研究方法1.标本收集:本研究采集就诊于山东大学齐鲁医院的63例初诊急性髓性白血病病患及16例对照组的骨髓液;分离骨髓中的单个核细胞并用MACS方法分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.AML患者骨髓局部存在神经破坏:应用RT-PCR方法检测患者和对照组骨髓细胞中神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的相对表达水平。3.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:应用RT-PCR方法检测骨髓局部β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR在患者和对照组中的表达差异,并分析其与临床特征之间的相关性。4.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:流式细胞术检测AML患者与对照组骨髓局部Th亚群比例,包括Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和Treg;应用RT-PCR技术检测Th亚群特异性转录因子T-bet、RORc、GATA3、AHR和Foxp3的mRNA水平;采用ELISA方法检测骨髓上清中细胞因子IFN-γ、IL-17A、TGF-β、IL-22、IL-10 和 IL-4 的浓度。5.系统生物学方法分析:我们利用系统生物学方法中的贝叶斯网络对白血病患者和对照组骨髓微环境中检测的Th亚群以及Th亚群的关键性转录因子进行分析。6.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的影响:应用MLL-AF9细胞尾静脉注射到C57BL/6J背景的野生型雌鼠体内建造AML小鼠模型;分别进行 6-羟基多巴胺氢溴酸盐（6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA）和 4-甲基儿茶酚（4-Methylcatechol,4-MY）的腹腔注射对小鼠进行神经破坏和神经保护的干预;应用流式细胞术的方法对动物模型骨髓局部Th亚群的比例进行测定。7.骨髓局部交感神经破坏对白血病的影响:应用髓腔注射6-OHDA的方法对小鼠骨髓局部的神经进行破坏。研究结果1.AML患者骨髓局部存在神经破坏:通过比较患者和对照组骨髓局部的基因相对表达量发现,神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的mRNA水平在白血病患者中均低于对照组,提示AML患者骨髓局部微环境中存在交感神经的破坏。2.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:通过检测β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR,我们发现除β1亚型在白血病患者骨髓局部的相对表达量较低,β2和β3亚型在白血病患者的骨髓局部均有着较高的相对表达水平。并且,β2-ADR亚型的表达量远高于β1-ADR和β3-ADR亚型。通过分析其与临床特征的关系,AML-M4和AML-M5亚型高表达β3-ADR,而其中高表达β1-ADR的病患出现髓外浸润的几率更大。3.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:（1）.与对照组相比,AML患者骨髓局部Th1和Th17的比例出现显着地降低,Treg和Th22的比例显着增高:（2）.AML患者骨髓中Th亚群的下游转录因子T-bet、RORc和GATA3的mRNA表达量较对照组明显降低,而Treg的下游转录因子Foxp3和Th22的转录因子AHR有所增高;（3）.AML患者Th亚群分泌的细胞因子中,IFN-γ、IL-17A、TGF-β和IL-22均低于对照组,而IL-10和IL-4的分泌量高于对照组;（4）.将上述结果通过贝叶斯网络进行分析发现,对照组中贝叶斯网络的终点指向IFN-γ和IL-4,而在AML患者中网络的终点变为IL-17A和IL-10。4.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的作用:（1）.AML模型鼠的生存期均短于正常对照组小鼠,且神经破坏剂组AML小鼠生存期短于其他组小鼠生存期;（2）.神经破坏剂组小鼠的白血病负荷明显高于其他组,而神经保护剂组小鼠的白血病负荷明显低于其他组;（3）.骨髓局部微环境中,Th1和Th17在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低,Treg和Th2在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均升高。Th17/Treg比值在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低。5.骨髓局部交感神经破坏对白血病及Th亚群的影响:在利用髓腔注射的方法对白血病模型小鼠单只股骨的局部交感神经进行破坏后,观察其白血病负荷情况发现,被破坏交感神经一侧的髓腔内的白血病负荷明显高于未进行神经破坏一侧的负荷量。研究结论1.AML病患骨髓局部存在交感神经破坏,且β-肾上腺素受体在AML病患骨髓局部存在高表达。2.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡,Th1及Th17的比例明显降低,Treg等免疫抑制亚群的比例明显增高。3.AML小鼠模型组,神经破坏剂组生存期明显变短且白血病负荷增加,而神经保护剂组生存期更长且白血病负荷更少;AML及神经破坏组的骨髓中存在免疫失衡。4.局部破坏AML小鼠单侧的骨髓交感神经发现,被破坏一侧髓腔中白血病负荷明显高于神经完整的一侧髓腔,证明神经破坏会促进急性髓性白血病进展。第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髓性白血病细胞作用的研究研究背景急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种生物学和临床表现上的存在高度异质性疾病。尽管支持治疗和预后风险分层的进展已优化了既定疗法,但总体长期生存率仍然很低,所以明确能够影响疾病发生发展的因素是十分必要的。众所周知急性应激反应是人体会对外界刺激作出的积极地反应,而慢性应激通常是有害的,并可能导致严重的健康并发症。应激会触发中枢神经系统特定部位控制下的神经内分泌链反应,其中主要包括肾上腺和交感神经系统分泌儿茶酚胺和糖皮质激素。儿茶酚胺（catecholamines）是最早对压力作出反应的信号分子,也是主要发挥作用的分子。尽管儿茶酚胺（主要是表肾上腺素和去甲肾上腺素）的主要功能是作用于心脏功能,但新近的研究表明这些应激激素也显示出在癌症中的重要作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）是巨噬细胞/单核细胞在急性炎症过程中产生的炎症细胞因子,负责细胞内各种信号事件。TNFα结合TNFR触发各种MAPK等细胞内信号途径,参与到调节炎症和肿瘤中。T辅助（Th）亚群是CD4+T细胞在激活后会分化出不同的亚群,是各种免疫应答中重要的组成部分。不管是早期发现的Thl和Th2亚群还是新近的研究热门Th17及Treg亚群都被认为参与到了诸如卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中的发病机制中。Th亚群的免疫失衡在疾病中被认为是导致疾病发生的关键因素。而且,有证据表明,诸如淋巴细胞等的膜表面上会存在多种神经递质的受体,而交感神经递质不仅会抑制免疫系统,还会导致Th1/Th2的细胞平衡向以Th2为主的反应发生转变并诱导了哮喘和过敏性疾病的发生。然而,交感神经递质以何种方式参与AML发生发展还尚不明确。依据前期检测到AML骨髓局部中存在着一定程度的神经损害以及Th亚群的免疫失衡,我们推测,在AML骨髓区域微环境中,交感神经递质会造成Th17、Treg、Th1、Th2等多个Th细胞免疫的失衡,最终促进AML白血病的发生发展。研究目的1.探究骨髓局部的交感神经递质对Th亚群免疫平衡的影响,明确其具体的作用机制。2.探究交感神经递质在不同浓度下对原代及白血病细胞系的影响,明确其如何通过改变Th亚群免疫平衡进而促进白血病发生发展。3、明确交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体抑制CD4+T向免疫保护亚群Th1及Th17亚群分化,进而造成了骨髓局部的免疫抑制。4、进一步探究神经递质抑制了Th1及Th17亚群杀伤白血病细胞的作用,进而促进白血病的进展。研究方法1.标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院初诊AML患者骨髓液;分出骨髓中的单个核细胞并用MACS分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:选取AML细胞系MV4-11和THP-1以及初诊急性髓性白血病患者的原代细胞;应用CCK8检测不同浓度的肾上腺素和去甲肾上腺素在24小时和48小时时间点对其促增殖情况。3.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:应用RT-PCR技术检测不同细胞上β1/β2/β3-肾上腺素受体受体mRNA的表达情况。4.不同浓度的交感神经递质对Th亚群的影响:设置浓度梯度0、10-8M,10-7M、10-6M、10-5M和10-4M的肾上腺素及去甲肾上腺素作用于CD4+T细胞;应用MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-17A细胞因子的浓度。5.交感神经递质通过β-肾上腺素受体影响Th亚群的免疫平衡:MACS免疫磁珠法分选小鼠CD4+T细胞;琼脂糖凝胶DNA电泳明确β-肾上腺素受体敲除鼠的基因型;流式细胞术检测小鼠Th亚群的变化;ELISA检测培养后的细胞上清中IFN-γ和IL-17A的浓度。6.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;CCK8方法用于检测细胞增殖情况。研究结果1.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:分别应用不同浓度梯度等肾上腺素以及去甲肾上腺素,分别作用于初诊AML患者的原代细胞和MV4-11及THP-1两种AML细胞系,在24小时和48小时两个时间点应用CCK8方法检测其增殖情况,随着浓度的增加交感神经递质促进白血病细胞增殖的效果越明显。肾上腺素及去甲肾上腺素均在10-4M浓度时促增殖效果最明显,且肾上腺素促白血病细胞增殖效果优于去甲肾上腺素。2.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:（1）应用RT-PCR技术检测了 HL60、THP-1、U937、Kasumi四种不同的AML细胞系以及CD4+T细胞和Hela细胞系表面β-肾上腺素受体的表达情况。其中β2-肾上腺素受体表达量远高于其他两种亚型,而β3-肾上腺素受体的相对表达量低于其他两种亚型,且AML细胞系及CD4+T细胞均有较高的β-肾上腺素受体。（2）同时检测了小鼠脾脏、骨髓、外周血、分选的CD4+T细胞以及骨骼肌细胞的β-肾上腺素受体受体表达情况。β2-肾上腺素受体表达量在各个组织里仍远高于其他两种亚型,β3-肾上腺素受体表达量也是最低的一种。其中CD4+T细胞上β2-肾上腺素受体的表达量最高,接近骨骼肌中表达量的水平。3.低浓度的交感神经递质对Th亚群的免疫平衡无明显影响:（1）分别加入10-8M-10-5M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素于CD4+T细胞的培养体系中,3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的比例及其比值关系。研究发现在10-8M-10-5M浓度区间,Th亚群及Th1/Th2、Th17/Treg相比于空白对照组均无统计学差异。（2）取培养后的上清,应用酶联免疫标记法（ELISA）测定分泌IFN-γ和IL-17A细胞因子的量,不同浓度梯度组与对照组之间的差别亦无统计学意义。4.高浓度的交感神经递质可改变Th亚群的免疫平衡:（1）CD4+T细胞的培养中分别添加10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的百分比及其比值关系。研究发现,肾上腺素及去甲肾上腺素均能明显降低Th1及Th17的比例,并且能升高Treg的比例。（2）应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养后的细胞上清,肾上腺素及去甲肾上腺素培养后上清中IFN-γ及IL-17A细胞因子的浓度明显减低。5.交感神经递质亦改变小鼠Th亚群的免疫平衡:分选小鼠CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测发现Thl和Th17在对照组中的比例明显降低,Treg的比例明显增高。RT-PCR技术检测IFN-γ和IL-17A的mRNA水平明显低于对照组。6.交感神经递质通过β-肾上腺素受体改变Th亚群的免疫平衡:（1）检测β1/β2-肾上腺素受体敲除鼠的基因型,明确β1及β2-肾上腺素受体敲除成功。（2）分选肾上腺素受体敲除小鼠的CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测Th1、Th17和Treg的比例,结果发现Th1及Th17亚群未被交感神经递质所抑制。证明交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体发挥改变Th的作用。7.TNF-α能通过TNFR2促进Treg的比例:TNFR2是TNF-α主要的发挥作用的受体,于是我们应用流式细胞学的方法对初诊的急性髓性白血病患者和对照组中CD4+T细胞及Treg细胞表面的TNFR2表达量进行测定。初诊白血病患者的CD4+T细胞和Treg细胞表面均高表达TNFR2受体。随后,我们在CD4+T细胞的培养体系中加入TNF-α进行培养,在添加了 TNF-α后,Treg的比例明显增加,然而在预先添加TNFR2拮抗剂后再添加TNF-α进行培养则可以降低Treg的比例。8.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:CD4+T细胞的培养体系中分别加入10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后将CD4+T细胞与白血病细胞进行共培养,于24小时和48小时用CCK8方法检测AML细胞增殖情况。肾上腺素及去甲肾上腺素均能通过改变Th亚群平衡进而促进AML的增殖,其中肾上腺素作用更为明显。研究结论1、交感神经递质肾上腺素和去甲肾上腺素均能在24小时和48小时促进原代白血病细胞及白血病细胞系的增殖,且随浓度的增加其促进白血病细胞增殖的效果更加显着。2、交感神经递质可以抑制人和小鼠CD4+T细胞向Th1和Th17方向分化。3、敲除β-肾上腺素受体后,交感神经递质不能改变小鼠Th1及Th17的比例。4、TNF-α能通过TNFR2受体促进Treg的比例。5、交感神经递质通过抑制Th1和Th17的比例进而抑制其对白血病细胞杀伤作用。第三部分NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究研究背景急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）是一种血液恶性肿瘤,由于骨髓和其他组织中的淋巴样干祖细胞的恶性增殖和积累所致。尽管最常见的ALL是儿童急性淋巴细胞白血病（占ALL 80%的病例）,但成人急性淋巴细胞白血病的治愈率仅有20%-40%。在过去的十年中,尽管在改善预后以及开发针对特定亚型的新疗法方面取得了一定进展,但了解疾病的发病机制仍是改变ALL治愈率的关键点。炎性小体是固有免疫中公认的重要角色。其中研究最透彻的是NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体复合物属于核苷酸结合和寡聚化域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）的家族,也被称为“含pyrin域的蛋白3”。NLRP3炎性小体与许多疾病密切相关,包括多发性硬化症、炎症性肠病以及其他自身免疫性和自身炎性疾病。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是一种 DNA 序列的多态性,是由于单个核苷酸在基因组水平上的变异而引起的。SNP在至少1%的人群中有差异,占正常人类遗传变异的大部分。虽然大多数SNP没有明显的表型作用,然而仍有很多的SNP被认为可能促进疾病发生发展以及影响药物治疗的功效。NLRP3相关分子的SNP在许多肿瘤和慢性病的发病及疾病进展过程中都有很大的作用。例如,已有文献表明CARD8（rs2043211）与心血管疾病的发生有关,NF-κB-94ins/del ATTG多态性则与胃癌、肝细胞癌和肺癌等癌症的发生密切相关,NLRP3效应分子之一IL-18的单核苷酸多态性rs1946518已显示与牙周炎和肝细胞癌的发病有关,而IL-1β rs16944被认为可能导致宫颈癌和胃炎。因此,NLRP3炎性体相关基因的多态性与恶性肿瘤的发生关系密切。NLRP3己广泛涉及各种血液疾病的发生和发展。然而,NLRP3炎性小体如何促进ALL的发生发展仍然未知。因此,我们探究了 ALL患者的骨髓中NLRP3炎性小体的单核苷酸多态性及其相关基因的表达情况,以期明确其在ALL发生发展中的作用。研究目的探索NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与ALL易感性的关系;分析不同模式下NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与临床特征之间的关系;为明确NLRP3单核苷酸多态性具体作用机制,探索其对NLRP3各组分表达水平及下游因子表达和细胞因子分泌的影响。研究方法1、PCR 检测 ALL 病人及健康对照组中的 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG 基因的单核苷酸多态性。2、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组和正常对照组 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与ALL易感性之间的关联。3、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组中CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与预后有关的临床特征的关联。4、RT-PCR测定ALL患者IL-1β、IL-18 mRNA的相对表达,并分析其与患者NLRP3炎性小体相关基因SNPs之间的关系。5、ELISA测定ALL患者血清中IL-1β、IL-18的含量,并分析其与NLRP3炎性小体相关基因SNPs的关系。研究结果1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关:检测ALL患者组和对照组NLRP3相关成分的单核苷酸多态性,我们发现CARD8（rs2043211）在显性模式下的AT/TT基因型和共显性模型下的TT基因型与ALL易感性明显相关。此外,NF-κB-94ins/del ATTG中D等位基因的频率和显性模式下的DD基因型均与ALL易感性显着相关。我们采用单因素逻辑回归分析法分析NF-κB和CARD8,研究发现NF-κB单核苷酸的多态性表现为保护作用,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型却极大的增加了 ALL的易感性。2、表达NF-KB-94ins/del ATTG DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关:根据《NCCN急性淋巴细胞白血病指南》,一些临床检查指标可以给临床提供预后信息。我们的研究分析了这些预后指标与NLRP3炎性小体相关基因的四个SNP之间的关联,旨在弄清NLRP3遗传多态性与ALL预后之间的相关性。依据指南,WBC计数超过30×109/L被认为是不良的预后指标,而我们研究发现表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有更低的WBC计数。ALL的免疫表型主要分为T细胞免疫表型和B细胞免疫表型,T细胞免疫表型也是一个预后不良因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关性更强。因此,我们认为NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型显示为保护因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与预后不良相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG,IL-18（rs1946518）和 IL-1β（rs16944）与 ALL 患者的临床特征相关性分析:对于NF-κB-94ins/del ATTG在隐性模式下的WW/WD基因型相比,DD基因型与较低的血红蛋白含量相关。共显性模型中的DD基因型及D等位基因发生脾肿大概率更高。IL-18（rs1946518）在隐性模式下TT基因型与脾肿大和血清中的高AST浓度具有统计学相关性。另外,在共显性模型中的TT基因型和T等位基因与较高水平空腹血糖有关。而IL-1β（rs16944）中的多态性与肌酐浓度有关。在隐性模式中,TT基因型比GG/GT基因型和高肌酐浓度更为相关。关于等位基因的频率方面,G等位基因也与高肌酐浓度显着相关。4、NLRP3炎性小体单核苷酸多态性与其相关基因表达的关系:关于CARD8（rs2043211）的AT基因型会表达较高NLRP3和ASC。TT基因型比AA和AT基因型会有更高的caspase-1 mRNA表达量。关于IL-1β（rs16944）多态性,相较于GG和TT基因型,GT基因型与IL-18表达量密切相关。并且相较于TT基因型,GT基因型会有更高的ASC表达量并分泌更多的IL-1β。与GG基因型相比,IL-18（rs1946518）多态性的TT基因型也与IL-1β和IL-18浓度相关。然而,IL-18多态性的GT基因型与NLRP3和ASC的较高水平有关。研究结论1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关。2、表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG与较低的血红蛋白含量以及脾肿大相关;表达IL-18（rs 1946518）基因型的ALL患者更易出现脾肿大及高的AST浓度和高的空腹血糖;而IL-1β（rs16944）基因型的ALL患者更易出现高肌酐浓度。4、CARD8（rs2043211）的 AT 和 TT 基因型、IL-1β（rs16944）的 GT 和 TT 基因型和IL-18（rs1946518）的TT基因型与NLRP3相关基因的mRNA高表达和分泌的细胞因子有关。
沈明月[4]（2019）在《芪莲益髓清毒颗粒干预KG-1a人白血病细胞线粒体氧化呼吸与能量代谢的机制研究》文中研究指明目的:本研究以KG-1a细胞株建立人急性髓系白血病体外模型,研究芪莲益髓清毒颗粒干预线粒体氧化呼吸与能量代谢以诱导白血病细胞凋亡的作用机制。通过研究芪莲益髓清毒颗粒对KG-1a细胞线粒体凋亡相关因子的调控作用,验证芪莲益髓清毒颗粒与线粒体结构功能改变之间的关系,进一步探讨芪莲益髓清毒颗粒诱导线粒体凋亡途径及其他相关信号通路。采用高通量测序及生物信息学分析筛选出差异表达的LncRNA并进行基因功能和信号通路分析,为确定相关药物治疗靶点提供有力依据。方法:1.应用液相色谱串联质谱（LC-MS）检测芪莲益髓清毒颗粒中有效成分,借助生信分析预测药物可能对白血病细胞的作用靶点。2.培养人白血病KG-1 a细胞作为体外研究平台,CCK8法筛选芪莲益髓清毒颗粒干预细胞的有效浓度和作用时间。流式细胞仪检测细胞凋亡率,透射电镜观察线粒体形态学改变,荧光显微镜检测细胞内活性氧簇水平、线粒体膜电位、紫外分光光度法检测人白血病细胞线粒体呼吸链酶复合体活性来观察中药对KG-1a细胞株氧化呼吸功能的影响。seahorse XF24细胞线粒体压力测试,检测细胞能量代谢受到重要的影响。3.高通量基因测序,GO和KEGG等生物信息学分析方法筛选芪莲益髓清毒颗粒干预人白血病细胞凋亡相关机制。4.micro RNA转染,Western Blot检测线粒体通路相关凋亡蛋白表达水平,RT-qPCR检测线粒体凋亡相关的mRNA表达水平。结果:1.LC-MS共检测到芪莲益髓清毒颗粒中有9580个物质峰,其中代谢物数量为3336,通过富集分析,有效成分与调节炎症、氧化应激以及线粒体能量代谢相关。2.CCK8法筛选芪莲益髓清毒颗粒干预KG-1a细胞的有效时间和浓度为0.2mg/mL,24h,药物干预后线粒体活性氧簇水平提高和线粒体膜电位降低,线粒体呼吸链酶复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ有显着差异,能量代谢显着抑制。3.高通量基因测序筛选得到差异的LncRNA和差异的mRNA,通过靶基因富集和分析,发现中药干预后的白血病细胞组中的通路和靶基因与氧化呼吸和能量代谢有关联,验证芪莲益髓清毒颗粒可以通过线粒体途径影响白血病细胞KG-1a的凋亡。4.通过对人急性髓系白血病细胞MicroRNA 125a 转染,促凋亡蛋白 p53、bax、caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 的表达增加,而抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-x1的表达减少。结论:1.芪莲益髓清毒颗粒中含有干预白血病细胞线粒体功能的有效成分。2.中药复方颗粒在一定浓度范围内可以促进白血病细胞的凋亡,并对白血病细胞的氧化呼吸和能量代谢有干预作用。3.中药复方可通过NF-κB途径影响白血病细胞线粒体凋亡。
贺今[5]（2019）在《芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策》文中研究指明研究目的苯（C6H6）作为芳香烃毒物,既是油漆、喷漆、制鞋、制药和粘胶等行业中常用的有机溶剂,也是汽车尾气排放、室内装修和香烟烟雾中常见的环境污染物,因此职业暴露人群及普通人群均有机会接触苯,导致慢性苯中毒。慢性苯中毒所引起的血液系统损伤主要表现为白细胞减少和血小板减少,严重者可引起再生障碍性贫血/骨髓造血衰竭（Bone marrow failure,BMF）以及急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）。BMF主要表现为骨髓造血抑制引起的三系细胞减少,其毒性机制主要为苯及其代谢物如氢醌、苯酚在骨髓蓄积引起的造血干/祖细胞毒性,但其具体分子机制尚未完全阐明。流行病学研究表明苯中毒患者引起的AML通常发生于BMF之后,因此苯诱导的AML（Benzene-induced AML,BZ-AML）作为继发性白血病,具有与原发性白血病不同的机制特点,对其发病机制的研究有助于BZ-AML预防及治疗。炎症小体是一类分布于胞浆中的蛋白复合体。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3）是目前研究最广泛及最具有特征性的炎症小体之一,在接受到内源性危险信号如ROS刺激后可活化并诱导免疫和炎性反应,因此在免疫防御及氧化应激方面具有重要意义。目前研究已经表明苯可引起ROS的过度生成,而ROS是NLRP3炎症小体的内源性激活物。那么,NLRP3炎症小体是否在苯诱导的氧化应激损伤中发挥作用?NLRP3炎症小体的活化与机体T淋巴细胞免疫功能损伤有无关联?通过调控与苯诱导的骨髓毒性相关的哪些分子通路发挥作用?在苯诱导的BMF和AML不同造血损伤中NLRP3的表达有无异同?现在尚不清楚。苯作为芳香烃毒物,主要与胞浆内的芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）结合,AhR是一种存在于胞浆中的配体激活的转录因子,苯作为外源性配体与胞浆中AhR结合后使其受到活化而进入细胞核中,进而启动目标基因的表达。目前研究证实AhR基因敲除小鼠在苯染毒暴露后不再引起骨髓造血毒性,表明AhR是苯诱导骨髓造血毒性的重要胞浆转录因子。目前认为苯诱导的造血毒性的主要机制有两点:1、苯与骨髓细胞浆内的AhR结合后直接作用于造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）引起细胞周期、基因调控、凋亡及氧化应激的异常,从而引起HSC的增殖期和静止期平衡异常;2、苯的代谢物如苯醌、氢醌与骨髓细胞的AhR结合后引起的细胞毒性反应。因此,AhR在苯的造血毒性机制中具有重要作用,但其具体分子调控机制尚不清楚。目前建立的苯诱导的造血损伤动物模型,在不同的种系、苯暴露剂量和途径及时间均进行了实验性研究,然而尚欠缺可完全复制的苯诱导的BMF、AML动物模型。我们在总结既往动物模型建立研究基础上,优化了苯暴露途径、剂量、时间,分别应用不同苯暴露的方案建立了拟人化的BMF和AML小鼠模型。在建模基础上,进一步明确苯与AhR结合后能否激活NLRP3炎症小体,及NLRP3异常表达在苯诱导骨髓细胞氧化损伤中的作用。此外,分别利用淫羊藿多糖（Epimedium polysaccharides,EPS）对苯诱导的 BMF 及鸦胆子苦醇（Brusatol）对苯诱导的AML进行药物治疗干预,进一步验证NLRP3的异常表达在苯诱导的BMF和AML不同造血毒性中的作用。为明确AhR介导的NLRP3炎症小体异常活化在苯诱导的造血毒性中的作用及EPS、Brusatol的临床应用提供了体内实验依据。本论文从以下两个方面进行了研究:一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策:在成功采用皮下注射苯的方法建立苯诱导的BMF小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓细胞中AhR及NLRP3炎症小体基因及蛋白表达均明显增高,表明AhR及NLRP3炎症小体的异常活化与骨髓造血衰竭密切相关;应用EPS能通过抗凋亡、抑制氧化应激、增强T淋巴细胞免疫功能及调节造血因子紊乱机制发挥改善骨髓造血衰竭的作用。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策:在成功采用吸入苯的方法建立BZ-AML小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓单个核细胞的NRF2及NLRP3炎症小体的异常活化与苯的致白血病作用密切相关,Brusatol通过抑制骨髓单个核细胞NRF2、NLRP3的基因及蛋白表达及诱导凋亡发挥抗白血病作用。研究方法一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策1.50只CD1雄性小鼠分为建模组和对照组。建模组40只,分为4个亚组（10只/组）:BMF组、EH组、EL组、CsA组,背部皮下注射苯油混合物,对照组（Control组）10只背部皮下注射等量玉米油,每周注射3次（周一、三、五）,直至累计完成25次注射剂量。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.利用剪尾取血法采集外周血,兽用血细胞计数仪检测白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）计数以及网织红细胞（RC）百分比、血红蛋白（Hgb）浓度的变化;利用HE染色观察外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学改变,通过与对照组比较,验证苯诱导的BMF小鼠的成模率。3.设计AhR、CYP1A1特异性引物,骨髓细胞经裂红及离心后获得骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）,利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测AhR及CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和BMMNCs中的差异表达。4.利用流式细胞仪检测BMMNCs中ROS的生成及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分比,qPCR和Western blot方法检测NLRP3的表达,研究NLRP3炎症小体异常表达在苯诱导的氧化应激损伤及免疫毒性中的意义。5.利用流式细胞仪检测BMMNCs的细胞周期、细胞凋亡率,Western blot方法检测D1型细胞周期蛋白（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶K4（Cyclin-dependent kinases K4,CDK4）蛋白的表达水平,研究细胞周期及细胞凋亡率的异常在苯诱导的BMF发病机制中的意义。6.建模成功后,给予 EH 组（EPS100mg/kg）、EL 组（EPS20mg/kg）、CsA 组（CsA1Omg/kg）小鼠采用灌胃给药治疗4周,BMF组及对照组给予等量生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续4周。通过观察各组小鼠体重变化,兽用血细胞分析仪检测小鼠血常规变化,显微镜观察外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理学变化,观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用。7.为明确EPS对苯诱导的BMF的治疗作用机制,本研究进一步利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞凋亡率的变化,通过qPCR方法观察BMMNCs 凋亡相关基因 Caspase-9、BCL-2、BAX 的表达,进一步 Western blot方法检测BAX蛋白的表达,观察EPS对凋亡的影响及机制。8.为明确EPS是否通过调控细胞周期发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞周期的变化,通过qPCR及Western blot方法检测BMMNC中CDK4基因和蛋白的表达,观察EPS对于细胞周期的影响。9.为明确EPS是否通过调控免疫及造血因子发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪及ELISA方法,检测各组小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化,以及外周血造血调控因子IL-2、IL-11和EPO浓度的变化,观察EPS对于T细胞亚群及细胞因子的影响。10.为明确EPS是否通过调节BMMNCs的氧化应激损伤发挥作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs中ROS水平变化,进一步qPCR检测BMMNCs中NLRP3炎症小体基因表达变化,观察EPS对于氧化应激损伤的影响。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策1.将30只雄性CBA/Ca小鼠随机分为3组（10只/组）:对照组、BZ-AML组、Brusatol组。对照组（Control组）小鼠吸入空气,BZ-AML组、Brusatol组小鼠通过静式染毒柜吸入苯:苯浓度300ppm,每天6小时（6h/d）,每周5天（5d/w）,连续8周。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.通过血常规、外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学检查以及流式细胞仪检测CD34+、CD45+、CD13+、CD19+髓性白血病免疫分型,通过与对照组比较,验证BZ-AML小鼠的成模。3.流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs中的ROS生成及外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞的百分比。4.利用SPE-GC-MS检测BZ-AML小鼠血液、肝脏、肾脏、骨髓不同脏器苯及其代谢产物苯酚、氢醌等的浓度,分析了苯及其代谢物在不同脏器的分布在BZ-AML发病机制中的意义。5.利用流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs的细胞凋亡率及细胞周期的改变,分析凋亡和周期异常在其发病机制中的意义。6.利用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）及 Western blot 检测 BZ-AML小鼠骨髓组织及BMMNCs的NLRP3的表达,Western blot检测BZ-AML小鼠BMMNCs中AhR及CYP1A1的表达,观察AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML发病机制中的意义。7.确认建模成功后,Brusatol用无菌注射用水稀释后,Brusatol组给予腹腔注射Brusatol 4mg/kg,对照组及BZ-AML组均给予腹腔注射等体积的无菌注射用水,每天注射1次,5天/疗程,连续两个疗程。治疗结束后,Western blot检测 BZ-AML 小鼠 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、CDK4、CyclinDl、NLRP3等的表达变化,进一步验证AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中的调控机制。研究结果一、AhR介导的NLRP3信号通路在苯致BMF中作用机制及EPS逆转策略1.建立苯诱导的BMF小鼠模型首先我们利用CD1小鼠皮下注射苯（2mL/kg）的方法建立BMF小鼠模型。血常规结果显示,BMF模型组与对照组比较WBC、RBC、PLT计数、RC百分比及Hgb浓度明显下降;血涂片及骨髓细胞学涂片显示有核细胞均明显减少;股骨组织病理学检查显示骨髓增生度极度低下,造血面积明显减少。结果表明小鼠模型与人类苯诱导的BMF具有相似的造血损伤特征。2.AhR、CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和骨髓中的差异性表达为了明确AhR和CYP1A1在苯诱导的造血毒性中作用,本研究首先检测了苯蓄积的主要靶器官肝脏和骨髓中AhR和CYP1A1的表达。qPCR方法检测基因表达和Western blot方法检测蛋白表达结果显示,与对照组相比,BMF组小鼠AhR和CYP1A1在骨髓和肝脏表达均明显升高,而在骨髓细胞的表达增高较肝脏更为显着。3.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的ROS增高及NLRP3炎症小体活化为了研究NLRP3在苯诱导的骨髓毒性中的作用,本研究在成功建立BMF模型基础上,首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS生成,明确苯暴露是否诱导小鼠骨髓氧化应激损伤。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的ROS产生明显增高。为观察苯诱导的ROS生成增加是否引起NLRP3的活化,本研究应用qPCR和Western blot检测了 BMMNCs的NLRP3的表达,mRNA及蛋白结果均表明BMF模型组BMMNCs的NLRP3表达明显增高。因此,苯诱导的骨髓细胞ROS增高引起的NLRP3炎症小体的活化与骨髓毒性密切相关。4.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的S期阻滞及CDK4、CyclinD1蛋白表达降低为了观察苯暴露对BMF模型小鼠BMMNCs细胞周期的影响,本研究首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的细胞周期的改变。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠S期细胞百分比明显增加。进一步用Western blot检测周期调控相关的CDK4、Cyclin D1蛋白的表达,发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的CDK4、Cyclin D1的蛋白表达明显降低。5.苯诱导BMF小鼠模型外周血造血因子IL-11、IL-2、EPO的失调为了观察苯诱导的BMF是否伴随造血因子的紊乱,本研究应用ELISA检测了血浆IL-11、IL-2、EPO的表达,发现与对照组相比,BMF模型组IL-2及EPO明显增高但IL-11降低,结果表明造血因子的紊乱在苯诱导的BMF发病机制中起一定作用。6.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的体重减轻为了观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用,我们在利用雄性CD1小鼠皮下注射苯的方法成功建立BMF小鼠模型后,给予不同剂量组的EPS灌胃治疗4周。发现与未治疗的BMF小鼠发生的进行性消瘦比较,EH组和EL组小鼠体重增加。这说明EPS具有缓解BMF引起的小鼠体重减轻的作用。7.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的造血损伤EPS治疗4周后,与未治疗的BMF小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血常规示WBC和PLT计数、Hgb浓度、RC百分比均增加,外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理检测均显示骨髓有核细胞增加,这些结果表明,EPS能改善苯诱导的BMF。8.EPS通过下调BAX表达抑制苯诱导的BMMNCs过度凋亡因为观察到苯诱导BMF组小鼠的BMMNCs凋亡率增高,本研究进一步观察了 EPS治疗后小鼠BMMNCs凋亡率的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs凋亡率下降,进一步检测凋亡相关基因BAX、BCL-2、Caspase-9,发现EPS治疗组BMMNCs中BAX基因水平降低,Caspase-9、BCL-2则没有明显统计学差异。进一步蛋白结果验证也表明,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs的BAX蛋白表达降低。这些结果表明,EPS是通过下调BAX基因及蛋白表达发挥抗凋亡作用。9.EPS通过上调CDK4减轻苯诱导的BMMNCs的S期阻滞为了观察EPS改善苯诱导的BMF是否与周期调控有关,本研究进一步检测了 EPS治疗后小鼠BMMNCs细胞周期的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的S期阻滞减轻,进一步检测CDK4的表达,我们发现EPS治疗组和药物阳性对照CsA组小鼠的BMMNCs的CDK4表达上调。这些结果表明,EPS治疗通过上调CDK4的蛋白表达减轻了苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的S期阻滞。10.EPS通过抑制NLRP3炎症小体的活化减轻苯诱导的氧化应激损伤体外研究已经证实EPS具有抗氧化应激作用,本研究进一步用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS的水平变化,观察EPS改善苯诱导的BMF与氧化应激损伤的关系。结果发现EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的ROS的增高受到抑制。qPCR结果显示EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的NLRP3的mRNA表达均明显降低。这些结果表明EPS可能通过抑制NLRP3炎症小体的活化发挥减轻苯诱导的骨髓细胞氧化应激损伤。11.EPS改善了外周血CD4+/CD8+T细胞比例及纠正造血因子的失衡为了观察EPS对苯诱导的BMF是否具有免疫调节作用,本研究进一步流式细胞仪检测了 EPS治疗后T淋巴细胞百分比及ELISA检测造血因子水平的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的CD3+、CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比例明显增加;与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血浆IL-11增高而IL-2和EPO降低。结果表明经EPS治疗后,苯诱导的BMF引起的T淋巴细胞免疫抑制及造血因子失衡得到缓解,EPS具有增强T淋巴细胞免疫功能和纠正造血因子失衡的作用。二、AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中作用机制及Brustol逆转策略1.采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型雄性CBA/Ca小鼠,采用静式吸入苯暴露染毒方法建立BZ-AML小鼠模型,与对照组比较,BZ-AML组小鼠血常规显示WBC、RBC和PLT降低,中性粒细胞百分比增高,外周血及骨髓细胞学涂片显示明显增多的原始细胞;肝脏病理检查显示原始细胞对肝窦的浸润伴脂肪细胞的增多;骨髓病理检查显示有原始细胞浸润骨膜,通过SPE-GC-MS分析苯及其代谢物,结果表明BZ-AML组与对照组相比,其血液、骨髓、肾脏、脾脏和肝脏中的含量明显高于对照组,BZ-AML组BMMNCs出现与人类相似的髓性白血病免疫分型表现:CD34+、CD13+、CD19-。2.苯诱导BZ-AML小鼠的免疫功能抑制建模完成后,应用流式细胞仪检测BZ-AML组和对照组小鼠外周血的T淋巴细胞亚群结果表明,BZ-AML组的CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+的T淋巴细胞明显低于对照组。表明BZ-AML的发病机制与苯诱导的免疫功能明显抑制密切相关。3.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2活化BZ-AML组与对照组比较,qPCR及Western blot结果表明BMMNCs的AhR、CYP1A1、NLRP3、NRF2基因和蛋白表达明显增高;免疫组化也表明骨髓组织的NRF2、NLRP3蛋白表达增强,研究结果证明在苯与AhR结合后可进一步诱导BMMNCs及股骨组织NRF2、NLRP3的活化,这可能是BZ-AML的发病机制之一。4.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs凋亡受阻、G0/G1期阻滞BZ-AML组和对照组比较,流式细胞仪结果表明BMMNCs的细胞凋亡受阻、G0/G1期细胞百分比增高,研究结果证明苯诱导了 BMMNCs的凋亡阻遏及G0/G1期阻滞。5.Brusatol治疗能抑制BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2的活化经Brusatol治疗10天后,1HC及Western blot结果表明与BZ-AML组小鼠比较,Brusatol组小鼠NLRP3、KEAP1及NRF2蛋白的表达明显降低,结果表明Brusatol通过抑制NLRP3及KEAP1-NRF2的活化发挥抗白血病作用。6.Brusatol治疗能诱导BZ-AML小鼠BMMNCs的凋亡经Brusatol治疗10天后,流式细胞仪检测对照组、BZ-AML组、Brusatol组小鼠 BMMNCs 晚期凋亡率分别为 4.27±0.42%,1.20±0.50%,2.14±0.28%。结果表明,Brusatol能诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的凋亡,从而发挥抗白血病作用。研究结论一、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在苯诱导的BMF中发挥重要作用1.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的ROS过度生成,ROS可引起NLRP3炎症小体的活化;2.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的凋亡率增加和S期阻滞;3.AhR和CYP1A1在肝脏和骨髓高表达,但骨髓表达增高更明显,其组织的差异表达是苯诱导的BMF造血毒性的重要机制;4.外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞降低及造血因子IL-11、IL-2和EPO的失衡与苯诱导的BMF免疫毒性密切相关。二、EPS通过抗凋亡、抗炎、减轻周期阻滞、增强T细胞免疫功能发挥改善骨髓造血衰竭的作用1.EPS能通过的下调BMMNCs的BAX基因和蛋白的表达发挥抗凋亡作用;2.EPS能通过抑制BMMNCs的NLRP3炎症小体活化、降低ROS生成发挥抗氧化应激作用;3.EPS能通过上调BMMNCs的CDK4蛋白表达减轻S期阻滞的作用;4.EPS通过增加外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比及改善IL-11、IL-2和EPO造血因子的失衡,发挥增强免疫的作用。三、利用CBA/Ca小鼠采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型1.外周血及骨髓细胞学涂片、肝脏及骨髓病理检查均显示原始细胞增多,结合骨髓细胞的白血病免疫分析:CD34+、CD13+、CD19-,验证了拟人化的BZ-AML动物模型成功构建;2.BZ-AML 小鼠外周血的 CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞免疫功能明显受抑制;3.BZ-AML小鼠存在BMMNCs的凋亡抑制及G0/G1期的阻滞。四、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在BZ-AML中发挥调控作用1.BZ-AML 小鼠的 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、NLRP3 均表达增强,表明苯和AhR结合后引起了 NRF2、NLRP3活性增强;2.Brusatol通过诱导BMMNCs凋亡增加发挥抗白血病作用;Brusatol明显降低了NLRP3、KEAP1-NRF2相关基因和蛋白的表达,表明Brusatol抗白血病机制与抑制NLRP3炎症小体、KEAP1-NRF2的活化密切相关。创新性和意义1.明确了在苯诱导的BMF小鼠模型中,苯暴露引起BMMNCs的ROS过度生成并伴随NLRP3炎症小体的活化;2.体内实验证明了 EPS、Brusatol对苯诱导的BMF、AML具有治疗作用;3.体内实验证明EPS、Brusatol可能通过抑制NLRP3活性发挥改善骨髓造血毒性的作用;4.发现了 AhR和CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠的肝脏和骨髓的差异性表达,其在骨髓的增高更为显着,为苯的造血毒性机制提供了新观点;5.研究结果为EPS、Brusatol治疗苯诱导的BMF、AML不同造血毒性的临床应用奠定了实验基础。局限性1.未进行体外细胞培养深入探究苯诱导的ROS生成与NLRP3炎症小体的活化的剂量-效应关系,故ROS水平与NLRP3炎症小体活化的浓度-效应关系尚未确定;2.由于时间的关系,未深入研究苯与胞浆的AhR结合后是如何调控胞内NLRP3活化的具体分子通路。
钱娟[6]（2019）在《重组人血小板生成素对造血细胞、间充质干细胞作用的基础及临床研究》文中研究表明第一部分 重组人血小板生成素对32D细胞、间充质干细胞体外作用及机制研究目的探讨重组人血小板生成素（rhTPO）对经再生障碍性贫血（AA）患者血清处理后的小鼠32D细胞及大鼠骨髓间充质干细胞的体外作用及可能作用机制,以阐明其治疗再障的机制。方法（1）用CCK8法及台盼蓝活细胞计数实验验证不同浓度rhTPO（50u/ml、100u/ml、150u/ml和200u/ml）对稳定转染rhTPO受体（32D-MPL）的32D细胞增殖能力的影响,得到rhTPO促进32D细胞增殖能力的最佳浓度;（2）将32D细胞分成4组:①空白对照组（32D细胞+正常FBS血清）;②AA组（32D细胞+正常FBS血清+再障血清）;③rhTPO对照组（32D细胞+正常FBS血清+rhTPO）;④rhTPO组（32D细胞+正常FBS血清+再障血清+rhTPO）;大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）分成3组:①正常BMSC;②AA组（正常BMSC+AA血清）;③rhTPO组（正常BMSC+AA血清+rhTPO）,用CCK8法及台盼蓝染色法检测不同培养条件下的细胞的增殖能力及生长曲线;（3）用Annexin V-FITC标记各组32D细胞和大鼠BMSC细胞,并用流式细胞仪分析,检测AnnexinV+/PI-比例,了解细胞凋亡情况;（4）用流式细胞仪检测不同培养条件下的对数生长期大鼠BMSC的细胞周期;（5）用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测抗凋亡基因Survivin和BCL-2及促凋亡相关基因BAX以及基因Bcl-xl、c-myc的mRNA的表达;（6）用免疫印迹法（Western-blot）检测STAT3、STAT5、抗凋亡基因Survivin和BCL-2、促凋亡相关基因BAX及Bcl-xl、c-myc的蛋白表达;同样的方法检测不同组别的大鼠BMSC的c-MPL的蛋白表达。结果（1）经再障血清处理后的32D细胞凋亡率明显升高,显着抑制32D细胞增殖,加入rhTPO能降低细胞的凋亡率,促进32D细胞增殖,但rhTPO无法使其恢复到正常血清组细胞的增殖水平;（2）再障血清组32D细胞内的STAT3蛋白磷酸化水平高于正常血清组,STAT5蛋白磷酸化表达水平明显低于正常血清组;经rhTPO处理后再障血清组STAT3蛋白磷酸化水平下调,STAT5蛋白磷酸化水平上调,差异均具有统计学意义。（3）再障血清组32D细胞抗凋亡基因Survivin和BCL-2的mRNA及蛋白水平明显下降,经rh,IPO处理后mRNA及蛋白表达水平均显着上调（P<0.05）;再障血清组32D细胞促凋亡基因BAX的mRNA及蛋白水平明显上升,经rhTPO处理后mRNA及蛋白表达水平均显着下调（P<0.01）;相对于正常血清组,rhTPO处理后正常血清组32D细胞BAX蛋白表达水平明显下调（P<0.05）,而mRNA水平无明显变化;（4）再障血清培养大鼠BMSC细胞,加rhTPO刺激后促进BMSC增殖及表面c-MPL的表达,并能抑制细胞凋亡,且具有统计学意义。结论（1）32D细胞经再障血清处理后,凋亡率明显增加,加入rhTPO能逆转32D细胞的凋亡率,促进32D细胞增殖,但无法使再障血清组细胞恢复至正常血清组细胞增殖水平。（2）rhTPO作用于再障血清组32D细胞,可上调抗凋亡基因（Survivin、BCL-2）mRNA及蛋白表达水平;并下调促凋亡基因（BAX）mRNA及蛋白表达水平,两者差异均有统计学意义;（3）rhTPO可促进AA血清培养后大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及c-MPL的表达,抑制细胞凋亡。第二部分 rhTPO联合激素及环孢素A治疗免疫相关性血细胞减少症20例近期疗效及安全性目的评价重组人血小板生成素（rhTPO）联合激素及环孢素对免疫相关性血细胞减少症（IRH）近期疗效及安全性的影响。方法回顾性分析激素及环孢素联合rhTPO治疗20例成人IRH患者,以同期单用标准激素及环孢素方案的14例患者为对照组,比较两组患者血液学反应及血小板恢复情况,以及安全性评价。结果治疗后2周,rhTPO组患者血小板升高较对照组明显（P<0.05）;治疗后6周,rhTPO组患者血红蛋白较对照组升高明显（P<0.05）;rhTPO组患者脱离血小板输注时间较对照组短。治疗4周后,rhTPO组与对照组脱离血小板输注时间无统计学差异,rhTPO联合治疗组在治疗后2周、4周、6周红细胞输注量的差异无统计学意义,而治疗后8周的红细胞输注量有统计学差异,治疗后3个月及6个月,rhTPO组患者与对照组患者血液学反应无明显统计学差异。结论rhTPO提高IRH的早期血液学反应率,加快血小板恢复,且安全性高。
钱小丽[7]（2019）在《TKIs治疗慢性髓性白血病后BCR-ABL的预后价值、疗效分析和ABL激酶结构域突变的意义》文中研究表明(一)伊马替尼治疗慢性髓性白血病后3、6个月BCR-ABL的预后价值目的:探讨伊马替尼治疗慢性髓性白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）3、6个月后BCR-ABL转录本水平在疗效监测中的价值,为CML患者早期干预提供依据。方法:选取苏州大学附属第一医院血液科2009年9月—2017年4月期间收治的700例初诊慢性期CML患者作为研究对象,所有患者初诊使用伊马替尼进行治疗,且持续时间2年及以上,累积药物减量及停药时间在2周以内。患者均在治疗前全面检查,包括外周血细胞分类,骨髓细胞形态,常规骨髓染色体,qPCR检测BCR-ABL融合基因。根据年龄、脾脏大小、血小板计数及原始细胞数计算Sokal评分。患者口服伊马替尼400mg/d,每周检测1次血常规,血液学缓解后每2周检查1次,治疗开始后第3、6、12、18、24个月检测骨髓染色体及BCR-ABL融合基因。根据早期分子学反应（early molec-ular reaction,EMR:3 个月时的 BCR-ABL≤10%）分组,比较EMR与非EMR组间及非EMR组内不同亚组间的累积CCyR、MMR。结果:本组患者根据Sokal积分分析,164例（23.43%）系高危,348例（49.71%）中危,188例（26.86%）低危。本研究中369例（52.71%）达到EMR,331例（47.29%）未达到,以此把患者分为EMR组与非EMR组。检测CML患者在伊马替尼治疗后不同时间点的骨髓染色体,EMR组在3、6、12、18、24个月时累计分别有 176、219、336、347、358 例获得了 CCyR;非 EMR组在 3、6、12、18、24个月时累计分别有0、22、95、168、190例获得了 CCyR。EMR组10例,非EMR组130例在观察到24个月截止时间点仍未出现CCyR,图中以删失标示;EMR组与非EMR组比较在不同的时间点均有更多的患者达到CCyR,差异具有统计学意义（P<0.05）。qPCR检测CML患者在伊马替尼治疗后各时间点的BCR-ABL表达,EMR组在3、6、12、18、24个月时累计分别有0、64、224、305、332例获得了 MMR;非EMR组在3、6、12、18、24个月时累计分别有0、0、28、79、101例获得了 MMR。EMR组7例,非EMR组41例在观察到24个月时未出现MMR,图中以删失标示;两组比较,EMR组较非EMR组在后续的不同时间点有更多的患者达到MMR,差异具有统计学意义（P<0.05）。把未达EMR的患者按6个月时的BCR-ABL水平分为BCR-ABL≤1%（Ⅱ组）,1%～10%（Ⅲ组）,>10%（Ⅳ组）3个不同的亚组,与EMR组（Ⅰ组）比较12个月CCyR及18个月MMR。结果显示,未达EMR的患者中6个月BCR-ABL≤1%的患者12个月CCyR及18个月MMR与EMR组无统计学差异（P>0.05）,而BCR-ABL在1%～10%组及>10%组与EMR组比较均有显着性差异（P<0.05）。结论:CML慢性期患者伊马替尼治疗后的达EMR及EMR失败后6个月BCR-ABL≤1%能够预示良好的预后,推测可以作为早期干预的依据之一。（二）伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼对初诊慢性粒细胞白血病患者的临床分析目的:比较伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼对初诊慢性粒细胞白血病患者的疗效差异方法:选取苏州大学附属第一医院血液科2016年1月—2017年4月期间收治的314例CML患者,诊断标准参照2016年中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南进行评定。依据治疗TKI药物不同分为三组,伊马替尼治疗组、尼洛替尼治疗组和达沙替尼治疗组。根据3个月获得完全血液学反应（CHR）,6个月获得部分细胞遗传学反应（PCyR）,12个月获得完全细胞遗传学反应（CCyR）和18个月获得主要分子学反应（MMR）,分析三组的疗效差异。同时分析三组的不良反应,用于评价药物的安全性。结果:尼洛替尼治疗组和达沙替尼治疗组中患者的完全细胞遗传学反应（CCyR）和主要分子学反应（MMR）,与伊马替尼治疗组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）,并且尼洛替尼的治疗效果优于达沙替尼。尼洛替尼治疗12和18月后慢性期患者的完全细胞遗传学反应（CCyR）百分比分别为87.21%和89.53%,与伊马替尼治疗组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。同样尼洛替尼治疗组的主要分子学反应（MMR）,与伊马替尼治疗组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。以上结果表明尼洛替尼治疗CML慢性期患者改善效果更加明显。同时尼洛替尼和达沙替尼的血液学不良反应累计发生率明显低于伊马替尼治疗组,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论:尼洛替尼和达沙替尼对CML患者疗效要优于伊马替尼,同时有较少血液学不良反应发生。（三）ABL激酶区突变的检测及临床意义目的:探讨ABL激酶区突变的检测及临床意义方法:选取苏州大学附属第一医院血液科2014年1月—2017年4月期间收治的368例CML患者,其中CML中IM耐药的患者58例。共分为四组:IM耐药突变组、IM耐药无突变组、IM未耐药突变组和IM未耐药无突变组;q-PCR检测各组ABL激酶区突变和Sokal评分。分析ABL激酶区突变对患者耐药和生存的影响。结果:58例IM耐药患者中共检测出12例ABL激酶区突变,IM耐药突变组中3例疾病处于慢性期（CP）,4例疾病处于加速期（AP）和5例疾病处于急变期（BP）;与CP相比,AP/BP中KD突变的频率更高,并且随着疾病持续时间的增加而增加。12例患者的ABL激酶区突变类型,其中T315I突变发生率8.62%（5/58）,F317L、M244V、F359V 和 E255V 突变发生率 3.45%（2/58）,G250E、V299L、F359C、L384M、H396R、Y253H、E459K 和 M351T 突变发生率 1.72%（1/58）。ABL激酶区突变与Sokal评分正相关,并且未突变的患者有更好的无进展生存期。58例患者中位随访时间为40.5（6.0-108.0）个月,耐药突变组60个月EFS率和OS率分别为33.3%（4/12）和75%（9/12）,而耐药未突变组60个月EFS率和OS率分别为71.17%（33/46）和78.26%（36/46）。耐药突变组60个月EFS率与耐药未突变组相比,差异具有统计学意义（P=0.0432）。而耐药突变组60个月OS率与耐药未突变组相比,差异无统计学意义（P=0.6532）。结论:突变检测有利于部分患者的进行早期干预和TKI用药时机转变。对于疗效丧失、疗效不佳或有任何疾病进展迹象的患者进行突变检测具有非常大的临床意义。
陈定宝,张焕,张银华,王颖,宋秋静,杨申淼,崔恒,赵昀,房新志,沈丹华[8]（2018）在《生殖系统淋巴造血组织增生性病变的临床病理特征分析》文中提出目的探讨生殖系统的淋巴造血组织增生性病变（包括淋巴造血组织肿瘤和淋巴瘤样病变）的临床病理特征。方法收集2006年1月至2017年8月北京大学人民医院收治的生殖系统出现首发症状的淋巴造血组织增生性病变患者共33例。其中,生殖系统的淋巴造血组织肿瘤20例,包括髓细胞肉瘤和髓性白血病11例、原发性生殖系统非霍奇金淋巴瘤（NHL）9例;子宫颈淋巴瘤样病变13例。应用光镜观察、免疫组化染色、EB病毒原位杂交及临床相关检查对其临床病理特征进行回顾性分析。结果 （1）年龄:20例淋巴造血组织肿瘤患者的年龄范围为16～77岁,平均年龄48.5岁,中位年龄56岁。13例子宫颈淋巴瘤样病变患者的年龄范围为23～62岁,平均年龄45.9岁,中位年龄48岁。（2）临床表现:20例生殖系统的淋巴造血组织肿瘤患者的临床表现为发热、乏力、下腹痛、阴道流血,以及肿物等;13例子宫颈淋巴瘤样病变患者的临床表现多为接触性出血。（3）病史:20例淋巴造血组织肿瘤患者中,8例患者有急性髓性白血病病史,3例患者妊娠合并髓性白血病病史;1例慢性淋巴细胞白血病/小细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）患者有卵巢小细胞癌和高级别卵巢浆液性癌术后化疗病史,1例弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者有肾移植术后应用环孢素病史。（4）实验室检查:18例有血清乳酸脱氢酶（LDH）水平检测结果的淋巴造血组织肿瘤患者中,9例（9/18）血清LDH水平升高。（5）肿瘤部位:20例淋巴造血组织肿瘤患者中,肿瘤位于外阴4例,阴道1例,子宫颈4例,子宫4例,卵巢8例,胎盘2例。（6）临床分期:9例原发性生殖系统NHL患者中,Ⅰ期4例,Ⅲb期1例,Ⅳ期4例。（7）病理类型:20例淋巴造血组织肿瘤患者中,髓细胞肉瘤9例,髓性白血病侵犯胎盘2例,DLBCL 6例,CLL/SLL及黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALToma）各1例,间变大细胞淋巴瘤（ALCL）1例。（8）免疫组化法检测:髓细胞肉瘤和髓性白血病为CD43、髓性过氧化物酶（MPO）呈阳性表达,NHL为CD20、配对盒基因5抗体（PAX5）呈阳性表达。（9）治疗及预后:淋巴造血组织肿瘤多采用手术切除辅以化疗。随访期内,20例淋巴造血组织肿瘤患者中,髓细胞肉瘤或髓性白血病5例死亡,NHL 2例死亡;13例子宫颈淋巴瘤样病变患者均健在。结论临床病史、病理形态和免疫组化法检测对于诊断生殖系统的淋巴造血组织肿瘤具有重要作用,治疗采用手术治疗辅以化疗。子宫颈淋巴瘤样病变应与淋巴瘤鉴别,前者的预后良好。
赵淑清,李军民[9]（2015）在《粒细胞集落刺激因子及其受体与血液相关疾病》文中认为粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,又称集落刺激因子3（CSF3）,是体内非常重要的细胞生长因子,能够调节粒系细胞的增殖、分化与存活,诱导T细胞免疫耐受,可以抑制急性移植物抗宿主病（GVHD）的发生。G-CSF的受体CSF3R属于I型细胞因子受体超家族,与G-CSF结合后激活JAK-STAT、Ras/Raf/MEK/ERK等信号通路。在临床上G-CSF广泛应用于粒细胞减少性疾病及化疗后粒细胞缺乏,也是自体或异基因移植时外周血干细胞动员剂,在G-CSF联合化疗的预激方案中,G-CSF通过诱导白血病细胞分化、生长停滞、细胞凋亡,以增强白血病细胞对化疗的敏感性。近年来随着分子遗传学以及临床研究的进展,CSF3R突变被发现与重型先天性粒细胞减少症（SCN）向白血病转化有关,而且常见于慢性中性粒细胞白血病（CNL）,这些可能为疾病的靶向治疗提供理论基础。本文将对G-CSF及其受体在血液相关疾病领域的临床应用进展进行综述。
许晓军[10]（2012）在《能量代谢异常与髓性白血病化疗耐受的研究》文中进行了进一步梳理研究背景白血病细胞耐药是髓性白血病治疗中的一大障碍,是治疗失败的主要原因之一。多药耐药可通过P糖蛋白、多药耐药性相关蛋白、拓扑异构酶Ⅱ、肺抗药性相关蛋白介导的多药耐药基因的表达而改变。进一步研究白血病的化疗耐药机制,寻找新的治疗靶点,增强化疗敏感性、克服耐药,具有十分重要的临床应用价值。代谢组学可对生物或细胞代谢产物进行定性和定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系,而越来越受到人们的重视。研究者利用代谢组学技术探索格列卫（IM）耐药与敏感的慢粒白血病（CML）细胞的代谢物差异,为IM耐药的治疗提供新靶向和新思路。结果表明：IM耐药与细胞增高的糖酵解活性和磷脂翻转有关；对IM耐药的K562-r和LAMA84-r细胞保持了增高的葡萄糖摄取和乳酸生成的高糖酵解代谢表型。糖酵解活性与肿瘤生成及对放化疗的耐受呈正相关。通过抑制糖酵解酶的活性,可阻断糖酵解的进行,从而使得肿瘤细胞因能量供应缺乏而死亡,但正常细胞不受影响。研究表明,仅依靠抑制有氧糖酵解,并不足以产生显着的具有临床意义的抗肿瘤作用。这可能是由于ATP的耗竭只有达到一定的阈值才能启动细胞的凋亡或坏死程序,最终导致细胞的死亡。近来大规模的基因表达分析表明在造血系统恶性肿瘤中编码糖酵解途径分子的基因选择性表达上调。研究证实在血液肿瘤细胞中,亦存在糖酵解异常现象。3溴丙酮酸（3-BrPA）可有效诱导了多药耐药急性髓系白血病（AML）细胞株HL-60/AR的凋亡,提示阻断细胞的能量供应有可能克服血液肿瘤细胞多药耐药性。泼尼松龙耐药与急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞高葡萄糖消耗明显相关,通过抑制糖酵解可使对泼尼松龙耐药的ALL原代细胞和细胞株对糖皮质激素重新敏感,这种增敏作用可通过细胞重要的能量传感系统腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）来调控。糖酵解的抑制可活化AMPK,导致mTOR的抑制,进而使抗凋亡蛋白Mcl-1表达下调。目前尚未有糖酵解抑制剂联合化疗用于髓性白血病化疗增敏的报道。本研究以髓性白血病耐药细胞能量代谢异常作为切入点,采用分子和细胞生物学等方法系统分析研究髓性白血病糖酵解相关分子的表达与耐药形成的关系,以及在体外调控糖酵解对化疗敏感性的影响并探讨其机制,从而为逆转髓性白血病化疗耐受的治疗提供新思路。第一部分糖酵解相关分子表达与髓性白血病化疗敏感性的研究研究目的1.探讨髓性白血病细胞糖酵解活性与化疗耐受的关系。2.探讨髓性白血病细胞糖酵解相关分子的表达与化疗耐受的关系。3.探讨髓性白血病细胞线粒体ATP合成酶的表达与化疗耐受的关系。材料和方法1.细胞培养：对阿霉素（ADM）敏感和耐药AML细胞株（HL-60和HL-60/ADM）,以及对IM敏感和耐药CML细胞株（K562和K562-R）均采用含10%FBS的RPMI1640（青霉素100U/ml,链霉素100μ g/m1）,置5%CO2培养箱、37℃饱和湿度培养。2.临床标本：54例患者骨髓标本来自南方医院血液科和中山人民医院血液科2010年12月至2011年11月间住院的非M3型AML患者,骨髓白血病细胞≥80%。其中初治45例,复发9例。男31例,女23例,平均年龄41.6±17.8岁。另选取19例健康对照者,男11例,女8例,平均年龄39.2±14.1岁,对照组的年龄、性别构成比与AML病例经卡方检验无明显差异（p>0.05）。3.实验方法：（1）葡萄糖消耗实验检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞株糖酵解活性。（2）荧光定量PCR检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞（细胞株和AML原代细胞）糖酵解相关基因（HIF-1α、FBP1、HK-Ⅱ和GLUT1） mRNA的表达。（3）酶促法检测不同化疗敏感性AML患者血清LDH含量。（4）流式细胞术检测不同化疗敏感性AML患者白血病细胞CD147的表达。（5）免疫印迹（Western Blot）检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞（细胞株和AML原代细胞）线粒体ATP合成酶ATP5B蛋白表达。4.统计分析统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件;统计结果用x±s表示;两样本均数比较采用独立样本t检验,多组间样本均数比较用单向方差分析（one-Way ANOVA）,若方差齐性,组间差异采用LSD法做多重比较；若方差不齐采用welch法检验,组间差异采用Dunnett’s T3法做多重比较。组间率的比较采用卡方检验。以a=0.05为检验标准,采用双侧检验。p值≤0.05时,认为有显着性差异。结果1.髓性白血病细胞株糖酵解活性与化疗耐受性的关系耐药细胞株HL-60/ADM和K562-R的糖酵解活性均明显高于相对应的化疗敏感细胞株HL-60和K562。2.不同化疗敏感性髓性白血病细胞糖酵解相关基因mRNA的表达（1）髓性白血病细胞株糖酵解相关基因mRNA的表达HIF-1α mRNA和GLUT1mRNA在耐药白血病细胞株HL-60/ADM和K562-R中的相对表达水平较化疗敏感的野生型细胞株HL-60和K562高（p<0.01、p<0.05）。而另一糖酵解关键酶HK-Ⅱ mRNA相对表达水平在HL-60耐药细胞株中明显低于野生株（p<0.01）,在K562耐药细胞株中显着高于野生株（p<0.01）。但糖酵解抑制酶FBP1mRNA相对表达水平在HL-60耐药细胞株中明显高于野生株（p<0.01）,在K562耐药细胞株中显着低于野生株（p<0.01）。（2） HIF-1α mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达未缓解（NR）组患者HIF-1α mRNA表达量明显高于对照组、完全缓解（CR）和部分缓解（PR）组,而在对照组、CR和PR组中,HIF-1α mRNA表达量有逐渐升高趋势。（3） FBP1mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达患者FBP1mRNA表达量个体间差异非常大,经F检验提示各组间无差异（p>0.05）。（4） HK-Ⅱ mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达NR组患者HK-Ⅱ mRNA表达量明显高于对照组、CR和PR组,而在对照组、CR和PR组中,HK-Ⅱ mRNA表达量有逐渐升高趋势。（5） GLUT1mRNA在不同化疗敏感性AML患者中的表达NR组患者GLUT1mRNA表达量明显高于对照、CR和PR组,而在对照组、CR和PR组中,GLUT1mRNA表达量有逐渐升高趋势。3.不同化疗敏感性AML患者血清LDH的表达NR组患者血清LDH含量明显高于对照、CR和PR组,而在对照组、CR和PR组患者中,血清LDH含量有逐渐升高趋势。4.不同化疗敏感性AML患者CD147的表达化疗NR组AML患者骨髓白血病细胞CD147的表达明显高于CR和PR组。5.不同化疗敏感性髓性白血病细胞线粒体合成酶ATP5B的表达耐药细胞株HL-60/ADM和K562-R的ATP5B蛋白表达水平明显低于相对应的化疗敏感细胞株；化疗NR组AML患者骨髓白血病细胞ATP5b蛋白明显低于CR组,差异有统计学意义（p<0.05）。结论1.化疗耐药髓性白血病细胞株的糖酵解活性均明显高于相对应的化疗敏感野生型细胞株。2. HIF-1α mRNA和GLUT1mRNA在耐药髓性白血病细胞株中的相对表达水平较化疗敏感的野生型细胞株高。3.化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞HIF-1α、HK-Ⅱ和GLUT1mRNA表达量明显高于敏感组。4.化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞FBP1mRNA表达量与敏感组无差别。5.化疗耐受AML患者血清LDH含量明显高于敏感组。6.化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞CD147的表达明显高于敏感组。7.线粒体合成酶ATP5B蛋白表达水平在耐药髓性白血病细胞株中明显低于化疗敏感的野生型细胞株；同样化疗耐受AML患者骨髓白血病细胞ATP5B蛋白表达水平亦明显低于敏感组。第二部分抑制糖酵解对髓性白血病化疗耐受的影响及机制研究目的1.探讨抑制糖酵解对髓性白血病细胞株化疗耐受性的影响。2.探讨改变糖酵解活性影响髓性白血病细胞株化疗敏感性的可能机制。材料和方法1.细胞培养：对ADM敏感和耐药AML细胞株（HL-60和HL-60/ADM）,以及对IM敏感和耐药CML细胞株（K562和K562-R）均采用含10%FBS的RPMI1640（青霉素100U/ml,链霉素100μ g/m1）,置5%CO2培养箱、37℃饱和湿度培养。2.实验方法：（1）台盼蓝染色计数法检测细胞活力取指数生长期细胞（HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R）,处理组分别加入不同浓度药物（糖酵解抑制剂、化疗药、糖酵解抑制剂+化疗药）,培养3d,每天计数活细胞数目（台盼蓝拒染）。采用Weeb系数检验糖酵解抑制剂联合化疗药是否具有协同效应。（2）MTT法检测细胞活力取指数生长期细胞（HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R）,处理组分别加入不同浓度药物（糖酵解抑制剂、化疗药、糖酵解抑制剂+化疗药）,培养3d,MTT实验检测细胞活力。采用Weeb系数检验糖酵解抑制剂联合化疗药是否具有协同效应。（3）葡萄糖消耗实验检测不同化疗敏感性髓性白血病细胞株糖酵解活性。将106个不同处理组白血病细胞（HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R）置入无血清RPMI1640中,培养4d,收集细胞上清。按照Glucose （HK） Assay试剂盒说明,在波长340nm处观察其吸光度,并计算溶液中的葡萄糖含量。（4） Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡将106个不同处理组白血病细胞（HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R）培养1d后,采用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡情况。（5）RNA干扰HIF1α或GLUT1基因后检测耐药AML细胞化疗敏感性的变化首先设计针对靶基因HIF1P或GLUT1的shRNA序列,通过电转染实验对耐药细胞株HL-60/ADM进行转染,再通过荧光定量PCR和Western Blo检测RNA干扰效果,从而筛选shRNA靶序列。将shRNA序列利用酶切、连接等基因重组技术构建到慢病毒载体pLVX-shRNA1上,然后转染Lenti-X293T细胞进行病毒包装,将包装好的病毒感染HT-1080细胞进行病毒滴度测定；同时用病毒感染HL-60/ADM细胞后检测RNA干扰效果。将包装好的病毒感染HL-60/ADM细胞,通过嘌呤霉素筛选3次后建立稳定表达pLVX-shRNAl-HIFlα和pLVX-shRNAl-GLUTl的HL-60/ADM细胞株。然后,通过MTT法检测经不同浓度组ADM处理后这些细胞株的存活率。3.统计分析统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件;统计结果用x±s表示;两样本均数比较采用独立样本t检验,多组间样本均数比较用单向方差分析（one-Way ANOVA）,并进行方差齐性检验,与对照组比较用Dunnett-t法检验。组间率的比较采用卡方检验。以a=0.05为检验标准,采用双侧检验。p值≤0.05时,认为有显着性差异。结果1.抑制糖酵解对髓性白血病细胞株增殖的影响台盼蓝染色法和MTT法结果显示,糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA联合ADM对耐药细胞株HL-60/ADM具有显着协同作用,而对野生细胞株HL-60不具有协同作用。同样,2-DG或3BrPA联合IM对耐药细胞株K562-R具有显着协同作用,而对野生细胞株K562不具有协同作用。2.抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白病细胞株糖酵解活性的影响糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA单独或联合细胞毒药物使用均可显着降低HL-60和K562敏感和耐药细胞株葡萄糖的消耗,而单独使用细胞毒药物,葡萄糖消耗的减少不明显。3.抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白血病细胞凋亡的影响糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA单独或联合化疗药处理HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R细胞24h后,细胞凋亡率无明显差别；而联合处理明显提高了这些细胞的坏死率。4. siRNA沉默HL60/ADM细胞HIF1P或GLUT1基因表达后化疗敏感性改变构建了稳定表达pLVX-shRNA1-HIFlα和pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM细胞株。MTT结果显示,稳定表达pLVX-shRNAl1HIF1α的HL-60/ADM细胞对ADM的化疗敏感性无明显改变,而稳定表达pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM细胞对ADM的化疗敏感性明显提高。结论1.糖酵解抑制剂2-DG或3BrPA通过抑制葡萄糖消耗可增强ADM对化疗耐药细胞药敏性；同样,2-DG或3BrPA联合IM对K562-R细胞具有协同杀伤作用。2.2-DG或3BrPA对髓性白血病细胞的化疗毒性增强作用主要依赖于非凋亡的细胞死亡途径。3.RNA干扰沉默GLUT1基因可提高HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性,而HIF-1P基因沉默未能明显提高提高HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性。
二、AA方案治疗急性髓性白血病20例分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、AA方案治疗急性髓性白血病20例分析（论文提纲范文）
（1）TKI时代Ph阳性白血病患者疗效观察及耐药患者ABL激酶区突变分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1.研究对象 |
| 1.2.主要仪器 |
| 1.3.主要试剂 |
| 1.4.主要溶液配制 |
| 1.5.实验方法和步骤 |
| 1.6.突变负荷的计算 |
| 1.7.统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1.CML 患者 |
| 2.2.Ph+ALL 患者 |
| 2.3.新型剪接体的筛选与鉴定 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 TKI 耐药机制及新一代 ABL 激酶抑制剂开发的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）红细胞分布宽度在初诊骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、急性白血病、慢性粒细胞白血病中的临床分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 RDW概述 |
| 1.2 RDW与血液系统良性疾病研究进展 |
| 1.3 RDW与血液系统恶性疾病研究进展 |
| 1.3.1 RDW与 MDS |
| 1.3.2 RDW与白血病 |
| 1.3.3 RDW与淋巴瘤 |
| 1.3.4 RDW与多发性骨髓瘤 |
| 第二章 资料与研究方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 纳入标准 |
| 2.3 排除标准 |
| 2.4 研究内容及方法 |
| 2.5 AML(非APL)、MDS预后危险度分层标准 |
| 2.6 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 MDS、AA、AL、CML的 RDW值分布 |
| 3.3 AA中(非重型/重型/极重型)、AL中(ALL/AML)疾病类型与RDW的关系 |
| 3.3.1 AA中非重型、重型、极重型之间的RDW水平比较 |
| 3.3.2 AL中 ALL、AML之间的RDW水平比较 |
| 3.4 MDS、AA、AL、CML的 RDW水平与对照组比较 |
| 3.5 RDW水平在MDS、AA、AL、CML之间的比较 |
| 3.5.1 MDS和AA对比 |
| 3.5.2 MDS和AL对比 |
| 3.5.3 MDS和 CML对比 |
| 3.5.4 AA和AL对比 |
| 3.5.5 AA和CML对比 |
| 3.5.6 AL和CML对比 |
| 3.6 MDS、AML(非APL)预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 3.6.1 MDS预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 3.6.2 AML(非APL)预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 MDS、AA、AL、CML的年龄及与RDW的关系 |
| 4.2 MDS、AA、AL、CML的 RDW水平 |
| 4.3 RDW水平在MDS、AA、AL、CML之间的比较 |
| 4.4 MDS、AML(非APL)预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 焦亡及NLRP3炎症小体在血液系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 急性髓性白血病骨髓微环块中神经破坏与Th免疫失衡的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髄性白血病细胞作用的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（4）芪莲益髓清毒颗粒干预KG-1a人白血病细胞线粒体氧化呼吸与能量代谢的机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照词 |
| 引言 |
| 理论探讨 |
| 一、中医学对急性白血病的认识 |
| 1 历代医家对急性白血病的认识 |
| 2 现代中医学对急性白血病的认识 |
| 二、本课题的研究思路 |
| 1 芪莲益髓清毒颗粒在治疗白血病目前的实验研究思路 |
| 2 中药复方治疗白血病目前的实验研究思路 |
| 三、线粒体的结构和功能在白血病发生发展中的重要作用 |
| 1 线粒体形态结构改变与氧化呼吸功能障碍 |
| 2 线粒体介导的凋亡相关因子 |
| 3 线粒体DNA |
| 4 线粒体异常与白血病 |
| 5 基因通路 |
| 6 急性髓系白血病生物标志物的国内外研究 |
| 实验部分 |
| 一、基于LC-MS的芪莲益髓清毒颗粒储存液的物质基础研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 数据分析 |
| 4 结论 |
| 二、QLYSQD诱导人髓性白血病细胞凋亡的影响 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 三、QLYSQD对KG-1a细胞株线粒体形态结构的影响 |
| 1 实验器材与设备 |
| 2 主要实验试剂 |
| 3 透射电镜制片步骤 |
| 4 观察结果 |
| 5 讨论 |
| 四、QLYSQD对KG-1a细胞株线粒体氧化呼吸功能的影响 |
| (一) 呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的检测 |
| 1 实验用品和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 QLYSQD对KG-1a细胞呼吸链复合体活力值的影响 |
| (二) 中药干预KG-1a细胞对线粒体活性氧簇水平和线粒体膜电位的影响 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| (三) 讨论 |
| 五、QLYSQD对KG-1a细胞株线粒体能量代谢功能的影响 |
| (一）XF24线粒体压力测试 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 六、高通量测序联合分析QLYSQD诱导白血病细胞的凋亡 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 七、探讨microRNA-125a过表达对急性髓系白血病(AML)细胞生物学行为的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 一、本项目的特色与创新之处 |
| 二、问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体与肿瘤的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 科技查新报告 |
| 在读期间发表的论文、着作及参与的科研课题 |
（5）芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一章 芳香烃受体介导NLRP3信号传导通路在苯致造血衰竭中作用机制研究及逆转对策 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 一、BMF建模组小鼠体重随苯注射次数增加而减轻 |
| 二、BMF建模组小鼠血常规、网织红细胞、股骨病理改变 |
| 三、苯诱导BMF小鼠BMMNCs的NLRP3及ROS、CD4+T细胞的改变 |
| 四、BMF小鼠AhR和CYP1A1的表达、凋亡、细胞周期的改变 |
| 五、EPS治疗改善了 BMF组小鼠的体重减轻和造血抑制 |
| 六、EPS治疗通过下调BAX发挥抗调亡作用 |
| 七、EPS通过上调CDK4缓解S期阻滞 |
| 八、EPS抑制NLRP3炎性小体和减轻ROS的产生 |
| 九、EPS增加CD4+T细胞及调节相关造血因子的失衡 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 芳香烃受体介导NLRP3信号传导通路在苯致白血病中作用机制研究及逆转对策 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| —、采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型 |
| 二、BZ~AML组小鼠表现与人类相似的骨髓白血病免疫表型特征 |
| 三、BZ-AML组小鼠外周血T淋巴细胞功能受抑制 |
| 四、BZ-AML组小鼠BMMNCs及骨髄组织NLRP3表达明显增高 |
| 五、BZ~AML组小鼠BMMNCs存在凋亡受抑制、G0/G1期阻滞 |
| 六、BZ-AML组小鼠股骨组织的NRF2活性增强 |
| 七、Brusatol通过诱导调亡发挥抗白血病作用 |
| 八、Brusatol抑制BZ~AML组小鼠体内NLRP3炎症小体的活化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件1 |
| 附件2 |
| 附件3 |
| 附件4 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附录 |
（6）重组人血小板生成素对造血细胞、间充质干细胞作用的基础及临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 重组人血小板生成素对32D细胞、间充质干细胞体外作用及机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、rhTPO对32D细胞的作用 |
| 二、rhTPO对大鼠骨髓间充质干细胞的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 rhTPO联合激素及环孢素A治疗免疫相关性血细胞减少症20例近期疗效及安全性 |
| 引言 |
| 病例与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 再生障碍性贫血 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文、获奖与参加的项目 |
| 致谢 |
（7）TKIs治疗慢性髓性白血病后BCR-ABL的预后价值、疗效分析和ABL激酶结构域突变的意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分: 伊马替尼治疗慢性髓性白血病后3、6个月BCR-ABL的预后价值 |
| 前言 |
| 研究病例与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼对初诊慢性粒细胞白血病患者的临床分析 |
| 前言 |
| 研究病例和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: ABL激酶区突变的检测及临床意义 |
| 前言 |
| 研究病例和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性髓性白血病的治疗选择 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（10）能量代谢异常与髓性白血病化疗耐受的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 糖酵解相关分子表达与髓性白血病化疗敏感性的研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.1.1 细胞株 |
| 1.1.1.2 研究病例 |
| 1.1.1.3 疗效判定 |
| 1.1.2 材料与方法 |
| 1.1.2.1 引物 |
| 1.1.2.2 材料 |
| 1.1.2.3 方法 |
| 1.1.2.4 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 髓性白血病细胞株糖酵解活性与化疗耐受性的关系 |
| 1.2.2 不同化疗敏感性髓性白血病细胞糖酵解相关基因MRNA的表达 |
| 1.2.3 不同化疗敏感性AML患者血清LDH的表达 |
| 1.2.4 不同化疗敏感性AML患者CD147的表达 |
| 1.2.5 不同化疗敏感性髓性白血病细胞线粒体合成酶ATP5B的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 抑制糖酵解对髓性白血病化疗耐受的影响及机制 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.2.1 引物 |
| 2.1.2.2 材料 |
| 2.1.2.3 方法 |
| 2.1.2.4 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 抑制糖酵解对髓性白血病细胞株增殖的影响 |
| 2.2.1.1 抑制糖酵解对HL-60细胞增殖的影响(台盼蓝染色法) |
| 2.2.1.2 抑制糖酵解对HL-60/ADM细胞增殖的影响 |
| 2.2.1.3 抑制糖酵解对K562细胞增殖的影响 |
| 2.2.1.4 抑制糖酵解对K562-R细胞增殖的影响 |
| 2.2.1.5 抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白病细胞株增殖的影响(MTT法) |
| 2.2.1.6 抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白病细胞株糖酵解活性的影响 |
| 2.2.1.7 抑制糖酵解对不同化疗敏感性髓性白病细胞株凋亡的影响 |
| 2.2.2 SIRNA沉默HL60/ADM细胞HIF1A或GLUT1基因表达后化疗敏性改变 |
| 2.2.2.1 SHRNA筛选 |
| 2.2.2.2 慢病毒构建 |
| 2.2.2.3 稳定表达慢病毒基因载体的HL-60/ADM细胞株的建立 |
| 2.2.2.4 稳定HIF1A或GLUT1基因表达受抑HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 致谢 |
| 博士研究生期间的成果 |
| 参加国内国际会议 |
| 统计学审稿证明 |
四、AA方案治疗急性髓性白血病20例分析（论文参考文献）
- [1]TKI时代Ph阳性白血病患者疗效观察及耐药患者ABL激酶区突变分析[D]. 郭雯铮. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]红细胞分布宽度在初诊骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、急性白血病、慢性粒细胞白血病中的临床分析[D]. 杨明月. 兰州大学, 2021(12)
- [3]骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究[D]. 张琛. 山东大学, 2020(08)
- [4]芪莲益髓清毒颗粒干预KG-1a人白血病细胞线粒体氧化呼吸与能量代谢的机制研究[D]. 沈明月. 山东中医药大学, 2019(01)
- [5]芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策[D]. 贺今. 山东大学, 2019(02)
- [6]重组人血小板生成素对造血细胞、间充质干细胞作用的基础及临床研究[D]. 钱娟. 苏州大学, 2019(04)
- [7]TKIs治疗慢性髓性白血病后BCR-ABL的预后价值、疗效分析和ABL激酶结构域突变的意义[D]. 钱小丽. 苏州大学, 2019(02)
- [8]生殖系统淋巴造血组织增生性病变的临床病理特征分析[J]. 陈定宝,张焕,张银华,王颖,宋秋静,杨申淼,崔恒,赵昀,房新志,沈丹华. 中华妇产科杂志, 2018(04)
- [9]粒细胞集落刺激因子及其受体与血液相关疾病[J]. 赵淑清,李军民. 中国实验血液学杂志, 2015(03)
- [10]能量代谢异常与髓性白血病化疗耐受的研究[D]. 许晓军. 南方医科大学, 2012(04)
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