利用BmNPV Bac-to-Bac系统在家蚕体内表达狂犬病毒M蛋白及抗体制备

论文摘要

杆状病毒表达载体系统（Baculovirus Expression Vector System,BEVS）是将外源目的基因导入杆状病毒基因组,获得重组病毒,然后以此作为载体感染昆虫幼虫或其培养细胞。Bac-to-Bac表达系统通过位点特异性转座,在大肠杆菌内完成杆状病毒基因组的重组。BmNPV Bac-to-Bac杆状病毒表达系统由于能够以家蚕为载体大量表达外源蛋白,且省时省力,是制备生物活性蛋白的优良选择。狂犬病毒（Rabies Virus,RV）M基因ORF为609个核苷酸,编码202个氨基酸残基的基质蛋白,分子量约25 KD,其在子代病毒的装配、出芽和形态形成中起重要作用。本研究利用BmNPV Bac-to-Bac表达系统表达了重组的RVM（rRV-M）蛋白,将纯化的rRV-M蛋白作为抗原免疫小鼠,对制备出的血清抗体进行间接ELISA效价测定。本研究结果可以为RVM蛋白的功能探索提供抗原和抗体来源,也能为家蚕生物反应器的开发利用提供参考。研究的具体内容及结果如下:1、通过将RV M基因的ORF定向克隆到供体质粒pFastBacHTA上,构建重组供体质粒pFastBacHTA-M;然后转化至含有BmNPV Bacmid的大肠杆菌DH10BmBac,在辅助载体表达的转座酶作用下,RVM基因转座并插入到Bacmid DNA中,由多角体蛋白基因启动子控制其转录与表达。最后将重组杆粒rBacmid-M与脂质体混合注射五龄起蚕,得到重组杆状病毒rBmNPV-M。2、采集rBmNPV-M病毒感染的家蚕血淋巴细胞进行间接免疫荧光试验,结果显示,rBmNPV-M感染的血淋巴细胞发出特异性的亮绿色荧光,荧光集中分布在细胞质膜周围。对家蚕的血淋巴和脂肪体进行Western-blot试验,鉴定rRV-M蛋白在蚕体内的表达情况,结果显示,rRV-M蛋白在家蚕体内获得大量表达,重组蛋白的相对分子量约为25 KD。3、通过镍离子亲和层析从蚕体中纯化表达的rRV-M蛋白,纯化的蛋白条带单一,纯度良好。纯化的rRV-M蛋白与弗氏佐剂混合,以此为抗原免疫小鼠并分离血清得到多克隆抗体,对血清抗体进行间接ELISA效价测定,效价为1:2560。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭望

导师: 梁湘

关键词: 杆状病毒表达系统,狂犬病毒蛋白,家蚕生物反应器

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 广西大学

分类号: S852.4

总页数: 62

文件大小: 4049K

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