（1.克拉玛依市疾病预防控制中心新疆克拉玛依834000；2.中国疾病预防控制中心北京102206
摘要：目的了解本地区家蝇抗药性基因乙酰胆碱酯酶等位基因在342位点的排列情况，建立本地区家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测方法。方法提取家蝇总DNA，在乙酰胆碱酯酶342位点两端较保守区域合成一对引物，扩增出一段包含有该位点的基因片段，然后采用限制性内切酶Bsp1286I和EaeI分别对扩增产物进行酶切电泳，根据电泳片段大小，确定酶切情况。结果对成功扩增出的30只家蝇DNA片段进行酶切鉴定，其全部为不敏感I型纯合子。结论通过基因分型，本地区家蝇乙酰胆碱酯酶基因为不敏感I型纯合子，该类型基因具有较稳定的遗传性。
关键词：德国小蠊；克拉玛依；抗药性
乙酰胆碱酯酶（（Acetylcholinesterase，AChE）是存在于生物体的一种水解酶，其生理功能是水解神经递质乙酰胆碱为胆碱和乙酸，在昆虫中主要存在于中央神经系统的突触膜上，是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，该酶的变构可以改变昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性而导致昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗药性。Kozaki等发现[1]，家蝇乙酰胆碱酯酶（AchE）氨基酸342Gly的突变与抗性密切相关，编码家蝇乙酰胆碱酯酶342位点氨基酸的密码子有3种不同的非同义突变，产生三种不同形式的乙酰胆碱酯酶，不同型的乙酰胆碱酯酶对杀虫剂敏感性存在差异，其中342G（简写为G）为敏感型，342V（简写为V）和342A（简写为A）为不敏感型，其中342V表示乙酰胆碱酯酶第342位点的氨基酸残基由Gly（甘氨酸）突变为Val（缬氨酸）；342A表示乙酰胆碱酯酶第342位点的氨基酸残基由Gly（甘氨酸）突变为Ala（丙氨酸）。该研究将通过对这一位点进行扩增，用特异性限制内切酶进行该位点的检测，判断其等位基因类型。
1材料与方法
1.1主要仪器设备：捕蝇笼，采用锥形芯圆形捕蝇笼，高40cm，底圆φ25cm，圆锥形芯高35cm，顶口φ2cm，幕制尼龙网，颜色为绿色，诱饵采用甜面酱，全自动核酸提取仪（德国QIAcube），全自动毛细管电泳仪（德国QIAxcel），实时荧光定量PCR（瑞士罗氏LightCycler480）。
1.2试剂：DNA提取试剂盒DNeasyBlood&TissueKit（50）Qiagen69504购自德国QIAGEN公司；PCR扩增试剂盒（Taq）SK2492购自上海生工生物工程有限公司。限制性内切酶Bsp1286I（产品目录号R0120，5000U/mL）和限制性内切酶EaeI（产品目录号R0508，3000U/mL）购自NewEnglandBiolabs公司。引物：上游5’-CGGTGCATTTGGGTTTCTAC-3’，下游5’-CGTAACCGCTAAGATCTGCTG-3’由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.3试虫试验用家蝇现场品系采自克拉玛依市区。
1.4方法
1.4.1家蝇总DNA的提取：采用笼诱法将市区捕获的蝇类现场品系带回实验室，放入-20℃冰箱冷冻8分钟左右，试虫冻晕后进行鉴定，挑出30只家蝇，去除腹部后，分别装入30个1.5ml离心管中，按DNA提取试剂盒操作说明进行提取。
1.4.2乙酰胆碱酯酶片断的PCR扩增：在PCR管中加入10×PCRbuffer（含100mMTris-HCL，500mMKCl，15mMMgCl2）2.5μL，dNTP（2.5mM）2.0μL，引物F0.5μL，引物R0.5μL，单头家蝇的基因组DNA1μL和Taq酶，用水补齐至25μL，混匀。将PCR管放入PCR仪中，设置PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，50℃30s，
2结果
提取的30只家蝇基因组DNA，分别通过特异性引物扩增后，扩增出一条609bp的条带（图1），通过酶切鉴定，该DNA在342位点没有Bsp1286I和EaeI酶的酶切识别位点（图2），判定该地区家蝇为不敏感I型纯合子。
3讨论
乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键酶，主要存在于神经元和神经肌肉接头处[1，2]，为膜结合蛋白，定位于细胞膜和突触前后膜，能快速水解神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）从而终止ACh对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性[3]。AchE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标，Kozaki等发现，家蝇（MuscadomesticaLinnaeus）AchE的4个点突变（342Gly、407Tyr、162lle、407Val），其中342Gly和407Tyr的突变与抗性相关。编码家蝇乙酰胆碱酯酶342位点氨基酸的密码子有3种不同的非同义突变，产生三种不同形式的乙酰胆碱酯酶，不同型的乙酰胆碱酯酶对杀虫剂敏感性存在差异。该实验通过对本地区家蝇乙酰胆碱酯酶342位点氨基酸的密码子进行分型后发现，目前捕获的家蝇在342位点编码的氨基酸均为缬氨酸，属于不敏感Ⅰ型纯合子，说明该抗性具有较稳定的遗传性。
家蝇抗药性分子水平研究是抗性综合治理的突破口。利用分子生物学技术对家蝇抗性进行研究，可获知该地区家蝇的抗性水平，建立详细的抗性资源基因信息库，利于确定治理对策及合理地选择杀虫剂。
参考文献：
[1]KozakiToshinori，ShonoToshio，TomitaTakashi，etal.Fenitroxoninsensitiveacetylcholinesterasesofthehousefly，Muscadomesticaassociatedwithpointmutations.InsectBiochemistryandMolecularBiology，2001，31（10）：991-997.
[2]Eldefrawi，A.T.Acetylcholinesteraseandanticholinesterases；inComprehensiveInsectPhysiology[J].BiochemistryandPharmacology，Kerkut，1985，12，115-130.
[3]MassoulieJ，PezzementiL，BonS，etal.Molecularandcellularbiologyofchlinesterases[J].ProgNeurobiol，1993，41（1）：31-91.
[4]FuhrmannM，HausherrA，FerbitzL，etal.MonitoringdynamicexpressionofnucleargenesinChlamydomonasreinhardtiibyusingasyntheticluciferasereportergene[J].PlantMolBiol，2004，55（6）：869-881.