一、mdm2、p14基因的扩增与胃癌的关系（论文文献综述）
阮涌[1]（2021）在《BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究》文中提出Rec Q-BLM解旋酶在DNA的修复、复制、重组和转录等细胞代谢过程和维持基因组的稳定性中具有非常重要的作用。BLM基因的缺陷将引起人类Bloom综合症（Bloom syndrome,BS）,且易患前列腺癌、乳腺癌、肺癌等癌症。其中,2020年前列腺癌（Prostate cancer,PCa）在我国男性恶性肿瘤中发病率居第七位,死亡率居第十位,PCa已逐渐成为影响我国男性生命健康的常见肿瘤之一。有研究表明BLM在PCa细胞系中高表达,在干扰或过表达BLM后,PC3细胞恶性程度相应的降低或增强;EZH2蛋白是多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2,PRC2）的成员之一,也有研究表明EZH2蛋白与PCa的发生存在密切关系。本论文深入研究了BLM、EZH2与PCa相互关联性,阐明了BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴途径,从分子、细胞、组织和动物水平探索了BLM与EZH2蛋白相互作用对PCa的影响及其机制。其主要研究结果如下:1.BLM与EZH2蛋白主要定位于细胞核内,实验发现这两个蛋白其存在相互作用,预测它们在PCa组织的m RNA中表达水平呈极显着正相关应用Western Bloting实验检测发现BLM在PCa细胞系中高表达,以BLM为诱饵蛋白,通过免疫共沉淀实验联合质谱分析发现与BLM存在相互作用的蛋白有541个,利用TCGA和STRING数据库分析可视化了BLM的相互作用蛋白网络及它们在细胞内的调控关系,其中EZH2蛋白是其相互作用的蛋白之一,且BLM与EZH2在PCa中的表达呈极显着正相关(P-Value=7.9e-74)。在此基础上,我们应用GST Pull down发现BLM与EZH2存在直接相互作用,进一步通过间接免疫荧光实验发现BLM与EZH2主要定位于细胞核。2.BLM与EZH2蛋白在PCa组织中高表达,BLM与EZH2在PCa临床样本中的免疫组化得分呈极显着正相关分别应用BLM和EZH2抗体对50例PCa组织、20例增生组织和9例前列腺组织进行免疫组化研究。发现BLM和EZH2蛋白在PCa组织中相比于正常前列腺高表达,且分别呈显着（P<0.05）和极显着（P<0.01）差异,BLM和EZH2的高表达均与患者的T分期（P=0.030,P=0.012）、临床分期（P=0.030,P=0.012）和Gleason分数（P=0.006,P=0.029）存在显着或极显着相关性,但是与年龄、Gleason分级、淋巴结转移和远处转移没有显着相关性,BLM与EZH2在PCa临床样本中的免疫组化得分呈极显着正相关（P<0.001）。3.干扰BLM和EZH2蛋白能够显着抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,并可能存在BLM/EZH2/P53的信号调控轴利用BLM特异性抑制剂处理PC3细胞5天后,进行活细胞计数检测,发现ML216的药物浓度与细胞活性呈负相关,且药物处理组与阴性对照组相比差异极显着（P<0.001）,检测细胞周期发现其能够引起PC3细胞在G0/G1期细胞数量的增加。应用si RNA分别单独或同时干扰BLM和EZH2时,发现si BLM和si EZH2的联合干扰能够更加显着抑制PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且能够上调PC3细胞中P53蛋白的表达水平,结合生物信息学分析发现在PC3细胞中可能存在BLM/EZH2/P53的信号调控轴。4.体内外实验进一步阐明了在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴以EZH2为诱饵蛋白进行了ChIP-seq试验,发现EZH2蛋白并未能够直接结合P53启动子区,而是通过调控MDM2启动子区间接调控P53蛋白的表达。通过体外实验发现过表达EZH2,能促进PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,但在同时干扰BLM时,能够部分削弱其增强效应,反之,在干扰EZH2时,则能减弱了PC3细胞的增殖、迁移和侵袭,而在同时过表达BLM时,能够部分抵消EZH2干扰时的减弱效应,体内裸鼠成瘤实验结果也与上述结果一致。表明在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴。综上,本研究发现BLM与EZH2蛋白主要定位于细胞核,通过免疫共沉淀联合质谱分析和Pull down实验发现BLM与EZH2蛋白存在直接相互作用,生物信息学分析显示BLM与EZH2在PCa的发生中均高表达且呈显着相关性,并在PCa组织中进一步印证了BLM与EZH2的相关性。通过干扰BLM和EZH2蛋白能够显着抑制PC3细胞增殖、迁移和侵袭,体内外实验揭示了在PC3细胞中存在BLM/EZH2/MDM2/P53的信号调控轴途径。弄清BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖分子机制,以Rec Q-BLM解旋酶为小分子抗癌药物的靶标,另辟和建立治疗前列腺癌的新途径和新方法,具有重要的理论价值和应用前景。
王婧雯[2]（2021）在《MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究》文中进行了进一步梳理第一部分慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）持续的感染是世界性的公共卫生问题,全球至少有2.57亿人有慢性HBV感染。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）会对肝脏造成损伤,随着疾病的发展会导致肝硬化甚至是肝癌,因此对CHB进行及时有效的治疗显得尤为重要。Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）是治疗CHB的一线药物。Ⅰ型IFN与细胞膜表面的Ⅰ型干扰素受体（type Ⅰ interferon receptor,IFNAR）的亚基IFNAR1和IFNAR2结合,形成异二聚体配体受体复合物,激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子1（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 1,JAK/STAT1）信号通路,产生抗病毒蛋白发挥抗病毒作用。Ⅰ型IFN还可以通过STAT1使MDM2转录下调来诱导p53蛋白的稳定以发挥抗病毒的作用。STAT1既是Ⅰ型IFN信号转导所必需的,同时也可以负调控鼠双微体2（mouse double minute-2,MDM2）,p53的降解和反式激活受到MDM2调控,抑制了 p53的表达作用。JAK/STAT1途径激活后,STAT1表达升高抑制了 MDM2的表达,p53表达增加增强了 Ⅰ型IFN抗病毒信号并促进HBV病毒感染细胞的凋亡,抑制HBV在细胞中的复制,发挥p53的先天抗病毒免疫作用。表观遗传学中有一类是DNA甲基化,是一种对DNA的化学修饰。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶作用下获得甲基基团,进而在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。氧化应激是机体氧化状态和抗氧化状态的动态平衡被打破,更倾向于氧化状态。有研究指出氧化应激会引起表观遗传学改变,这可能与CHB的发生和发展有关。现在尚未有关于CHB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态及与氧化应激关系的研究。研究目的1.明确 CHB 患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs 中 IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。2.明确CHB患者和HCs的PBMCs中IFNAR mRNA和MDM2 mRNA表达水平。3.研究CHB患者PBMCs中的INFAR启动子甲基化对MDM2 mRNA相对表达量的影响。4.研究CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化与氧化应激之间的关系。研究方法本研究共纳入169例研究对象,其中CHB患者148例,HCs 21例,于2014年1月到2016年10月在山东大学齐鲁医院肝病科入组。CHB的纳入标准按照 2009 年美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的《乙型肝炎指南》,乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性时间至少6个月。甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）被用来检测 PBMCs 中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测 IFNAR mRNA 及 MDM2 mRNA 的相对表达量。酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆中丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平。统计分析采用 SPSS 22.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 5.0 软件（San Diego,CA,USA）。连续变量的组间差异比较使用Mann-Whitney U检验。使用卡方检验来比较分类变量的组间差异。变量间的相关性使用的是Spearman等级相关检验。当p<0.05时,认为差异具有统计学的意义。研究结果1.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化的频率明显低于HCs（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p<0.001）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 启动子甲基化频率与HCs相比无明显差异（p>0.05）。2.CHB患者PBMCs中IFNAR mRNA表达量相较于HCs明显升高（IFNAR1:p=0.031;IFNAR2:p=0.027）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 mRNA 表达量与HCs相比无明显差异（p>0.05）。3.CHB患者中IFNAR启动子甲基化组IFNAR mRNA表达量相较于非甲基化组明显降低（IFNAR1:p=0.023;IFNAR2:p=0.044）。4.CHB患者中存在IFANR启动子甲基化的患者,其MDM2 mRNA相对表达量是明显高于IFNAR启动子非甲基化组中患者的相对表达量（IFNAR1:p=0.001,IFNAR2:p=0.008）。5.CHB患者血浆中的MDA是明显高于HCs,而GSH是低于HCs（MDA:p<0.001;GSH:p<0.001）。在CHB患者中IFNAR启动子甲基化组的MDA是明显高于非甲基化组（IFNAR1:p=0.018;IFNAR2:p=0.041）,GSH则是明显低于非甲基化组的（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p=0.029）。研究结论1.CHB患者PBMCs中IFNAR启动子是存在甲基化异常的,同时IFNAR启动子甲基化的频率是低于HCs。CHB患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的水平与HCs相比是没有差异的。2.CHB患者PBMCs中的IFNAR发生甲基化后,导致IFNAR mRNA相对表达量降低并伴有MDM2 mRNA表达量升高,提示IFNAR甲基化可能影响MDM2 mRNA的表达,两者可能共同影响Ⅰ型IFN抗病毒的效果。3.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化可能是与氧化应激有关系的,这或许为CHB中氧化应激诱导的表观遗传调控提供了新见解。第二部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究研究背景原发性肝癌中大约有90%是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HCC是世界上最常见的癌症之一,其发病率在癌症的发病率中排第五位,在癌症死亡率中排第三位。在中国每年因肝癌死亡的约有38.3万人,约占到全球肝癌死亡人数的51%。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、酒精性肝病、慢性丙型肝炎病毒感染及非酒精性脂肪性肝炎等是导致HCC发生的主要的危险因素。在中国,慢性乙型肝炎病毒感染导致的乙肝相关HCC最为常见。虽然现在的医疗技术不断发展、诊断水平得以提高、影像学检查手段更加完善,但由于HCC通常起病隐匿,发现时一般已处于中晚期,而手术切除和肝移植适用于治疗早期发现的HCC,大部分HCC患者会错过治疗的最佳时机。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是最常用于诊断HCC的标志物,但是大约40%的HCC患者血清中AFP的水平并不升高,因此寻找更加灵敏且无创的生物标志物显得尤为重要。肿瘤发生发展的重要原因之一是DNA甲基化,虽然DNA的序列没有发生改变但是对基因表达的影响是可遗传的。DNA甲基化对基因表达非常重要,同时也会对细胞产生不良后果。DNA甲基化包括DNA高甲基化和DNA低甲基化,两者都是常见的表观遗传学特征。目前关于DNA低甲基化对机体产生的影响很少有研究。在大多数情况下,DNA低甲基化是指与“正常”甲基化水平相比有所降低,如和正常细胞或者组织进行比较,与基因表达的增加有关。DNA低甲基化在肿瘤中较为常见,如肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌等。基因的低甲基化可作为诊断肿瘤的生物标志物。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）可以对p53肿瘤抑制因子进行负调控,可以泛素化降解p53,也可以结合p53的转录激活域以调节p53的表达。通常情况下,MDM2与p53之间存在可以自我调节的负反馈回路,以确保它们之间的动态平衡。然而,在肿瘤中该负反馈环通常被破坏。尤其是MDM2的过表达与多种肿瘤有关,如肉瘤、肝癌和胃癌。无论p53处于何种状态,过表达的癌蛋白MDM2不仅与p53结合并负调控p53,而且还有助于HCC的发生和进展。但是目前关于乙肝相关HCC患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 MDM2 启动子甲基化状态以及诊断价值尚未有研究。研究目的本研究的主要目的是探讨乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态,以及对乙肝相关HCC的诊断价值。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的患者,包括100例乙肝HCC患者,31例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者以及37例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者,入组时间为2016年6月至2018年2月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发表的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且要求乙肝表面抗原阳性大于6个月。LC患者的入组条件根据《2015年日本胃肠病学会肝硬化循证医学临床实践指南》。2018年,AASLD中《慢性乙型肝炎的预防、诊断、治疗更新:AASLD 2018乙型肝炎指南》作为CHB患者的筛选标准。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA 的 相对表达量。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）、GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）和 MedCalc 软件（MedCalc,Ostend,Belgium）。使用Mann-Whitney U检验或者Kruskal-Wallis H检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。通过二分类logistic回归分析寻找影响MDM2启动子甲基化状态的危险因素。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理特征的相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。通过受试者工作特征曲线下面积（the area under the receiver operating characteristic curve,AUC）来评估MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合应用对于提高乙肝相关HCC诊断的价值。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.CHB患者中,PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率为72.97%（27/37）,在LC患者中的为64.52%（20/31）,在乙肝相关HCC患者中的为30.00%（30/100）。发现,乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化频率低于CHB（p=0.000）和LC（p=0.001）患者。MDM2启动子甲基化频率在CHB和LC患者是没有统计学差异的（p>0.05）。2.在乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的状态是与远处转移（p=0.040）、TNM 分期（p=0.035）及 BCLC 分期（p=0.044）有明显相关,而与性别、年龄、AFP、血管侵犯、淋巴结转移、肿瘤数量、肿瘤大小之间无相关性（p>0.05）。通过二分类logistic回归分析,结果显示各临床病理特征均不是MDM2启动子甲基化的危险因素（p>0.05）。3.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2 mRNA相对表达量明显高于LC（p=0.010）和 CHB（p=0.003）患者,CHB 和 LC 患者之间 MDM2 mRNA 相对表达水平是没有统计学差异的（p>0.05）。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.024）。4.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2 mRNA相对表达水平是与HBV DNA（p=0.009）、谷丙转氨酶（p=0.016）、谷草转氨酶（p=0.024）有显着相关性的,但是与总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间没有相关性（p>0.05）。5.区分乙肝相关HCC和CHB患者时,PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.756;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.639;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.715。区分乙肝相关HCC与LC患者时,MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.735;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.634;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.673。可见PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。研究结论乙肝相关HCC患者PMBCs中MDM2启动子低甲基化,并且PBMCs中MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。第三部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种世界范围的发病率高和死亡率高的原发性肝癌。HCC的病因包括肝炎病毒感染（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）、饮酒、代谢性肝病（尤其是非酒精性脂肪肝）。在中国,感染了慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）导致的乙肝相关HCC更为普遍。DNA低甲基化会导致癌基因的激活,是癌症发生和发展的主要危险因素。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）作为癌基因,在乙肝相关HCC患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中存在MDM2启动子低甲基化且MDM2表达量升高,但是导致MDM2启动子低甲基化的原因并不清楚。许多研究表明,氧化应激会导致基因表观遗传学的改变,其中就包括DNA甲基化状态的改变。氧化应激是机体氧化和抗氧化之间的动态平衡被打破,更倾向于氧化。通过对血浆中氧化剂和抗氧化剂的定量检测及检测相关代谢产物的代谢组学来评估氧化应激。代谢组学被定义为“对内源性代谢物的详尽分析”,已经在寻找疾病生物标志物、探讨癌症发生发展机制中得到广泛应用。代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的补充,能更好的反映生物系统的病理生理状态的变化。目前关于乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子低甲基化和氧化应激的关系尚且没有研究。研究目的1.明确乙肝相关HCC患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和氧化应激的关系。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的117例乙肝相关HCC患者,和招募的26例HCs,入组时间为2016年6月至2019年8月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且乙肝表面抗原阳性大于6个月。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA的相对表达量。血浆中氧化参数丙二醛（malondialdehyde,MDA）和抗氧化参数超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）使用酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）。使用Mann-Whitney U检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理参数相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。选取研究对象中的36例乙肝相关HCC患者和11例HCs,通过超高液相色谱-质谱（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测血浆中代谢物改变。代谢组学得到的数据通过SIMCA软件（V16.0.2,Umea,Sweden）进行处理,分别获得了主成分分析（principal component analysis,PCA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）>1,p<0.05,组间物质定量比值（fold change）>2 或<0.5。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率是明显低于HCs（p<0.001）。对于乙肝相关HCC患者,MDM2启动子甲基化的状态是与TNM分期相关的（p=0.037）,但与性别、年龄、AFP、肿瘤数量、肿瘤大小、血管之间无明显相关性。2.在乙肝相关HCC患者中MDM2 mRNA表达量明显高于HCs（p<0.001）。通过分析发现,乙肝相关HCC患者MDM2 mRNA水平与HBV DNA（p=0.017）和 ALT（p=0.018）以及 AST（p=0.034）表现为正相关,但与 TBIL（p=0.072）、ALB（p=0.596）和PT（p=0.762）没有相关性。并且,在乙肝相关HCC患者中MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.027）。3.乙肝相关HCC患者血浆中氧化剂MDA水平明显高于HCs（p<0.001）,抗氧化剂SOD和GSH水平明显低于HCs（SOD:p=0.009;GSH:p=0.040）。同时,在乙肝相关HCC患者中,MDM2启动子非甲基化组氧化剂MDA水平明显高于甲基化组（p=0.027）,而抗氧化剂SOD和GSH水平低于甲基化组（SOD:p<0.001;GSH:p=0.017）。4.乙肝相关HCC患者血浆中代谢物的改变和HCs存在显着差异,差异代谢物共有216种。其中正离子模式中检测到的差异代谢物包含了 144种,上调的差异代谢物包含了 88种,下调的差异代谢物包含了 56种;负离子模式中检测到的差异代谢物包含了 72种,上调的差异代谢物包含了 51种,下调的差异代谢物包含了 21种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,胆汁酸,脂肪酸类,磷脂,糖类,有机酸类和有机杂环化合物及其他类化合物。5.乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组的差异代谢物是有明显区别的,差异代谢物包含了 81种。正离子模式包含有52种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有33种,降低的差异代谢物有19种;负离子模式中包含有29种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有19种,降低的差异代谢物有10种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,脂肪酸类,磷脂,胆汁酸,有机酸和其他类化合物。并且我们发现,在MDM2启动子甲基化组具有抗氧化作用的代谢物消退素D1、亮氨酸等明显高于MDM2启动子非甲基化组（p<0.05）,同时可以提供甲基的S-腺苷甲硫氨酸水平明显高于非甲基化组（p=0.029）,而与氧化损伤有关的代谢物吲哚硫酸盐、硫酸对甲酚等明显低于非甲基化组（p<0.05）。6.乙肝相关HCC患者和HCs血浆差异代谢物相比,发现主要涉及到了精氨酸和脯氨酸的代谢、精氨酸和鸟氨酸的代谢、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氮代谢。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组血浆差异代谢物相比,发现差异代谢物主要涉及到半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、组氨酸的代谢、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢。其中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是与乙肝相关HCC患者的MDM2启动子甲基化组和非甲基化组差异代谢物相关性最显着的代谢通路。研究结论1.MDM2启动子甲基化频率在乙肝相关HCC患者的PBMCs中是明显低于HCs。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子低甲基化状态与氧化应激有关,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢可能在其中发挥重要作用。
张亮[3]（2021）在《线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究》文中认为胃癌是一种致命的肿瘤疾病,在全世界范围内的总体生存率都较低,严重威胁着人类的健康。目前,胃癌是世界第五大癌症类型,已被确定为全球癌症死亡相关的主要原因之一。胃癌的发生是由宿主遗传、环境因素（如吸烟、饮酒、高盐等）和微生物因素（如幽门螺杆菌）等复杂相互作用的结果。这些现状表明,深入研究胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的临床改善和预后具有重要意义。蛋白泛素化修饰参与调节多种细胞功能,包括靶向蛋白的降解、蛋白的膜转运、DNA损伤修复、信号转导等。线性泛素链作为近年来新发现的一种泛素链接方式,主要由泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）催化合成和去泛素化酶OTULIN特异性水解,处于两者共同调节的动态过程中。LUBAC复合体是目前已知的唯一能够催化合成线性泛素链的泛素连接酶。它主要由HOIP（HOIL1-interacting protein）,SHARPIN（SHANK associated RH domain-interacting protein）和HOIL1L（haem-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1L）三个分子组成。HOIP是LUBAC复合体的酶催化核心,SHARPIN和HOIL1对于HOIP的激活具有关键作用。已有研究表明,线性泛素化修饰可发生在NEMO、TNFR1和RIPK1等底物中,通过调节NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路,对固有免疫、炎症反应和血管生成等具有重要的作用。但是在肿瘤的发生发展中,线性泛素化修饰对胃癌生物学行为的影响目前尚不清楚。因此,从线性泛素化相关的蛋白入手,研究线性泛素化修饰如何调节胃癌的生物学行为,有助于揭示胃癌发生发展的新机制,具有重要的理论意义及潜在临床价值。有鉴于此,本文主要分两部分,分别研究了线性泛素化相关蛋白OTULIN及SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响和机制。本文的研究内容和主要结果结论如下:第一部分去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中呈高表达1.去泛素化酶OTULIN在多个数据库的胃癌中表达增高;2.去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织;二、去泛素化酶OTULIN对胃癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力的影响1.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的增殖和成瘤;2.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的侵袭和迁移;3.OTULIN促胃癌细胞迁移侵袭依赖于其去泛素酶活性;三、识别与鉴定线性泛素化修饰的底物蛋白RACK11.Pull-down实验结合质谱分析,筛选出底物蛋白RACK1;2.免疫共沉淀实验证明RACK1蛋白存在线性泛素化修饰;四、OTULIN与RACK1相互作用,并与黏着斑激酶FAK形成复合体1.免疫荧光实验证实OTULIN和RACK1存在共定位;2.免疫共沉淀实验证明OTULIN、RACK1和FAK形成复合体;五、OTULIN调节RACK1对FAK的招募,影响胃癌细胞的粘附运动1.敲除OTULIN能够抑制FAK的磷酸化水平;2.OTLUIN能够促进RACK1对FAK的招募;3.OTULIN敲除的胃癌细胞粘附运动能力下降;第二部分SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、SHARPIN通过不依赖于线性泛素化的方式调节Wnt/β-catenin信号通路1.LUBAC和OTULIN参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;2.SHARPIN与β-catenin相互作用参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;二、SHARPIN促进胃癌的恶性生物学行为1.SHARPIN促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭;2.SHARPIN促进胃癌细胞皮下移植瘤的生长;三、SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin,而抑制β-catenin的泛素蛋白酶体降解1.SHARPIN抑制β-catenin的泛素化降解;2.SHARPIN与β-Trcp1竞争性结合β-catenin;3.SHARPIN与β-Trcp1可能竞争性结合β-catenin上的相同位点;四、过表达β-catenin回复SHARPIN敲低引起的胃癌细胞增殖抑制1.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭表型;2.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的皮下移植瘤的增殖抑制;五、SHARPIN在胃癌组织中高表达且提示预后不良,并与β-catenin表达呈正相关1.SHARPIN在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织;2.SHARPIN高表达的胃癌患者总生存期短,预后较差;3.胃癌组织中SHARPIN表达与β-catenin表达呈显着正相关;本研究的主要结论为:1.去线性泛素化酶OTULIN能够通过去除RACK1蛋白的线性泛素化修饰,增强RACK1与黏着斑激酶FAK的相互作用,进而促进胃癌的增殖和转移播散。2.线性泛素化相关蛋白SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin上的相同位点,从而抑制了β-Trcp1泛素化降解β-catenin,稳定其表达和向细胞核转位,促进下游癌基因c-myc、CD44等基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本研究首次报道了线性泛素相关蛋白OTULIN和SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响。我们发现了线性泛素化修饰的新底物蛋白RACK1,并初步阐明了去泛素化酶OTULIN通过调节RACK1影响胃癌细胞增殖和转移播散的分子机制,为研究线性泛素化修饰在肿瘤中的作用提供了新的理论基础。另外,我们也发现SHARPIN通过不依赖于线性泛素化修饰的方式调节Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进胃癌的发生发展,揭示了SHARPIN的一种新功能和调节β-catenin的新方式。这些研究为探索胃癌发生发展的分子机制提供了新的研究方向,并可能成为潜在的改善胃癌患者治疗和预后的策略。
王爽[4]（2021）在《转录因子ZNF703影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究》文中研究说明目的:锌指蛋白703（ZNF703）作为一种转录因子,在多种肿瘤中表达升高,在卵巢癌中的功能尚不明确。本研究通过检测ZNF703在卵巢癌的表达及构建差异表达的细胞系,利用多种生物学方法结合ChIP-sequence高通量测序技术揭示ZNF703对卵巢癌生长和转移的影响及机制。方法:1、采用免疫组织化学的方法（即SP法）检查卵巢组织中ZNF703的表达情况,并分析评估ZNF703表达与临床病理参数的关系及对卵巢癌患者的总体存活率及预后的影响。检测四种卵巢癌细胞系中ZNF703的表达情况,分别构建ZNF703过表达和抑制表达的细胞模型,并通过Western Blot及qRT-PCR检测转染前后的ZNF703变化情况。MTT、细胞凋亡及细胞周期、侵袭实验及迁移实验用于评估ZNF703基因差异表达前后在体外对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。GSEA方法用于对ZNF703进行GO和KEGG富集,并通过Western Blot检测pPI3K及p-AKT变化研究ZNF703对PI3K-AKT通路的作用。2、通过免疫共沉淀检测体外细胞中HE4与ZNF703结构上的相互作用关系,免疫荧光检测HE4与ZNF703在细胞中的共表达情况。从mRNA及蛋白角度分析ZNE703与HE4表达相关性（组化、WB、PCR）,细胞浆细胞核分离实验及免疫荧光检测HE4差异表达前后ZNF703的核易位情况,检测ZNF703促进的卵巢癌恶性生物学行为是否受到HE4影响。3、将卵巢癌细胞甲醛交联并片段化处理后,使用抗ZNF703一抗进行染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验,然后对富集得到的DNA进行定量、质检、测序,并将高通量测序结果定位到人类基因组（hg19）中进行分析。首先在ZNF703过表达或抑制表达的细胞中对潜在的靶基因进行qRT-PCR检测后,选取PEA15作为靶基因进行验证,根据PEA15对应的结合峰进行引物设计,ChIP-PCR检测ZNF703是否直接结合于PEA15的增强子区。构建双荧光素酶载体并转染293T细胞检测ZNF703对PEA15增强子区域的结合。Western Blot在蛋白水平检测ZNF703转染前后PEA15、p-PEA15（Ser 116）及pPEA15（Ser 104）的表达变化。临床标本检测PEA15的表达,分析PEA15和ZNF703的组化相关性,以及HE4与PEA15相关性,细胞实验分析HE4对PEA15mRNA、蛋白及磷酸化的影响。体内实验研究ZNF703过表达后对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响,并利用HE染色及免疫组化检测移植瘤中ZNF703、Ki-67、PEA15及p-PEA15的水平。结果:1、ZNF703在卵巢癌组织中表达增加,其表达水平与卵巢癌患者临床病理参数无明显相关性,但ZNF703高表达的卵巢癌患者生存时间明显缩短、预后较差。CAOV3细胞中的ZNF703蛋白表达水平最高,依次为SKOV3和OVCAR3,在ES-2表达水平最低,分别进行siRNA的转染或过表达细胞系的构建,在蛋白和mRNA水平进行转染效率验证后实验。结果发现与对照组相比,过表达ZNF703后卵巢癌细胞增殖加快、细胞凋亡变少,细胞周期结果提示过表达后细胞向G2/S期转化。与此同时,过表达ZNF703后增强了卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。不仅如此,我们发现过表达ZNF703后相关蛋白PCNA、Bcl2/Bax、cyclin D1、MMP2、MMP9增加。在siRNA转染的细胞中得到了相反的结果。GSEA富集分析发现ZNF703富集于很多通路,其中ZNF703过表达后PI3K和AKT的磷酸化程度显着升高,在抑制表达后降低。2、免疫共沉淀结果显示在两种细胞系中存在ZNF703和HE4的相互作用。免疫荧光共定位显示ZNF703主要表达于细胞核,HE4主要表达于细胞质,二者存在共定位。对免疫组化结果分析显示ZNF703与HE4的表达具有相关性,但是在细胞系中的表达并无相关性。HE4过表达或抑制表达前后ZNF703总蛋白表达没有明显差异,核浆分离实验结果显示HE4过表达后ZNF703的核内表达增多,胞浆内表达减少,在HE4抑制表达后观察到相反的结果。免疫荧光实验对HE4抑制前后ZNF703进行检测,发现在HE4抑制表达后,核内ZNF703的荧光表达减弱,细胞浆增加。同时,ZNF703可以逆转HE4对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响,而HE4对ZNF703促进的卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响并不显着。3、ChIP-Seq鉴定出多个ZNF703的调节靶点,这些靶点明显富集于很多通路。ChIP-PCR证实ZNF703可以直接与PEA15的增强子区结合,双荧光素酶报告基因也证明了这一结论。Western Blot结果说明过表达ZNF703后PEA15、p-PEA15、p-PEA15/PEA15均增加。在同样的临床标本中检测到PEA15在98例卵巢癌组织中高表达,PEA15高表达的患者预后更差。对组化结果进行相关性分析发现PEA15的表达与ZNF703、HE4均具有相关性。同时,PEA15 mRNA在siRNA抑制HE4表达时降低,在HE4过表达后增加。在蛋白水平HE4的差异表达会影响PEA15蛋白表达,但对PEA15磷酸化水平影响不明显。体内移植瘤实验结果显示相比于对照组,ZNF703过表达组瘤体的终体积更大、肿瘤质量更高、生长速度更快。且移植瘤组织中过表达组的Ki-67、PEA15、p-PEA15表达均增加。结论:1、ZNF703在卵巢癌组织及细胞中高表达,促使卵巢癌细胞增殖加快、细胞周期进展及侵袭转移能力增加、阻遏细胞凋亡。2、HE4和ZNF703的相互作用促进ZNF703核易位。3、ZNF703不仅通过直接结合PEA15的增强子促进PEA15的表达,还通过激活PI3K/AKT通路促进PEA15 Ser116位点的磷酸化,阻止卵巢癌细胞凋亡,进而促进卵巢癌进展。
王彦卿[5]（2021）在《基于肺腺癌高表达UBE2探索泛素连接酶HECTD3在肺腺癌中作用的研究》文中研究表明目的:寻找差异表达的泛素结合酶E2,筛选出其相关的E3泛素连接酶,研究该E3泛素连接酶在肺腺癌中的表达水平及其临床意义,并验证该泛素连接酶E3在肺腺癌中的作用。方法:1、通过ONCOMINE、UALCAN、HPA、The Kaplan-Meier plotter[lung]、cBioPortal和GEPIA等多个数据库,筛选出有差异表达的E2泛素结合酶,并验证该E2泛素结合酶的临床意义。通过该E2泛素结合酶在多个不同的研究中寻找与其共同变化的相邻基因,以此确定下一步需要研究的E3泛素连接酶。2、从公共数据库及我科临床标本两个方面验证该E3泛素连接酶的临床意义及预测其功能。3、检测野生型肺腺癌细胞系中该E3泛素连接酶的表达情况,挑选其中一个细胞系通过慢病毒感染,构建该E3泛素连接酶过表达稳转细胞系及CRISPR/Cas9敲除细胞系。4、通过CCK-8实验、Transwell实验和细胞划痕试验检测该E3泛素连接酶对肺腺癌增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:1、肺腺癌中UBE2C、UBE2S相比于正常肺组织mRNA及蛋白表达增高,且与患者临床分期相关。肺腺癌患者中UBE2C和UBE2S mRNA水平升高预示着患者有更差的总生存期和无进展生存期。肺腺癌中随着UBE2C和UBE2S最常改变的相邻基因为 HECTD3。2、肺腺癌组织中HECTD3的mRNA、蛋白表达均明显高于正常对照组,且有随着分期的升高,HECTD3表达量有增高的趋势。肺腺癌患者中HECTD3 mRNA高表达预示患者有更差的总生存期（HR=1.65,95%CI:1.31-2.09）和无进展生存期（HR=1.68,95%CI:1.23-2.31）。对临床标本进行转录组测序,结果显示肺腺癌组织中HECTD3的表达量高于癌旁正常组织,与肺腺癌组织学亚型、高危因素（累及血管和/或胸膜/气腔内播散/瘤栓）及是否有淋巴结转移均有关。3、GO分析的结果推测HECTD3与基因表达、蛋白代谢、酶绑定、蛋白复合体绑定、泛素蛋白连接酶绑定密切相关。KEGG分析显示HECTD3与肿瘤信号通路、p53信号通路、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌和凋亡相关。4、在纳入筛选的细胞系中野生型A549细胞HECTD3蛋白表达最高。构建的HECTD3过表达稳转细胞系在mRNA和蛋白水平HECTD3均表达上调。构建的CRISPR/Cas9敲除稳转细胞系HECTD3基因exonl第282个核苷酸位点出现了插入突变导致HECTD3被完全敲除。5、CCK-8实验结果显示令野生型A549细胞增殖率为100%,则HECTD3敲除组为47.6%,HECTD3过表达组为125.8%。Transwell结果显示相比于野生型A549细胞,HECTD3敲除组每个视野下的细胞数显着减少,HECTD3过表达组每个视野下的细胞数显着增多。细胞划痕实验结果显示HECTD3过表达组细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于野生型A549细胞。HECTD3敲除组细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显低于野生型A549细胞。结论:1、UBE2C和UBE2S在肺腺癌中的表达较正常组均明显上调。UBE2C和UBE2S的表达与HECTD3的表达成正相关。2、HECTD3在肺腺癌组织中表达水平较癌旁正常组织明显上调且与肺腺癌患者的N分期、影响预后的高危因素、病理学亚型相关。3、成功构建HECTD3过表达稳定转染A549细胞系和HECTD3敲除稳定转染A549细胞系。4、HECTD3促进体外肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
王强[6]（2021）在《TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究》文中研究指明胃癌（gastric cancer,GC）是源于胃的恶性肿瘤,是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡主要原因。胃癌作为最常见的癌症之一,每年男性发病率为每100000人中有18例,女性发病率为每100000人中有9例。胃癌的形成机制复杂,主要涉及基因修复功能异常、细胞生长、死亡和凋亡基因的功能紊乱等,相关研究发现不同类型的胃癌存在不同发展机制、检测标记物、临床病理特征。为了明确胃癌的发展机制,为胃癌的治疗提供新的证据和方向,改善患者预后,研究胃癌分类的相关分子机制至关重要。TCGA分型和ACRG分型是近些年学者们提出的新的胃癌相关的分子分型方法,该分型方法的提出可以弥补传统病理分型的不足,为胃癌个体化治疗奠定基础。TCGA分型主要来源于欧洲人群,而ACRG分型来源于亚洲人群,主要来自日本和韩国,这两种分型在基因扩增、基因突变、临床特征、预后等各个方面均有显着的研究价值,对于临床的精准个体化治疗有重要意义。然而,TCGA分型和ACRG分型在河北省人群中的临床特征及其与临床参数和预后的关系尚不清楚。本研究旨在通过使用免疫组织化学（IHC）和二代测序（NGS）进行肿瘤分型,探讨两种分型方法和胃癌的临床病理特征、预后的关系,并通过大数据深入挖掘研究胃癌发生发展的分子机制,为胃癌研究提供新的方向和实验理论。第一部分 ACRG分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义目的:研究ACRG分型在GC组织中的表达情况,探讨胃癌分子分型、临床病理特征与预后的关系。进一步明确ACRG分型是否适用于河北人群,探讨ACRG分型对预后的影响。方法:1.采用免疫组化染色法检测65例患者GC组织中MDM2,P21,E-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平。2.分析相关蛋白的表达水平与GC患者临床病理特征的相关性。结果:1.IHC染色显示MLH1,MDM2和P21蛋白主要位于细胞核中,而E-钙粘蛋白和波形蛋白则主要在肿瘤细胞的细胞质和膜中表达。2.不同年龄段（≤60岁和>60岁）胃癌病人的MLH1和MDM2表达水平有统计学差异（P<0.05）。3.E-钙粘蛋白和波形蛋白在不同位置的表达水平有统计学差异（P<0.05）。4.四种ACRG分子分型的GC患者在性别、年龄、肿瘤位置、Lauren分型或术后辅助治疗类型上均无明显差异（P>0.05）。5.MSS/TP53+胃癌在胃食管结合部（EGJ）（10.3%）显示出低频率,而大多数MSS/TP53-胃癌存在于远端胃（41.7%）。6.MSS/EMT GC患者倾向为弥漫型（53.8%）,而MSS/TP53-GC患者为肠型（57.1%;MSS/TP53-GC患者倾向于肠型）。7.MSI与MSS/EMT预后明显不同（P<0.001）,MSS/EMT与MSS/TP53-预后明显不同（P<0.001）。MSS/EMT预后最差,其次为MSS/TP53-、MSS/TP53+、MSI。8.ACRG分子分型（P=0.045）、Lauren分型（P=0.001）和辅助治疗（P=0.013）与GC的总生存率（OS）相关。小结:1.MLH1和MDM2蛋白与年龄显着相关。2.E-钙粘蛋白和波形蛋白与肿瘤的位置显着相关。3.MSS/EMT胃癌患者倾向为弥漫型,而MSS/TP53-胃癌患者则倾向为肠型。大多数MSS/TP53-胃癌存在于远端胃。4.在所有ACRG分型中,MSI的OS最好,复发率最低。第二部分 TCGA分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义目的:采用二代测序对胃癌进行综合分析,根据TCGA分型对65例胃癌患者进行分类。探讨胃癌分子分型、临床病理特征与预后的关系。进一步明确TCGA分型是否适用于河北人群,评价TCGA胃癌分子分型对预后的影响。方法:1.采用二代测序方法对65例患者GC组织的基因突变进行筛选和注释。2.应用相关统计学分析TCGA与GC患者OS之间的关系。结果:1.NGS测序结果显示在65例GC病例中,EBV+为6例（9.2%）,MSI为15例（23.1%）,GS为14例（21.5%）,CIN为30例（46.2%）2.MSI在女性中更为常见（53.3%）,而EBV+在男性中更为常见（83.3%）。3.65例胃癌中,TP53的突变率为80.0%,扩增百分比CCNE1为20.0%4.弥漫型、GS分子、MSS/EMT和接受XELOX辅助化疗患者的预后最差。5.Kaplan-Meier图显示多基因突变患者的预后较差。单变量和多变量分析表明TP53突变的患者（危险比=4.193,95%置信区间=1.260-13.945）的预后较差。小结:1.MSI和EBV+发生的概率有性别差异;2.GS和MSI在不同的年龄段发生概率有差异;3.CIN胃癌在胃食管连接处更为常见;4.弥漫型、GS分子、MSS/EMT和接受XELOX辅助化疗的患者的预后最差;5.突变率最高的基因是TP53,扩增百分比最高的是CCNE1;6.多基因突变患者的预后较差;7.TP53突变是GC的独立预后指标。第三部分 ACRG亚型MSI和EMT存在预后差异的分子机制探索目的:利用来自NCBI的基因表达数据库（GEO）、癌症基因组的大型公共数据集数据库（TCGA）研究ACRG分型的生物信息分析,并探讨其在胃癌中的临床意义,对MSI和EMT突变频率进行分析,探讨MSI和EMT相关的差异表达基因,并进行GO富集分析和KEGG分析,对MSI和EMT相关基因和通路进行分类。从基因层面探讨MSI和EMT型胃癌的影响因素。方法:1.利用TCGA数据库和来源于NCBI的GEO数据库中的数据,分析比较TCGA数据库与GSE62254数据集中MSI和EMT表达水平的差异,探讨GC患者预后。2.对MSI和EMT相关的差异表达基因进行GO富集分析和KEGG分析。3.单变量Cox风险回归分析来探讨差异基因与胃癌患者预后的关系。结果:1.对GSE62254胃癌数据集和TCGA数据库的综合分析显示,EMT阳性与不良总体存活显着相关,且MSI的总体生存显着优于EMT。2.MSI的突变频率明显高于EMT。3.8个基因与胃癌患者EMT和MSI分型显着相关,分别是THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3。4.THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3在EMT患者中表达量显着高于MSI,且有统计学差异。小结:1.MSI的突变频率明显高于EMT;2.MSI患者的总体生存显着优于EMT;3.通过生物信息学分析发现THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3与胃癌患者的分类及预后显着相关;4.THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3在EMT患者中表达量显着高于MSI,且有统计学差异。
吕蓓蓓[7]（2020）在《胃癌中SPIN1的异常表达及作用机制研究》文中指出研究背景:胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。研究数据显示其死亡率位居第三位。由于症状隐匿,难以早期发现,胃癌患者就诊时多为中晚期,5年生存率不足20%,对国民的健康造成了严重的危害。由于胃癌的异质性较高,组织学形态多样,胃癌的系统性治疗近年来无显着性进展,治疗手段非常有限。尽管术后化疗是进展期胃癌患者的主要治疗手段,可适当延长总生存期,但存在多种不良反应,部分患者难以耐受,且治疗过程中容易耐药。随着胃癌发生、发展分子机制研究的不断深入,胃癌的分子靶向治疗逐渐崭露头角,但是除了曲妥珠单抗的应用使少部分HER-2阳性的晚期胃癌患者获益外,其他靶向药物的临床疗效不尽人意。因此,寻找在胃癌发生发展中敏感和特异的基因改变,并深入探索其发挥作用的分子机制,对胃癌的临床诊治以及提供抗癌药物的研究新靶点等方面都具有重要的理论和实际意义,符合当前我国胃癌个体化治疗的迫切需求。SPIN1（又名Spindlin1）,是SPIN/SSTY基因家族的主要成员,最先在小鼠中发现作为从卵母细胞向胚胎过渡时期的主要母体转录物,在配子发生中发挥重要作用。近年来的研究表明,SPIN1在多种人类恶性肿瘤如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及脂肪肉瘤中高表达,SPIN1基因过表达可促使小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞发生恶性转化。本课题组前期在乳腺癌中的研究发现SPIN1在乳腺癌耐药及转移性组织中表达上调,通过正向调控PI3K/Akt通路、药物代谢酶进而促进乳腺癌细胞的化疗耐药性及迁移浸润,抑制细胞凋亡。以上结果均提示SPIN1可能作为一个重要的癌基因,参与恶性肿瘤的发生和发展。但是目前关于SPIN1与胃癌的关系未见相关研究,此外SPIN1在肿瘤中高表达的分子机制仍不明确。本研究在临床样本水平阐明了 SPIN1与胃癌临床病理参数及预后的关系,在转录水平上探索胃癌中SPIN1高表达的上游调控机制。通过体内外功能实验明确SPIN1对胃癌细胞增殖、浸润和转移能力的影响,并进一步阐明了 SPIN1促进胃癌迁移、浸润及增殖的分子机制。研究方法:（1）通过生物信息学分析、免疫组化及实时定量PCR明确SPIN1在胃癌组织及细胞中的表达情况,进一步分析SPIN1表达与胃癌患者临床病理参数及预后的关系。（2）为了探索胃癌中SPIN1高表达的上游调控机制,构建SPIN1上游启动子区的截短质粒并进行双荧光素酶实验,明确SPIN1的核心启动子区。使用生物信息学网站预测可能与SPIN1核心启动子区结合的转录因子,并进一步通过双荧光素酶实验、RT-qPCR、Western blot及染色质免疫共沉淀（ChIP）实验验证转录因子对SPIN1的调控作用。（3）体外细胞学实验通过Transwell实验、MTS、EDU细胞增殖实验及平板克隆形成实验检测过表达及干扰SPIN1后对胃癌细胞迁移、浸润及增殖能力的影响,通过流式细胞学技术检测过表达及干扰SPIN1后对胃癌细胞凋亡能力及细胞周期的影响。（4）使用全基因表达芯片、实时定量PCR、Western blot等结合文献报道阐明SPIN1调节的靶基因并分析其参与的信号通路,进一步探讨SPIN1对靶基因的直接调控作用。免疫组化检测靶基因在胃癌及非肿瘤性胃粘膜组织中的表达情况,分析其与胃癌患者预后的关系及与SPIN1的相关性。（5）体内验证SPIN1对胃癌细胞浸润及增殖能力的影响,并初步判定其作为胃癌治疗靶点的可行性。通过免疫组化检测实验组及对照组瘤体组织中Ki67的表达情况,分析其相关性。新鲜的瘤体组织提取RNA及蛋白验证体外鉴定的SPIN1参与调控的信号通路。研究结果:（1）SPIN1在胃癌组织中表达升高,且与不良预后密切相关TCGA数据分析显示,SPIN1在人类胃癌样本中的表达较非肿瘤性胃粘膜组织中明显升高。Kaplan-Meier Plotter网站进行生存分析结果显示,SPIN1高表达的患者较低表达者有较差的总生存期和首次进展生存期。免疫组化结果显示SPIN1在非肿瘤性胃粘膜组织、胃癌原发灶及淋巴结转移灶中高表达的比例逐渐增高。另外,SPIN1在伴有淋巴结转移的胃癌中的表达明显高于没有淋巴结转移的胃癌组织,提示SPIN1可能与胃癌淋巴结转移有关。临床病理参数分析显示SPIN1高表达与淋巴结转移、远处转移、临床分期及分化程度密切相关。Kaplan-Meier生存分析显示,SPIN1高表达与较差的总生存（OS）和无病生存（DFS）相关。Cox 比例风险回归模型进行单因素和多因素分析结果表明,SPIN1表达、临床分期、淋巴结转移及远处转移与胃癌患者的OS显着相关,而只有远处转移是OS的独立预后因素。ROC曲线分析显示SPIN1表达可以较好地区分胃癌有无淋巴结转移、临床分期、分化程度以及有无远处转移。（2）转录因子E2F1结合在SPIN1的启动子区并激活SPIN1转录通过UCSC网站找到人SPIN1的启动子序列,下载SPIN1转录起始位点上游2000bp序列。构建SPIN1上游启动子区的系列截短片段质粒,双荧光素酶实验结果表明SPIN1上游-374～-75 bp区域是其核心启动子区。我们进一步利用JASPER和PROMO网站对该转录因子结合位点区域进行预测分析。结果显示在SPIN1核心启动子区域有SP1、E2F1、YY1等多个转录因子的潜在结合位点。结合转录因子功能,我们选择SP1、E2F1、YY1和CEBPβ进行后续验证。通过双荧光素酶实验、RT-qPCR及Western blot实验表明E2F1可以激活SPIN1转录,并通过ChIP实验验证了 E2F1可以与SPIN1启动子区域直接结合。（3）SPIN1促进胃癌细胞的迁移、浸润和增殖课题组前期已构建了 SPIN1的过表达质粒,并设计合成了 3条SPIN1小干扰序列。通过RT-qPCR验证了过表达及干扰效率。Tanswell实验结果表明过表达SPIN1可显着促进胃癌细胞的迁移和浸润能力,而干扰SPIN1则可抑制胃癌细胞的迁移和浸润能力。MTS、EdU及平板克隆形成实验表明过表达SPIN1后,胃癌细胞的增殖能力显着增加,而干扰SPIN1后其增殖能力明显减弱。（4）SPIN1促进胃癌细胞周期进展,对胃癌细胞凋亡没有影响由于SPIN1可以促进胃癌细胞增殖,接下来我们确定SPIN1过表达或敲除是否会影响胃癌细胞的细胞周期或凋亡能力。流式细胞学实验结果显示,SPIN1过表达能促进细胞周期G1期向S期过渡,而抑制SPIN1表达则会引起S期细胞数量减少。结果表明,SPIN1在G1/S期转换中起着重要作用。接下来,我们研究了 SPIN1对细胞凋亡的影响。Annexin V-FITC检测结果显示,过表达及干扰SPIN1后实验组和对照组之间的细胞凋亡比例无明显差异。这些结果表明,SPIN1介导的胃癌细胞增殖能力提高是由于其对细胞周期的调控而实现的。（5）SPIN1通过调控EMT促进胃癌细胞迁移、浸润通过Western blot实验检测过表达/沉默SPIN1后胃癌细胞中EMT相关蛋白 Vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snai1、Slug 及 Claudin-1 的变化。结果表明与对照组相比,过表达SPIN1后Slug表达上调,Claudin-1表达下调;干扰SPIN1后Slug相应的表达下调而Claudin-1表达上调,其余蛋白未见明显变化。结果提示SPIN1可能通过调控Slug及Claudin-1参与EMT进程。（6）SPIN1通过激活MDM2-p21-E2F1信号通路促进胃癌细胞的增殖基因表达芯片结合文献报道,选择MAP2、MDM2、MAPKBP1和GPNMB等4个癌症相关基因作为SPIN1的候选下游调控靶基因进行研究。RT-qPCR和Western blot结果显示,当SPIN1过表达时,MDM2的mRNA水平和蛋白表达量增加,而MAP2、MAPKBP1和GPNMB的mRNA和蛋白表达量无明显变化。MDM2是细胞周期调控的重要媒介,细胞学实验也表明SPIN1可以促进胃癌的细胞周期进展,我们推测SPIN1通过MDM2介导的信号通路促进胃癌的细胞周期进展。通过RT-qPCR和Western blot检测MDM2、p21、p27以及相关细胞周期调节因子的表达。结果发现,干扰SPIN1降低了MDM2、CDK4、CyclinD1和E2F1的mRNA及蛋白水平,p21表达升高。而当SPIN1过表达时,MDM2、CDK4、CyclinD1、P-RB和E2F1的蛋白表达增加,而p21蛋白表达减少,mRNA无明显变化。以上结果表明SPIN1可以正向调控MDM2-P21-E2F1信号通路。如前所述,E2F1作为转录因子可以直接激活SPIN1的转录,由此形成了正反馈环路,使SPIN1处于持续激活的状态,促进胃癌的进展。为了进一步研究SPIN1和MDM2的相关性,免疫组化方法检测胃癌和非肿瘤性胃粘膜组织中MDM2的表达情况。结果显示,MDM2在非肿瘤性胃粘膜组织中呈阴性,伴淋巴结转移的胃癌中MDM2的表达高于无淋巴结转移的胃癌。Kaplan-Meier生存分析显示,MDM2的高表达与较差的OS和DFS相关。Spearman’s相关分析结果显示,MDM2与SPIN1呈正相关。为了验证我们的结果,我们进一步基于TCGA数据分析MDM2的表达及预后价值,结果显示MDM2在人类胃癌样本中的表达与非肿瘤性胃粘膜组织相比明显升高。利用Kaplan-Meier Plotter进行的生存分析显示,MDM2高表达的患者总体生存率较低,与我们的结果一致。这些数据进一步证明,SPIN1通过MDM2介导胃癌细胞增殖。（7）SPIN1通过与H3K4me3结合直接调控MDM2的表达为了进一步阐明SPIN1调控MDM2表达的分子机制,使用UCSC基因组浏览器预测MDM2的上游存在H3K4me1、H3K4me3和H3K27AC的富集峰。文献报道SPIN1是一种组蛋白代码读取器,可以识别H3K4me3。因此,我们推测SPIN1通过识别H3K4me3促进MDM2的转录激活。随后,我们利用抗H3K4me3抗体进行CHIP-qPCR检测。结果显示MDM2启动子区存在H3K4me3。最后我们利用抗SPIN1抗体进行Co-IP实验,验证了胃癌细胞中内源性SPIN1与H3K4me3之间的直接结合作用。以上研究结果表明,SPIN1通过与MDM2启动子的H3K4me3结合,促进了 MDM2的转录激活。由于MDM2是已知的p53的重要靶基因,为了进一步确定SPIN1对MDM2的调控是否依赖于p53,我们进行了拯救实验。结果显示当p53被敲除时,SPIN1的过表达仍然会增加MKN45和BGC823（野生型TP53）细胞中MDM2的表达。同样,当野生型p53过度表达时,SPIN1敲除仍会降低SGC7901（突变型TP53）细胞中MDM2的表达,结果表明SPIN1对MDM2的调控作用是不依赖于p53的。（8）SPIN1可作为抑制体内胃癌生长的治疗靶点为了初步探究SPIN1是否可以作为胃癌治疗的靶点,我们进行了动物实验。裸鼠皮下成瘤后,根据瘤体大小和体重匹配的原则分为实验组和对照组。将慢病毒包装的LV-ShRNA-SPIN1及对照LV-NC分别注入瘤体内,多点多次注射,每7天1次。经过30天的持续观察,我们发现LV-ShRNA-SPIN1组与LV-NC组相比,肿瘤体积明显缩小。此外,LV-ShRNA-SPIN1组中的肿瘤结节是非侵袭性的,而NC组的肿瘤却部分出现了边缘和周围纤维间质或肌肉组织的浸润。Ki-67的免疫组化显示,LV-shRNA-SPIN1组的胃癌细胞的阳性率低于LV-NC组。综上所述,这些发现初步表明SPIN1可作为胃癌治疗的靶点。为了进一步研究SPIN1体内促进胃癌细胞增殖的分子机制,提取新鲜瘤体的RNA和蛋白通过RT-qPCR及Western blot验证MDM2-P21-E2F1信号轴,与体外细胞学的实验结果一致。结论:本研究首次阐明了 SPIN1作为癌基因促进胃癌的发生、发展;SPIN1高表达与胃癌患者不良预后密切相关。E2F1可以直接结合到SPIN1的启动子区并激活SPIN1转录,SPIN1通过与MDM2启动子区域的H3K4me3结合,促进MDM2转录,并进一步正向调控MDM2-p21-E2F1信号通路,因此形成了正反馈环路,使SPIN1处于持续激活状态,促进胃癌进展。SPIN1可作为胃癌的潜在治疗靶点。
王静[8]（2020）在《CCDC43-ADRM1轴受YY1调控，促进胃癌增殖、侵袭和转移》文中指出研究背景和目的胃癌（Gastric cancer,GC）是癌症相关死亡的第—二大原因。由于早期缺乏症状,大部分胃癌在发现时已经发生了转移。而胃癌晚期的治疗手段有限,5年生存率较低,因此,胃癌的肿瘤生长和转移机制值得进一步深入研究。近年来研究表明卷曲螺旋结构（coiled-coil domain-containing,CCDC）蛋白与许多恶性肿瘤的增殖和转移密切相关。CCDC43位于17号染色体上,具有高度保守性。GEPIA数据库显示,CCDC43 mRNA在卵巢癌、肺癌、头颈癌、子宫颈癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和结肠癌等多种恶性肿瘤中表达上调。我们前期研究结果证实CCDC43结直肠癌中高表达,通过介导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）促进结直肠癌的侵袭和转移。但到目前为止,CCDC43在胃癌中的生物学功能尚未明确。我们通过同位素绝对定量和相对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）筛选到 ADRM1 是 CCDC43 可能的下游靶标蛋白。同时通过生物信息学发现YY1是CCDC43和ADRM1的共同转录因子。本研究主要探讨CCDC43如何促进胃癌的增殖、侵袭和转移,拟为胃癌治疗提供新的潜在靶点。研究方法首先用实时荧光定量PCR、免疫组化染色检测CCDC43在胃癌及癌旁组织的表达水平,以及分析CCDC43的表达与临床病理参数及预后的关系。分别在胃癌细胞中过表达CCDC43和干扰CCDC43,检测CCDC43对胃癌细胞增殖,侵袭和迁移能力的影响。接着用iTRAQ联合质谱技术筛选到ADRM1可能是CCDC43的下游靶标蛋白。用免疫共沉淀技术验证CCDC43和ADRM1在是否存在相互作用,并利用免疫荧光检测两者的亚细胞定位。同时我们用CHX检测CCDC43对ADRM1稳定性的影响。此外,我们用一系列体内和体外的方法分析了 CCDC43通过ADRM1对胃癌的增殖,侵袭和转移能力的影响。生物学信息分析YY1是CCDC43和ADRM1的共同的转录因子。通过染色质免疫共沉淀和双荧光素酶实验分析YY1与CCDC43和ADRM1启动子的结合关系。用一系列体外实验检测YY1通过CCDC43-ADRM1轴对胃癌细胞生物学功能的影响。最后用western blot和IHC分析YY1/CCDC43/ADRM1在胃癌组织中的相关性。结果1.CCDC43在胃癌组织中高表达,CCDC43的表达高低与病人的预后相关。CCDC43表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、AJCC分期、肿瘤浸润以及肿瘤大小相关。CCDC43能促进胃癌的增殖、侵袭和转移。2.CCDC43与ADRM1在细胞浆内相互作用。CCDC43能提高ADRM1的稳定性,CCDC43通过ADRM1促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。3.YY1 是 CCDC43 与 ADRM1 的共同转录因子,YY1、CCDC43、ADRM1在胃癌组织中正相关。YY1通过调控CCDC43-ADRM1轴促进胃癌的增殖、侵袭和转移。结论CCDC43在胃癌组织中高表达,CCDC43-ADRM1轴在转录因子YY1的调控下促进胃癌的增殖、侵袭和转移。
孙伟林[9]（2020）在《ADAMTS9经RNF180-DNMT3上调抑制胃癌淋巴结转移》文中进行了进一步梳理目的含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶9（A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9,ADAMTS9）是含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶（A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS）中的一员,近年来发现其可能在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用,影响患者的预后。本研究旨在探讨ADAMTS9否能作为胃癌淋巴结转移的有效标志物,以及评估胃癌患者预后。通过进一步的分子实验探索ADAMTS9发挥其生物学功能的上游及下游调控机制。方法1、16例患者胃癌组织及癌旁非肿瘤组织,提取组织RNA,采用半定量PCR（Semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain react,Sq RT-PCR）方法检测组织中的表达水平,采集患者的临床资料,进行二者的相关分析;2、150例患者的胃癌组织及癌旁非肿瘤组织,制作组织芯片,应用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）方法检测ADAMTS9在组织中的表达水平,组织学评分（H-score）量化其表达水平。随后采集患者临床资料,进行ADAMTS9表达水平与临床资料的相关分析。随访患者预后信息,进行生存分析。3、通过胃癌细胞过表达ADAMTS9,探索ADAMTS9在胃癌细胞中的生物学功能。进行裸鼠皮下成瘤实验,探索ADAMTS9于体内对胃癌细胞的生物学功能。4、采用全基因组m RNA测序分析（Genome-wide m RNA sequencing analysis）探索ADAMTS9抑制胃癌细胞迁移和侵袭潜在的信号通路。并通过Real-time PCR、Western Blot及IHC的方法验证下游通路。5、胃癌细胞分别进行5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza）孵育,下调DNMT1（DNA methyltransferase1,DNMT1）,DNMT3A（DNA methyltransferase 3A,DNMT3A）及DNMT3B（DNA methyltransferase3B,DNMT3B）处理,采用Sq RT-PCR及Western Blot的方法检测ADAMTS9的表达水平,验证ADAMTS9的甲基化调控通路。采用Mass ARRAY分析检测胃癌细胞不同处理的甲基化水平6、通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析及组织芯片免疫组化染色,检测RNF180与ADAMTS9之间的潜在相关性。通过胃癌细胞过表达RNF180后,采用PCR及Western Blot方法检测ADAMTS9的表达水平,并通过Mass ARRAY法检测ADAMTS9启动子甲基化程度,进一步明确RNF180调控ADAMTS9的潜在作用机制。随后通过放线菌酮及蛋白酶体抑制剂（MG132）的孵育,以及Western Blot及Co-IP（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）等检测方法,验证RNF180调控ADAMTS9的泛素化机制通路及相互作用蛋白。结果1、9/16例患者胃癌组织显示,ADAMTS9 m RNA表达水平显着低于癌旁非肿瘤组织,ADAMTS9 m RNA的表达水平与患者的p N分期（P=0.044）及淋巴结转移数目（P=0.024）显着相关性。2、组织芯片IHC结果显示,胃癌组织的ADAMTS9蛋白表达水平显着低于癌旁非肿瘤组织（P=0.008）,ADAMTS9蛋白表达水平与患者的p N分期（P=0.018）及淋巴结转移数目（P=0.007）密切相关。且生存分析显示,ADAMTS9表达情况是评估患者预后的重要因素（多因素分析P=0.022）,且AIC（Akaike information criterion,AIC）=71.55,BIC（Bayesian Information Criterion,BIC）=88.714,均为最小值。3、细胞功能学实验显示,ADAMTS9可以显着抑制胃癌细胞系AGS及BGC-823的增殖、迁移和侵袭能力。裸鼠体内皮下成瘤实验显示,ADAMTS9可以抑制体内胃癌细胞BGC-823的增殖能力。4、全基因组m RNA测序,通过KEGG分析显示,ADAMTS9可能通过CCL5/CXCL11依赖性通路抑制胃癌淋巴结转移。通过Real-time PCR及Western Blot方法验证,ADAMTS9在多个胃癌细胞系中可以显着下调CCL5/CXCL11的表达水平。组织芯片的免疫组化结果显示,ADAMTS9表达水平与CCL5表达水平（Pearson r=-0.308,P=0.001）,及CXCL11（Pearson r=-0.501,P<0.001）表达水平呈显着负相关。5、Sq RT-PCR和Western Blot实验显示,ADAMTS9启动子在胃癌中高度甲基化。ADAMTS9启动子甲基化水平主要受到DNMT1及DNMT3A调节,其中DNMT3A调控效果为佳。6、经过GEPIA在线数据分析及胃癌组织免疫组化结果分析显示,RNF180与ADAMTS9表达水平之间存在显着相关性。胃癌细胞过表达RNF180,进一步证实了,RNF180可能下调了ADAMTS9的启动子甲基化水平,从而上调ADAMTS9在细胞中的表达水平。进一步的机制研究,胃癌细胞经过放线菌酮（cycloheximide,CHX）或蛋白酶体抑制剂MG132处理后,Western Blot结果显示,RNF180通过泛素化途径降解DNMT3A,降低其在胃癌细胞中的稳定性。Co-IP实验显示RNF180结合DNMT3A,提高了DNMT3A在胃癌中的泛素化水平。结论1、ADAMTS9在胃癌组织中低表达,其表达水平与p N分期及淋巴结转移数目密切相关,ADAMTS9低表达组患者显示了更差的预后。ADAMTS9可能作为评估患者淋巴结转移及评估患者预后的分子标志物。2、ADAMTS9显着抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、ADAMTS9可能通过显着下调CCL5/CXCL11表达水平,从而抑制胃癌淋巴结转移。4、ADAMTS9启动子甲基化受到DNMT1及DNMT3A调控,以DNMT3A为甚。5、RNF180与DNMT3A直接相互作用,增强DNMT3A的泛素化降解,从而上调ADAMTS9的表达水平。
康文婷[10]（2020）在《USP7-MDM2抑制剂筛选方法的建立及USP7对LSD1的调控机制研究》文中指出蛋白质去泛素化是指由去泛素化酶水解泛素和蛋白质之间的硫酯键,进而移除底物上泛素分子的过程,从而保护底物不被蛋白酶体水解或者调控底物的亚细胞定位或活性。USP7是一个泛素特异性蛋白酶家族的成员,属于半胱氨酸蛋白酶类去泛素化酶。USP7能够调节细胞内许多蛋白底物的表达和活性,并在肿瘤的发生发展中起重要作用。但USP7在胃癌中的作用机制尚不明确,需进一步研究。MDM2是USP7的底物之一,同时还是一种致癌蛋白和E3连接酶,它促进了肿瘤抑制因子p53的降解,因此本课题第一部分旨在建立基于USP7与MDM2相互作用的抑制剂筛选方法,以期筛选出能够阻断USP7-MDM2相互作用的抑制剂,从而降低MDM2蛋白表达,进而使得细胞内p53的水平升高,最终达到抑制肿瘤的作用。另外,作为重要的肿瘤靶点,LSD1也是USP7的众多底物之一,USP7可以对LSD1起稳定作用,因此本课题的第二部分围绕USP7对LSD1的调控机制进行探索。本课题的主要研究内容包括:（1）基于组织芯片技术以及相关数据库的USP7相关蛋白的发现本课题通过组织芯片联合免疫组化实验结果分析发现,USP7在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。进而通过Kaplan Meier生存分析网站分别分析发现,USP7或MDM2高表达的胃癌患者生存期明显比低表达患者短。并且在胃癌组织中,USP7与LSD1表达量存在极显着的正相关性（r=0.302,p<0.0001）。最后利用BioGRID 3.5数据库,发现USP7与LSD1可发生蛋白质相互作用。（2）基于USP7与MDM2相互作用的小分子抑制剂筛选方法的建立分别构建USP7的N端与MDM2原核表达载体,采用亲和层析技术分别对蛋白进行纯化,得到了纯度较高的截短体USP7与MDM2重组蛋白。利用HTRF技术成功建立USP7与MDM2相互作用抑制剂筛选方法。（3）USP7对LSD1调控机制的研究本课题发现USP7表达量在AR高表达的胃癌组织中与LSD1表达量高度正相关（r=0.394,p=0.0001）。细胞水平研究发现,USP7可与LSD1的Tower与AOL结构域相互作用,并在胃癌细胞中以浓度依赖性的方式维持LSD1的稳定性。进一步的机制研究表明,USP7可通过去除LSD1的多聚泛素化显着延长LSD1的半衰期。最终确认USP7可在胃癌细胞中以AR依赖性的形式去除LSD1泛素化,维持LSD1稳定性。综上所述,本课题首次建立了基于HTRF技术的USP7-MDM2相互作用抑制剂筛选方法。发现胃癌细胞中USP7是可以AR依赖的方式调节LSD1,维持LSD1稳定性。该发现对未来胃癌患者的临床治疗的选择性和针对性具有重大意义。
二、mdm2、p14基因的扩增与胃癌的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、mdm2、p14基因的扩增与胃癌的关系（论文提纲范文）
（1）BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1 前列腺癌 |
| 1.1 PCa发病现状 |
| 1.2 PCa形成因素 |
| 1.3 PCa发生发展分子机制 |
| 1.4 PSA与PCa的关系 |
| 2 肿瘤分子标志物与PCa |
| 2.1 肿瘤分子标志物与癌症 |
| 2.2 PCa的肿瘤分子标志物 |
| 2.3 肿瘤标志物在PCa药物靶向治疗中的应用 |
| 3 BLM解旋酶 |
| 3.1 BLM解旋酶的结构与功能 |
| 3.2 BLM解旋酶的细胞生物学功能 |
| 3.3 BLM解旋酶与肿瘤 |
| 4 EZH2 蛋白 |
| 4.1 EZH2蛋白的结构与分子功能 |
| 4.2 EZH2蛋白与肿瘤 |
| 5 BLM、EZH2与PCa |
| 5.1 BLM、EZH2在PCa的靶向研究 |
| 5.2 BLM和EZH2与PCa的相关性分析 |
| 6.本研究的目的意义 |
| 7.研究内容与技术路线 |
| 7.1 研究内容 |
| 7.2 技术路线 |
| 第一章 BLM相互作用蛋白筛选和MS鉴定及BLM/EZH2 的定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 细胞系 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白提取 |
| 2.3 蛋白含量测定(BCA微孔酶标仪法) |
| 2.4 免疫共沉淀(免疫磁珠法) |
| 2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2.6 Western Blotting检测 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 2.8 原核表达载体构建和蛋白诱导表达 |
| 2.9 原核蛋白提取 |
| 2.10 GST-pull down |
| 2.11 间接免疫荧光 |
| 2.12 高效液相色谱质谱分析 |
| 2.13 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM蛋白在RWPE-1、PC3、22RV-1、LNcap细胞中的表达 |
| 3.2 免疫沉淀联合质谱分析,筛选与BLM具有互作的蛋白 |
| 3.3 生物信息学分析筛选互作蛋白 |
| 3.4 Co-IP正反向验证BLM与EZH2存在相互作用 |
| 3.5 BLM蛋白与EZH2蛋白体外相互作用验证 |
| 3.6 前列腺癌细胞中BLM与EZH2的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BLM及EZH2蛋白在前列腺癌组织中的表达水平及其关联 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验标本 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫组化实验 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BLM和EZH2在癌组织和对照组织中的差异性比较 |
| 3.2 BLM和EZH2在癌组织和对照组织中的表达分布 |
| 3.3 BLM和EZH2在前列腺组织中的表达与临床病理资料相关性分析 |
| 3.4 生物信息学分析前列腺癌组织和正常组织中蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 BLM和EZH2干扰对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 细胞系 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞蛋白提取和浓度测定 |
| 2.3 蛋白的WB检测 |
| 2.4 siRNA干扰序列的合成 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞存活率检测 |
| 2.7 细胞周期检测 |
| 2.8 细胞侵袭和迁移实验 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.11 细胞增殖实验(MTS法) |
| 2.12 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 前列腺癌细胞系的侵袭、迁移和增殖能力检测 |
| 3.2 BLM特异性抑制剂对PC3细胞活性及细胞周期的影响 |
| 3.3 BLM、EZH2和P53蛋白干扰前后在癌细胞中的表达情况 |
| 3.4 干扰BLM和EZH2后对PC3细胞增殖、迁移、侵袭、划痕愈合和克隆形成的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 BLM和EZH2干扰或表达对前列腺癌细胞的影响及其机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 细胞系及载体 |
| 1.4 实验试剂及配制方法 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞蛋白提取和浓度测定 |
| 2.3 蛋白的WB检测 |
| 2.4 重组质粒的构建 |
| 2.5 ChIP-seq实验 |
| 2.6 双荧光素酶活性的检测 |
| 2.7 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.8 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIP-seq实验检测EZH2可能作用的启动子区 |
| 3.2 利用双荧光素酶实验验证EZH2蛋白与MDM2启动子区的结合 |
| 3.3 干扰或过表达BLM和EZH2对PC3细胞P53和MDM2蛋白的影响 |
| 3.4 干扰或过表达BLM和EZH2对PC3细胞增殖、迁移、侵袭、划痕愈合、克隆形成的影响 |
| 3.5 BLM和EZH2相互作用对PC3细胞P53信号通路的影响 |
| 3.6 裸鼠成瘤实验检测BLM和EZH2对PC3细胞成瘤能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:在读博士期间取得的科研成果 |
| 附录Ⅱ:论文涉及的试剂配方 |
（2）MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（3）线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（4）转录因子ZNF703影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 ZNF703在卵巢癌中的表达对卵巢癌细胞侵袭和转移的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 标本来源 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 主要材料 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组化 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 慢病毒转染 |
| 2.2.4 SiRNA转染 |
| 2.2.5 qRT-PCR |
| 2.2.6 Western Blot |
| 2.2.7 MTT实验 |
| 2.2.8 细胞凋亡实验 |
| 2.2.9 细胞周期实验 |
| 2.2.10 细胞迁移实验 |
| 2.2.11 细胞侵袭实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 卵巢癌组织中ZNF703的表达情况及临床意义 |
| 3.2 ZNF703过表达促进卵巢癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡和细胞周期阻滞 |
| 3.3 ZNF703过表达促进卵巢癌细胞的侵袭和转移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 HE4对ZNF703蛋白亚细胞定位及功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 免疫共沉淀 |
| 2.2.4 细胞免疫荧光共聚焦 |
| 2.2.5 核浆蛋白分离实验 |
| 2.2.6 MTT实验 |
| 2.2.7 细胞侵袭实验 |
| 2.2.8 细胞迁移实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀检测ZNF703与HE4的结构关系 |
| 3.2 ZNF703与HE4的表达相关性 |
| 3.3 HE4促进ZNF703核易位 |
| 3.4 HE4对ZNF703促进的恶性生物学行为的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 ZNF703转录调节PEA15促进卵巢癌增殖 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 染色质免疫共沉淀测序 |
| 2.2.3 ChIP-PCR |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶水平电泳 |
| 2.2.5 荧光素酶报告基因 |
| 2.2.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.7 石蜡包埋、切片及染色 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIP-seq检测ZNF703 的调节靶点 |
| 3.2 ZNF703 直接结合PEA15 的启动子区促进PEA15 的转录 |
| 3.3 PEA15 在卵巢癌组织中的表达及预后意义 |
| 3.4 HE4 对PEA15 的表达及磷酸化的影响 |
| 3.5 体内实验证明ZNF703 通过调节PEA15 促进卵巢癌增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 锌指蛋白703的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）基于肺腺癌高表达UBE2探索泛素连接酶HECTD3在肺腺癌中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 肺腺癌中差异表达的E2泛素结合酶与其相关的E3泛素连接酶的筛选 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 HECTD3在肺腺癌中的表达及意义 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 基于公共数据库HECTD3在肺腺癌中的表达及功能预测 |
| 2.3 基于临床样本HECTD3表达验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 HECTD3过表达细胞及敲除细胞系的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 构建HECTD3过表达及敲除细胞系所使用的野生型肺腺癌细胞筛选 |
| 3.3 HECTD3过表达慢病毒载体构建与病毒包装及细胞筛选 |
| 3.4 HECTD3-sgRNA慢病毒载体构建及HECTD3敲除稳转细胞系(knockout,KO)筛选 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 探索HECTD3对肺腺癌细胞功能的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料、试剂和主要设备 |
| 4.3 HECTD3对肺腺癌细胞增殖能力的影响 |
| 4.4 HECTD3对肺腺癌细胞侵袭能力的影响 |
| 4.5 HECTD3对肺腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 实验结论 |
| 参考文献 |
| 综述 E3泛素连接酶在肿瘤中的作用及HECTD3的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间内的主要研究成果 |
（6）TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 ACRG分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TCGA分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ACRG亚型MSI和EMT存在预后差异的分子机制探索 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TCGA和ACRG相关检测指标在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）胃癌中SPIN1的异常表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 外文论文 |
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| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）CCDC43-ADRM1轴受YY1调控，促进胃癌增殖、侵袭和转移（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 CCDC43促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 CCDC43-ADRM1轴,促进胃癌的增殖、侵袭和转移 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 CCDC43-ADRM1轴受YY 1调控,促进胃癌的增殖、侵袭和转移 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）ADAMTS9经RNF180-DNMT3上调抑制胃癌淋巴结转移（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、ADAMTS9 与胃癌患者淋巴结转移及预后相关 |
| 1.1 研究对象和方法 |
| 1.1.1 临床样本的采集 |
| 1.1.2 主要实验材料及仪器 |
| 1.1.3 实验方法及免疫组化的评分方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 研究结果 |
| 1.2.1 ADAMTS9 在胃癌组织中m RNA表达情况及临床资料分析 |
| 1.2.2 ADAMTS9 在胃癌组织中蛋白表达情况及临床资料分析 |
| 1.2.3 ADAMTS9 表达情况与胃癌患者临床预后分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、ADAMTS9抑制胃癌细胞的增殖和运动能力及其机制研究 |
| 2.1 研究方法 |
| 2.1.1 研究细胞系 |
| 2.1.2 主要实验材料及仪器 |
| 2.1.3 实验方法及步骤 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 ADAMTS9 在胃癌细胞中表达情况 |
| 2.2.2 ADAMTS9 抑制细胞增殖及存活能力 |
| 2.2.3 ADAMTS9 抑制细胞迁移及侵袭能力 |
| 2.2.4 ADAMTS9 抑制裸鼠体内皮下成瘤能力 |
| 2.2.5 细胞全转录组测序及分析 |
| 2.2.6 ADAMTS9 显着降低CCL5/CXCL11 表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、ADAMTS9 表达水平受其启动子甲基化调控 |
| 3.1 研究方法 |
| 3.1.1 研究细胞系 |
| 3.1.2 实验材料及仪器 |
| 3.1.3 实验方法及步骤 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 ADAMTS9 表达水平受其启动子甲基化水平调控 |
| 3.2.2 ADAMTS9 启动子甲基化水平主要经DNMT3A调控 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、RNF180 通过泛素化降解DNMT3A上调ADAMTS9 表达 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.1.1 研究细胞系 |
| 4.1.2 实验材料及仪器 |
| 4.1.3 主要实验方法及步骤 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 胃癌组织免疫组化及GEPIA在线数据库分析潜在相关性 |
| 4.2.2 RNF180 泛素化降解DNMT3A上调ADAMTS9 表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 E3泛素链接酶在肿瘤中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）USP7-MDM2抑制剂筛选方法的建立及USP7对LSD1的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 1.1 翻译后修饰 |
| 1.2 泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.3 去泛素化酶(DUBs) |
| 1.4 泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin specific protease 7,USP7) |
| 1.4.1 USP7的结构与功能 |
| 1.4.2 USP7在癌症中的生物学作用 |
| 1.4.3 USP7的底物 |
| 1.4.4 USP7抑制剂的发展现状 |
| 1.5 本文的研究目的与主要内容 |
| 2 基于组织芯片技术以及相关数据库的USP7相关蛋白的发现 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法与原理 |
| 2.2.1 组织芯片技术(Tissue microarray,TMA) |
| 2.2.2 免疫组织化学(Immunohistochemistry,HC) |
| 2.2.3 统计分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 胃癌患者信息统计 |
| 2.3.2 胃癌患者癌与癌旁组织中USP7表达量分析 |
| 2.3.3 USP7与MDM2在胃癌患者中的Kaplan Meier生存分析 |
| 2.3.4 胃癌患者中LSD1的表达与生存期的关系 |
| 2.3.5 胃癌患者癌组织中USP7与LSD1表达量的相关性 |
| 2.3.6 基于BioGRID 3.5数据库的USP7与LSD1蛋白质相互作用 |
| 2.4 小结 |
| 3 基于USP7与MDM2相互作用的小分子抑制剂筛选方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 溶液的配制 |
| 3.2 实验方法和原理 |
| 3.2.1 pGEX-6p-1-USP7和pCOLADuet-1-MDM2截短体原核表达载体构建 |
| 3.2.2 pGEX-6p-1-USP7和pCOLADuet-1-MDM2截短体蛋白表达纯化 |
| 3.2.3 基于HTRF技术的pGEX-6p-1-USP7和pCOLADuet-1-MDM2重组蛋白相互作用的检测 |
| 3.2.4 基于Graphpad Prism 6.0软件的蛋白与配体结合曲线的绘制以及结合常数的计算 |
| 3.2.5 筛选方法的系统稳定性评价 |
| 3.2.6 筛选方法的应用性评价 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 pGEX-6p-1-USP7截短体原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 pGEX-6p-1-USP7重组质粒的蛋白表达纯化 |
| 3.3.3 pCOLADuet-1-MDM2截短体原核表达载体的构建 |
| 3.3.4 pCOLADuet-1-MDM2重组质粒的蛋白表达纯化 |
| 3.3.5 基于HTRF技术的USP7与MDM2相互作用活性测定及条件优化 |
| 3.3.6 USP7与MDM2蛋白之间结合曲线的绘制以及结合常数测定 |
| 3.3.7 筛选方法的系统稳定性评价结果 |
| 3.3.8 筛选方法的应用性评价结果 |
| 3.4 小结 |
| 4 USP7对LSD1的调控机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 溶液的配制 |
| 4.1.4 细胞株与质粒 |
| 4.2 实验方法与原理 |
| 4.2.1 Western blotting实验 |
| 4.2.2 USP7低表达稳转细胞系的建立 |
| 4.2.3 细胞转染(以6孔板为例) |
| 4.2.4 免疫共沉淀实验 |
| 4.2.5 体外去泛素化实验 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 USP7在体内以AR依赖的方式促进LSD1蛋白水平的稳定 |
| 4.3.2 USP7与LSD1的相关性与AR表达水平的关系 |
| 4.3.3 USP7在体外以浓度依赖的方式促进LSD1蛋白的稳定 |
| 4.3.4 LSD1和USP7在体外相互作用 |
| 4.3.5 LSD1通过C端Tower与AOL结构域和USP7在体外相互作用 |
| 4.3.6 LSD1和USP7在体内相互作用 |
| 4.3.7 USP7特异地促进LSD1蛋白的稳定 |
| 4.3.8 USP7可在体外促进LSD1去多聚泛素化 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、mdm2、p14基因的扩增与胃癌的关系（论文参考文献）
- [1]BLM-EZH2相互作用影响前列腺癌细胞增殖的分子机制研究[D]. 阮涌. 贵州大学, 2021(01)
- [2]MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究[D]. 王婧雯. 山东大学, 2021(12)
- [3]线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究[D]. 张亮. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]转录因子ZNF703影响卵巢癌恶性生物学行为的机制研究[D]. 王爽. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]基于肺腺癌高表达UBE2探索泛素连接酶HECTD3在肺腺癌中作用的研究[D]. 王彦卿. 北京协和医学院, 2021(02)
- [6]TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究[D]. 王强. 河北医科大学, 2021(02)
- [7]胃癌中SPIN1的异常表达及作用机制研究[D]. 吕蓓蓓. 山东大学, 2020(04)
- [8]CCDC43-ADRM1轴受YY1调控，促进胃癌增殖、侵袭和转移[D]. 王静. 南方医科大学, 2020
- [9]ADAMTS9经RNF180-DNMT3上调抑制胃癌淋巴结转移[D]. 孙伟林. 天津医科大学, 2020(06)
- [10]USP7-MDM2抑制剂筛选方法的建立及USP7对LSD1的调控机制研究[D]. 康文婷. 郑州大学, 2020(02)