ANP32A&B调控HIV-1复制的分子机制研究

论文摘要

人类免疫缺陷病毒-1型（Human Immunodeficiency Virus,HIV-1）属于逆转录病毒科慢病毒属,其基因组由两条单股正链RNA组成。目前由于该病毒在感染人体内极易发生变异,并具有复杂的免疫逃逸机制,因此仍没有有效的疫苗进行预防。HIV-1在宿主细胞内完成其复制过程大体需要以下几个环节:首先病毒囊膜蛋白与细胞表面的受体和辅佐受体结合、脱壳、逆转录形成双链cDNA进入细胞核、整合到宿主基因组、病毒基因的转录和剪切、病毒mRNA转运至细胞质、翻译病毒的结构蛋白和非结构蛋白、病毒粒子的出芽、成熟及释放等。HIV-1病毒在人体内需要借助大量的宿主因子完成其复制过程。ANP32A和ANP32B均属于ANP32蛋白家族成员,其结构比较保守,N端为亮氨酸富集区,C端为酸性结构域。据报道ANP32A&B蛋白可以通过影响聚合酶的活性参与流感病毒的复制过程,而且可以促进逆转录病毒科中泡沫病毒RNA的核输出过程,但是其具体的机制以及对其它逆转录病毒的影响仍没有明确的报道。为了探索ANP32A&B在HIV-1复制中的作用,本研究首先利用CRISPR/Cas9技术构建了ANP32A和ANP32B单基因和双基因敲除的293T细胞系,分别命名为AKO、BKO和DKO。将表达VSV-G囊膜糖蛋白的质粒与囊膜蛋白缺失、表达荧光素酶（Luc）的人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）基因组的质粒共转染至四种细胞系中以包装HIV-1假病毒。收取细胞和病毒上清分别进行WB检测,结果显示AKO和BKO细胞系中P55和P24蛋白的表达与野生型相比没有明显的变化,而DKO细胞中的表达量明显低于WT细胞。同时在DKO细胞中单独补回ANP32A或者ANP32B的表达后Gag的表达量得到了明显的恢复。以上结果表明ANP32A和ANP32B在HIV-1病毒组装和Gag蛋白表达过程中具有重要作用。为了进一步研究ANP32A&B影响HIV-1组装的作用机制,我们对HIV-1复制的关键环节依次进行检测。首先对HIV-1假病毒感染细胞后的早晚期逆转录产物和病毒mRNA的产量进行了荧光定量分析,结果显示ANP32A&B基因缺失对早晚期逆转录产物没有明显的变化,但是HIV-1 gag mRNA的总量与野生型细胞相比降低10倍左右。对未完全剪切的和完全剪切的mRNA的核质比例进行荧光定量分析,结果显示DKO细胞中未完全剪切的gag mRNA主要集中在细胞核中,而在WT细胞中则主要集中在细胞质中。同时选取了完全剪切的tat mRNA进行检测,结果显示tat mRNA无论在WT还是DKO细胞中均主要位于细胞质中,该结果表明ANP32A&B可以特异性的影响未完全剪切mRNA的转运过程。此外,利用RNA Scope对gag mRNA进行细胞内定位分析,激光共聚焦和3D-SIM拍照结果均显示DKO细胞中mRNA几乎全部定位在细胞核中,而在野生型细胞中则主要位于细胞质中。因为未完全剪切RNA的核输出过程是由Rev蛋白所介导的,我们进一步分析了ANP32A&B蛋白与Rev蛋白之间的相互作用,结果显示外源性的ANP32A&B以及内源性的ANP32B均能够与Rev蛋白发生相互作用,且Rev蛋白的RNA结合区以及ANP32B的亮氨酸富集区是Rev与ANP32B发生相互作用的关键结构域。此外,双分子荧光互补技术也证明ANP32与Rev能够在细胞核中发生相互作用。因为Rev蛋白结合含有RRE应答元件的RNA,为了研究ANP32A&B对含有RRE的RNA的作用机制,我们利用pDM628-RRE-luc和pDM628-4×CTE-luc进行荧光素酶RNA核质比例分析,结果显示含有RRE的RNA在DKO中细胞核的比例要高于WT细胞,但是对于依赖CTE的RNA在两种细胞中的核质比例则没有明显的变化,该结果表明ANP32A&B可以特异性的影响RRE介导的RNA核质转运过程。最后,为了探索ANP32A&B是否参与CRM1依赖的核输出过程,我们利用Co-IP、Confocal和BiFC技术证明ANP32A&B能够与CRM1发生相互作用,主要定位在核膜上,且LMB处理后可以增强两者的相互作用。LMB是CRM1的抑制剂,抑制CRM1功能后HIV-1未剪切的mRNA被滞留在细胞核中。在WT细胞中我们发现加入LMB后细胞内P55表达量显著降低,在DKO细胞中ANP32A&B的缺失影响了P55的表达,然而LMB处理后P55的表达进一步降低。该结果表明ANP32A&B与CRM1蛋白共同促进病毒未完全剪切RNA的核输出过程。综上所述,本研究首次报道了ANP32A&B在HIV-1复制过程中发挥关键性作用,可以通过影响Rev介导的未完全剪切mRNA的核质转运帮助蛋白的表达和病毒组装过程。

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摘要

Abstract

英文缩略表

第一章引言

1.1 HIV-1概述

1.1.1 艾滋病流行病学

1.1.2 HIV-1病毒的基因组

1.1.3 HIV-1病毒的生活周期

1.1.4 HIV-1病毒感染的临床症状

1.1.5 HIV-1病毒的蛋白功能

1.2 HIV-1与宿主的相互作用

1.2.1 能够抑制HIV-1复制的宿主限制因子

1.2.2 能够支持HIV-1复制的宿主辅助因子

1.3 ANP32蛋白研究概述

1.3.1 ANP32蛋白简介

1.3.2 ANP32蛋白的结构

1.3.3 ANP32蛋白调控细胞内的转运过程

1.3.4 ANP32蛋白家族调节磷酸酶的活性

1.3.5 ANP32蛋白可以调节核染色质的结构

1.3.6 ANP32蛋白在细胞内的分布

1.3.7 ANP32蛋白家族与人类疾病之间的关系

1.3.8 ANP32A&B对病毒复制的影响

1.4 研究目的与意义

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞与病毒

2.1.2 实验所用仪器

2.1.3 实验所用试剂

2.1.4 实验所用抗体

2.1.5 实验所用质粒

2.2 方法

2.2.1 Western blot检测

2.2.2 ANP32A和ANP32B guide RNA引物的设计和质粒的构建

2.2.2.1 PCR反应

2.2.2.2 转化

2.2.2.3 质粒提取

2.2.3 ANP32A和ANP32B单基因和双基因敲除细胞系的构建

2.2.3.1 质粒转染至细胞

2.2.3.2 细胞RNA提取

2.2.3.3 RNA反转录

2.2.3.4 PCR产物胶回收

2.2.3.5 目的片段与载体的连接

2.2.4 组织细胞DNA提取

2.2.5 RNA的核质分离提取

2.2.6 荧光定量PCR

2.2.7 RNA Scope

2.2.8 激光共聚焦

2.2.9 免疫共沉淀

2.2.10 双分子荧光互补技术（BiFC）

2.2.11 假病毒的包装

2.2.12 嘌呤霉素工作浓度的确定

2.2.13 假病毒的制备

2.2.14 稳定补回表达ANP32A或者ANP32B细胞系的建立

2.2.15 数据处理与分析

第三章主要研究结果

3.1 ANP32A和ANP32B氨基酸序列和蛋白结构分析

3.2 ANP32A和ANP32B基因敲除细胞系的构建

3.2.1 ANP32A和ANP32B基因敲除细胞系WB鉴定

3.2.2 ANP32A和ANP32B mRNA在各个细胞系中的荧光定量分析

3.3 ANP32A&B双基因缺失显著降低HIV-1病毒组装和Gag蛋白表达

3.4 稳定表达ANP32A和ANP32B细胞系的建立及功能验证

3.5 ANP32A和ANP32B基因缺失对早晚期逆转录产物的影响

3.6 ANP32A和ANP32B基因缺失抑制HIV-1总RNA的产生

3.7 ANP32A&B双基因缺失抑制HIV-1未完全剪切mRNA的核输出过程

3.8 RNAScope证明ANP32A&B双基因缺失后大部分gag mRNA被阻滞在细胞核中

3.9 ANP32A&B特异性的影响RRE依赖的RNA的转运过程

3.10 ANP32A&B能够与Rev蛋白发生相互作用

3.11 ANP32A&B功能的发挥依赖CRM1核输出途径

3.12 CRM1与Rev的相互作用并不依赖于ANP32A&B

第四章讨论

第五章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王玉杰

导师: 王晓钧

关键词: 艾滋病病毒,未剪切,核质转运

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然基金,青年科学基金项目

分类号: R373

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000030

总页数: 79

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