导读:本文包含了外源多肽论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:多肽,蛋白,大豆,噬菌体,半胱氨酸,大分子,可溶性。
外源多肽论文文献综述
贺红利,牛陆,杨静,邢国杰,赵倩倩[1]（2018）在《玉米γ-Zein多肽融合增强外源重组蛋白在大豆种子中的高效积累》一文中研究指出大豆(Glycine max)种子的高水平蛋白合成和积累能力,为外源重组蛋白的高效表达提供了理想的表达宿主。为进一步提高外源蛋白在大豆种子中的表达水平,本研究基于多肽融合策略,研究玉米(Zea mays)醇溶蛋白γ-Zein对外源蛋白在大豆种子中积累水平的影响。采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,分别将大豆种子特异性启动子基因β'-伴球蛋白基因启动子(β-conglycininalpha subunit promoter, BCSP)驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)编码基因和Zein-GFP基因导入栽培大豆品种,共获得Zein-GFP转基因植株41株,GFP转基因植株46株。反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)和Western blot检测表明,外源基因Zein-GFP和GFP在转基因大豆种子中均能够正常转录和翻译。选取外源基因mRNA表达水平相近的T3代转基因大豆株系进行酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)分析表明,转基因大豆种子中融合蛋白Zein-GFP平均表达水平为1.51%TSP (1.37%~1.60%TSP)(可溶性蛋白总量, total soluble protein),未融合蛋白GFP平均表达水平为0.14%TSP(0.13%~0.15%TSP)。融合蛋白Zein-GFP在转基因大豆种子中的积累水平较GFP提高10.78倍。激光共聚焦扫描分析进一步表明,融合蛋白Zein-GFP在转基因大豆种子中主要以蛋白体的形式存在,而未融合GFP蛋白则主要分布在胞质中。本研究结果表明,γ-Zein多肽融合促进了重组蛋白在细胞蛋白体中的积累,并显着提高其在大豆种子中的表达水平。本研究为加快大豆种子反应器的应用提供依据。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2018年10期）
孙杨东[2]（2016）在《Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在机理研究》一文中研究指出大肠杆菌表达系统是目前基因工程领域中应用最广泛、最成功的表达系统,具有遗传背景清晰明确、培养条件简单经济、生长迅速、质粒宿主种类多样性等特点。但在实际应用中,存在外源蛋白的表达效率不稳定,部分外源蛋白表达以不可溶性包涵体形式存在等问题。因此,寻找既能实现外源蛋白的高产量表达,又能尽可能使其以可溶形式表达的调控策略的探索具有广泛的应用前景。Tat(Trans-activator transduction)是人类免疫缺陷病毒-1(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)编码的富含碱性氨基酸的多肽,已知能介导多种外源物质通过各种膜性结构并保持生物活性。我们前期研究Tat碱性多肽穿膜效应时,首次发现Tat碱性多肽同样具有促进外源蛋白高产量及可溶性表达的新功能,并在国际上首次报道了该现象,但其潜在的作用机理尚不清楚。基于此,本文从以下几个方面开展相关研究:一、Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达的普适性。方法:我们以线虫(C.clegans)、酵母(yeast)不同分子量(超小分子量、小分子量、中分子量、大分子量)靶蛋白作为研究对象,包括线虫超小分子量蛋白MTL-1(Metal-binding proteins-1,MTL-1)、MTL-2,线虫小分子量蛋白SOD-1(Superoxide Dismutase-1,SOD-1)、SOD-2,线虫中分子量蛋白GPD-3(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD-3)、酵母中分子量蛋白GAP-3,线虫大分子量蛋白DAF-16(Decay accerlerating factor-16,Daf-16)、HSP-70(Heat shock protein-70,HSP-70)。通过逆转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)方法获得编码基因并成功构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体,诱导剂异丙基β-d-硫代半乳糖甘(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后采用SDS-PAGE技术检测诱导不同时间点(0 hrs、2 hrs、4 hrs、6 hrs)蛋白表达水平。结果:成功获得超小分子量、小分子量、中分子量、大分子量外源蛋白的含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,Tat碱性多肽可促进小分子量蛋白(MTL-1、MTL-2、SOD-1、SOD-2)高产量、可溶性表达,促进中分子量蛋白可溶性表达,但对大分子量蛋白表达的促进作用不明显。同时,适用于不同物种(线虫、酵母)中低分子量外源蛋白的高产量、可溶性表达。结论:Tat碱性多肽可促进不同物种中低分子量外源蛋白高产量、可溶性表达,但对大分子量外源蛋白的表达促进作用不明显。二、Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在作用机理研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在作用机理。方法:我们以大肠杆菌超氧化物歧化酶SOD家族成员SOD-A、SOD-B、SOD-C作为研究对象,通过RT-PCR方法获得编码基因并构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体,蛋白IPTG诱导后采用SDS-PAGE技术和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测诱导不同时间点(0 hrs、2 hrs、4 hrs、6 hrs)蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白诱导不同时间点菌体的SOD总酶活变化,采用微生物全自动生长曲线仪检测诱导表达的Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白的抗百草枯(Parqual,PQ)活性,同时采用实时定量PCR技术(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR技术)检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白菌体的信使RNA(Messenger RNA,m RNA)转录水平。进一步地,采用亲和层析技术分离纯化含Tat标签蛋白和不含Tat标签蛋白,利用圆二色谱(Circular dichroism,CD)分析仪检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白的二级结构变化。结果:成功获得大肠杆菌SOD-A、SOD-B、SOD-C含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,Tat碱性多肽可以促进SOD-A、SOD-B、SDOC高产量、可溶性表达;ELISA和微生物生长曲线检测结果表明,含Tat标签蛋白的诱导表达蛋白菌体的总酶活显着高于非Tat标签蛋白;且Tat标签蛋白诱导表达菌体的抗PQ活性显着高于非Tat标签蛋白,特别是Tat-SOD-A和SOD-A组之间存在显着性差异;q RT-PCR结果表明,含Tat标签蛋白的m RNA转录水平显着高于不含Tat标签蛋白;圆二色谱法测定结果表明,Tat标签蛋白的α-螺旋比例和β转角显著增加,β-转角折迭比例显着减少。结论:Tat碱性多肽通过增加m RNA转录水平促进大肠杆菌SOD系列蛋白外源蛋白高产量、可溶性表达,含Tat标签蛋白的菌体具有明显的生物酶活及抗PQ活性,其中SOD-A基因在抗PQ活性发挥重要作用;且Tat标签蛋白的二级结构发生显着改变。叁、Tat碱性多肽促进外源蛋白4℃高产量表达的研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进外源蛋白4℃高产量表达的作用机理。方法:我们以大肠杆菌增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)作为研究对象,通过RT-PCR方法获得编码基因并构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体。4℃低温条件下IPTG诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测IPTG诱导144 hrs后,含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白表达水平。随后,采用SDS-PAGE、Western blot和荧光显微镜检测IPTG诱导不同时间点(0 hrs、24 hrs、48 hrs、72 hrs、96 hrs、120 hrs、144 hrs),Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白表达水平。最后,采用荧光显微镜观察4℃不含IPTG诱导后,Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白单克隆泄露表达水平变化。结果:成功获得大肠杆菌EGFP、NGB含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,Tat碱性多肽可以促进4℃诱导表达144 hrs后蛋白高产量、可溶性表达;随着诱导表达时间增加,含Tat标签蛋白的蛋白表达产量逐渐升高。在不加IPTG诱导剂的情况下,含Tat标签蛋白的泄露表达产量显着高于非Tat标签蛋白。结论:Tat碱性多肽可促进外源蛋白4℃高产量表达,且表达产量随着诱导时间的增加而显着提高。在不加IPTG表达下,Tat碱性多肽促进外源蛋白泄露表达,且表达产量随着诱导时间的增加而显着提高。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-12-01）
熊丹,何士雯,赵海锋[3]（2012）在《外源多肽对酵母发酵性能影响的探讨》一文中研究指出麦汁α-氨基氮是影响啤酒品质的重要因素。本文主要研究大豆肽作为补充氮源用于啤酒酿造的可行性,并阐明大豆肽对啤酒酵母增殖、发酵性能和啤酒质量的影响,同时实验其用于啤酒超高浓酿造,缩短啤酒发酵周期的潜在可能性。(本文来源于《啤酒科技》期刊2012年10期）
付爱玲[4]（2011）在《多肽引导外源性蛋白质入脑转运的研究》一文中研究指出现代老年社会需要大量治疗脑肿瘤、中风、老年性痴呆等中枢神经系统(CNS)疾病的药物。然而,市场上治疗CNS的药物严重不足,与种类繁多的心血管系统药物相比,CNS药物的数量少于5倍以上。使用综合药物化学数据库分析了超过7,000种药物,能够影响CNS的药物仅有5%,而这些药物主要用于治疗抑郁症和失眠等精神性疾病。CNS药物发展的瓶颈在于血脑屏障(BBB)。BBB阻碍了具有治疗潜力的大分子蛋白质从外周顺利进入脑内。脑表面积约为12m~2,共包含约一亿条毛细血管,每根神经几乎都有一条毛细(本文来源于《全国第十二届生化与分子药理学学术会议论文集》期刊2011-08-19）
金文刚,吴海涛,许景光,刘冰,朱蓓薇[5]（2010）在《海参肠外源酶解制备多肽及分离的研究》一文中研究指出海参肠为海参加工的副产物,具有较高的营养价值。经测定,海参肠中粗蛋白含量达到干基的70.94±0.57%,是开发活性多肽的良好资源。利用中性蛋白酶,分别以变性处理(100℃,10min)和未变性处理的海参肠匀浆为底物,经50℃酶解3h后获得两种海参肠酶解液。结果表明,变性和未变性海参肠酶解后水解度分别为37.28%和23.76%,肽得率分别为25.13±1.59%和13.97±1.25%,说明利用煮沸对海参肠进行变性处理可以显着提高水解度和多肽得率。经Superdex Peptide 10/300GL凝胶过滤色谱分析,海参肠多肽组分的分子量主要分布范围为500～5000Da,占水解液的54.87%(变性)和37.89%(未变性)。以上结果说明,结合变性预处理工序,利用中性蛋白酶可获得较低分子量范围的海参肠多肽,具有潜在的开发价值。(本文来源于《中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集》期刊2010-11-04）
陶亮[6]（2010）在《外源多肽对NaCl胁迫下巴西蕉幼苗生理特性的影响》一文中研究指出本研究以我国香蕉主栽品种之一巴西蕉幼苗(Musa AAA Cavendish subgroup cv. Brazil)为材料,采用营养液栽培,研究四种不同浓度(400倍、600倍、800倍和1000倍)外源多肽对盐胁迫(150 mmol·L-1 NaCl)下巴西蕉幼苗的生长、光合作用、抗氧化酶活性、离子分布的影响,目的是阐明多肽提高巴西蕉耐盐性的生理生化机制,为香蕉生产中应用多肽提供理论依据,也为深入研究多肽对香蕉耐盐的影响提供思路。结果如下：1. NaCl胁迫下抑制巴西蕉幼苗的生长,600、800、1000倍液多肽可显着提高巴西蕉幼苗地上部分植株含水量及叶片相对含水量；而400倍液多肽处理对盐胁迫下巴西蕉幼苗生长起抑制作用。2. NaCl胁迫下,巴西蕉幼苗根系活力和根系活跃吸收面积都随胁迫时间延长而减小。其中400倍液多肽下降程度最大,而600、800、1000倍液多肽的下降程度较小,对维持巴西蕉幼苗生命活动所需的水分和养分供应起到一定保护作用。3. NaCl胁迫下,巴西蕉幼苗的渗透调节功能受到刺激,表现为脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质的含量在处理初期明显增加,但随着胁迫时间的延长,各渗透调节物质的含量转为下降,说明巴西蕉幼苗所受盐害加重。600、800、1000倍液多肽处理,可提高巴西蕉幼苗渗透调节物质含量的同时,还能使这些物质维持在较高的浓度。4. NaCl胁迫下,巴西蕉幼苗叶片的叶绿素含量下降,净光合速率降低,光化学效率降低。600、800、1000倍液多肽减缓了胁迫下巴西蕉幼苗叶片叶绿素含量降低,保持较高的光化学活性和光合速率。5. NaCl胁迫下,巴西蕉幼苗活性氧代谢系统受到严重影响,促进膜脂的过氧化反应。巴西蕉幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性先升高后降低,膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量升高,质膜透性增大。600、800、1000倍液多肽能降低MDA的积累和质膜透性,有效缓解NaCl胁迫引起的巴西蕉幼苗的膜脂过氧化,显着提高巴西蕉幼苗SOD、POD、CAT的活性,并能够保证其在长时间内维持较高的活性,从而降低了MDA的含量,维持了膜的稳定性,提高了巴西蕉幼苗的耐盐性。6. NaCl胁迫下,巴西蕉幼苗地下部分(根系)和地上部分(假茎和叶片)中Na+含量升高,K+／Na+比值降低。随着NaCl胁迫时间的延长Na+含量增加、K+／Na+比值降低差异显着,而K+含量变化不显着。600、800、1000倍液多肽能降低巴西蕉植株体内Na+含量,增加K+／Na+比值。可见,适度的多肽是通过减少Na+的吸收,来增强巴西蕉幼苗的耐盐性。7.本试验添加不同浓度的多肽,其中以600倍液的多肽提高巴西蕉幼苗的各项生理生化指标的效果最佳。但其分子基础等尚不十分清楚,因此多肽提高香蕉耐盐性的机制尚需进一步研究。(本文来源于《海南大学》期刊2010-06-01）
马吉春[7]（2010）在《外源性肿瘤抗原MUC1串联重复序列多肽抑制肿瘤细胞生长机制的研究》一文中研究指出MUC1是黏蛋白家族中的跨膜糖蛋白,不仅具有润滑、保护及调节细胞间的粘附等机械作用,而且作为癌基因可导致正常细胞恶性转化。可溶性MUC1(MUC1/SEC)通过抑制DC细胞成熟而抑制Th1细胞,还发现其可通过调节天然免疫和T细胞免疫抑制肿瘤生长。我们的研究首次发现外源性MUC1串联重复序列多肽(MUC1多肽)能直接抑制T淋巴瘤Jurkat、肝癌SMCC7721、乳腺癌MCF-7、B淋巴瘤Raji和单核淋巴瘤U937细胞增殖。而且MUC1多肽也能抑制BABL/c小鼠Jurkat细胞皮下移植瘤的生长(P<0.05)。为研究MUC1多肽抑制肿瘤生长的机制,我们首先检测MUC1多肽是否诱导细胞凋亡。经Giemsa染色和Annexin V/PI双标记法检测结果显示未见明显的凋亡细胞。细胞周期分析结果显示MUC1多肽诱导Jurkat细胞生长抑制,细胞周期阻滞在G0/G1期。有研究报道MUC1/SEC可以与细胞膜上MUC1/Y结合。因此我们进一步调查MUC1多肽是否与细胞表面MUC1蛋白相互作用抑制肿瘤生长。流式细胞仪检测肿瘤细胞表面MUC1蛋白的表达结果显示,Jurkat、SMCC7721、MCF-7细胞表面MUC1蛋白表达较高,而Raji和U937细胞表达略低。应用抗MUC1多克隆抗体封闭Jurkat细胞表面MUC1表位后再用MUC1多肽刺激,结果发现MUC1多肽诱导的生长抑制几乎全部消失。在MUC1过表达试验中,发现MUC1多肽明显抑制稳定转染MUC1基因的B16-MUC1细胞生长,但对B16细胞和转染空载体的B16-neo细胞生长无明显作用。应用MUC1 siRNA沉默Jurkat细胞MUC1表达后,再用MUC1多肽刺激,结果发现MUC1多肽诱导的Jurkat细胞生长抑制作用消失。GST pull down实验显示MUC1多肽与细胞表面MUC1蛋白存在直接相互作用。上述结果证实外源性MUC1多肽抑制肿瘤细胞生长是通过结合细胞表面MUC1蛋白发挥作用,进一步揭示MUC1作为癌基因在细胞恶性转化中的作用。本研究首次发现外源性MUC1串联重复序列多肽具有直接抑制肿瘤生长作用并揭示其作用机制,为恶性肿瘤治疗提供新的研究思路,为开发新的抗肿瘤药物奠定坚实的研究基础,为研究MUC1蛋白的生物学功能建立新的配体模型。(本文来源于《吉林大学》期刊2010-04-01）
葛体达,宋世威,黄丹枫[8]（2010）在《温度对土壤中外源氨基酸、多肽的矿化及其吸收动力学的影响》一文中研究指出研究了不同温度(1℃、15℃和25℃)对3种园艺生产系统(有机生产系统OS、转换期生产系统TS、常规生产系统CS)土壤中外源添加氨基酸、多肽的矿化及其吸收动力学特性的影响.结果表明:随着温度的升高,外源添加的氨基酸和多肽在土壤中的矿化速度加快.在1℃、15℃和25℃下,3种供试土壤中谷氨酸(Glu)的平均半衰期分别为13.3、6.8和5.5h;而谷氨酰-苯丙氨酸(Glu-Phe)的平均半衰期则分别为29.7、7.5和4.4h.土壤的氨基酸、多肽的吸收动力学试验表明,土壤对氨基酸、多肽的吸收速率随着外源添加氨基酸和多肽浓度及温度的增加而提高.土壤对氨基酸的最大吸收速率(Vmax)和亲和力(Km)及对多肽的吸收速率(Vh)均随温度的升高而增大.在0～2.5mmol.L-1浓度范围内,土壤对氨基酸的吸收动力学曲线遵循经典的米氏动力学曲线,而多肽则表现为线性模式.3种园艺生产系统土壤的氨基酸和多肽的周转速率、吸收动力学参数(Vmax、Km和Vh)均表现为OS>TS>CS.总之,温度显着影响了氨基酸、多肽在土壤中的矿化及其吸收动力学特性.(本文来源于《应用生态学报》期刊2010年03期）
王丽,华攀玉,高瑞娟,杨琼,宋金娜[9]（2005）在《不同的引导肽对丝状噬菌体基因8蛋白展示外源多肽的影响》一文中研究指出为了研究不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的影响,利用基因工程方法将一短肽插入基因8蛋白的N端,并将引导多肽去除或用基因3蛋白的引导肽序列替代基因8的引导肽序列.采用放射性脉冲追踪技术检测不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的作用.结果表明,无引导肽序列的引导,蛋白前体无法向成熟蛋白转化.基因3蛋白的引导肽可以引导展示有外源多肽的基因8蛋白,完成从前体向成熟蛋白的转化,但转化率明显下降.研究结果对阐明噬菌体外壳蛋白在大肠杆菌中的跨膜机制具有重要的意义.(本文来源于《高等学校化学学报》期刊2005年06期）
李巧丽[10]（2004）在《烟草花叶病毒载体及其在植物中表达外源多肽的研究》一文中研究指出烟草花叶病毒( tobacco mosaic virus, TMV )属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),是单组分带有帽子结构的正义单链RNA病毒,基因组全长6395bp。病毒基因组RNA被病毒外壳蛋白(coat protein, CP)包装成一类长300nm,直径15nm的杆状病毒粒子。在TMV植物表达载体的研究中,通常将较短的外源多肽序列插入TMV CP中Ser154的下游。在外源肽于CP羧端融合表达又不影响融合CP包装的前提下,基因组RNA能够在宿主植株内被融合CP包装成杆状的病毒粒子并高效地复制,大量表达含有外源肽的融合CP。本文主要对插入CP的外源肽的长度、序列特征及其它因素与病毒融合CP的表达、病毒粒子的感染性、形态和稳定性之间的关系进行研究,并以此提高利用TMV载体表达各种外源多肽的能力。在对重组病毒载体融合表达外源肽的研究中,我们观察到含有半胱氨酸(cysteine)的外源肽F18和F26等致使重组病毒发生了一系列变化。在携带外源肽F18和F26的重组病毒TMVF18TAA和TMVF26TGA感染的烟草植株中除分别检测到与病毒相应的融合CP蛋白亚基外,还都检测到能与CP抗体专一反应的大分子蛋白—hCP(high molecular weight CP-specific protein),并且在新生叶中产生了一类具有不规则形态的重组病毒粒子。一系列半胱氨酸替换证明外源肽中的半胱氨酸致使重组病毒发生了上述变化。因此我们在融合于TMV CP中外源肽的序列特征、大分子蛋白hCP的产生和重组病毒粒子形态叁者之间建立了相关性。而且,外源肽中的半胱氨酸同时影响重组病毒的侵染性和外源肽在重组病毒中的表达效率,其中外源肽中不含有半胱氨酸的重组病毒(TMVF18CYTAA和TMVF18CGTAA)的融合CP亚基的表达量最高。在TMV病毒载体的研究工作中,表达了来源于不同动物病毒的多种抗原决定多肽,如口蹄疫病毒(FMDV)和SARS冠状病毒等。由于受TMV基因组长度及其保守结构的限制,外源序列的表达受诸多因素的制约。这些因素包括如融合CP的等电点(本文来源于《中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）》期刊2004-07-01）
外源多肽论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大肠杆菌表达系统是目前基因工程领域中应用最广泛、最成功的表达系统,具有遗传背景清晰明确、培养条件简单经济、生长迅速、质粒宿主种类多样性等特点。但在实际应用中,存在外源蛋白的表达效率不稳定,部分外源蛋白表达以不可溶性包涵体形式存在等问题。因此,寻找既能实现外源蛋白的高产量表达,又能尽可能使其以可溶形式表达的调控策略的探索具有广泛的应用前景。Tat(Trans-activator transduction)是人类免疫缺陷病毒-1(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)编码的富含碱性氨基酸的多肽,已知能介导多种外源物质通过各种膜性结构并保持生物活性。我们前期研究Tat碱性多肽穿膜效应时,首次发现Tat碱性多肽同样具有促进外源蛋白高产量及可溶性表达的新功能,并在国际上首次报道了该现象,但其潜在的作用机理尚不清楚。基于此,本文从以下几个方面开展相关研究:一、Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达的普适性。方法:我们以线虫(C.clegans)、酵母(yeast)不同分子量(超小分子量、小分子量、中分子量、大分子量)靶蛋白作为研究对象,包括线虫超小分子量蛋白MTL-1(Metal-binding proteins-1,MTL-1)、MTL-2,线虫小分子量蛋白SOD-1(Superoxide Dismutase-1,SOD-1)、SOD-2,线虫中分子量蛋白GPD-3(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD-3)、酵母中分子量蛋白GAP-3,线虫大分子量蛋白DAF-16(Decay accerlerating factor-16,Daf-16)、HSP-70(Heat shock protein-70,HSP-70)。通过逆转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)方法获得编码基因并成功构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体,诱导剂异丙基β-d-硫代半乳糖甘(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后采用SDS-PAGE技术检测诱导不同时间点(0 hrs、2 hrs、4 hrs、6 hrs)蛋白表达水平。结果:成功获得超小分子量、小分子量、中分子量、大分子量外源蛋白的含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,Tat碱性多肽可促进小分子量蛋白(MTL-1、MTL-2、SOD-1、SOD-2)高产量、可溶性表达,促进中分子量蛋白可溶性表达,但对大分子量蛋白表达的促进作用不明显。同时,适用于不同物种(线虫、酵母)中低分子量外源蛋白的高产量、可溶性表达。结论:Tat碱性多肽可促进不同物种中低分子量外源蛋白高产量、可溶性表达,但对大分子量外源蛋白的表达促进作用不明显。二、Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在作用机理研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在作用机理。方法:我们以大肠杆菌超氧化物歧化酶SOD家族成员SOD-A、SOD-B、SOD-C作为研究对象,通过RT-PCR方法获得编码基因并构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体,蛋白IPTG诱导后采用SDS-PAGE技术和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测诱导不同时间点(0 hrs、2 hrs、4 hrs、6 hrs)蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白诱导不同时间点菌体的SOD总酶活变化,采用微生物全自动生长曲线仪检测诱导表达的Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白的抗百草枯(Parqual,PQ)活性,同时采用实时定量PCR技术(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR技术)检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白菌体的信使RNA(Messenger RNA,m RNA)转录水平。进一步地,采用亲和层析技术分离纯化含Tat标签蛋白和不含Tat标签蛋白,利用圆二色谱(Circular dichroism,CD)分析仪检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白的二级结构变化。结果:成功获得大肠杆菌SOD-A、SOD-B、SOD-C含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,Tat碱性多肽可以促进SOD-A、SOD-B、SDOC高产量、可溶性表达;ELISA和微生物生长曲线检测结果表明,含Tat标签蛋白的诱导表达蛋白菌体的总酶活显着高于非Tat标签蛋白;且Tat标签蛋白诱导表达菌体的抗PQ活性显着高于非Tat标签蛋白,特别是Tat-SOD-A和SOD-A组之间存在显着性差异;q RT-PCR结果表明,含Tat标签蛋白的m RNA转录水平显着高于不含Tat标签蛋白;圆二色谱法测定结果表明,Tat标签蛋白的α-螺旋比例和β转角显著增加,β-转角折迭比例显着减少。结论:Tat碱性多肽通过增加m RNA转录水平促进大肠杆菌SOD系列蛋白外源蛋白高产量、可溶性表达,含Tat标签蛋白的菌体具有明显的生物酶活及抗PQ活性,其中SOD-A基因在抗PQ活性发挥重要作用;且Tat标签蛋白的二级结构发生显着改变。叁、Tat碱性多肽促进外源蛋白4℃高产量表达的研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进外源蛋白4℃高产量表达的作用机理。方法:我们以大肠杆菌增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)作为研究对象,通过RT-PCR方法获得编码基因并构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体。4℃低温条件下IPTG诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测IPTG诱导144 hrs后,含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白表达水平。随后,采用SDS-PAGE、Western blot和荧光显微镜检测IPTG诱导不同时间点(0 hrs、24 hrs、48 hrs、72 hrs、96 hrs、120 hrs、144 hrs),Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白表达水平。最后,采用荧光显微镜观察4℃不含IPTG诱导后,Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白单克隆泄露表达水平变化。结果:成功获得大肠杆菌EGFP、NGB含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,Tat碱性多肽可以促进4℃诱导表达144 hrs后蛋白高产量、可溶性表达;随着诱导表达时间增加,含Tat标签蛋白的蛋白表达产量逐渐升高。在不加IPTG诱导剂的情况下,含Tat标签蛋白的泄露表达产量显着高于非Tat标签蛋白。结论:Tat碱性多肽可促进外源蛋白4℃高产量表达,且表达产量随着诱导时间的增加而显着提高。在不加IPTG表达下,Tat碱性多肽促进外源蛋白泄露表达,且表达产量随着诱导时间的增加而显着提高。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
外源多肽论文参考文献
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