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新型结核分枝杆菌疫苗的技术研究

2020-12-10阅读(502)

新型结核分枝杆菌疫苗的技术研究

论文摘要

结核病（tuberculosis,TB）曾是一种致死率100%的疾病,自1940年起,随着抗结核药物的发现以及公共卫生系统的不断完善,TB死亡率有所下降,但随着耐药菌的出现,TB又呈现出死灰复燃的态势,成为公众健康的一大威胁。据WHO2017年统计,TB死亡率在感染性疾病中位居榜首,每年全球的死亡数都近150万。TB是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）引起的疾病,主要通过呼吸道传播。Mtb主要感染肺,导致肺结核（pulmonary tuberculosis,PTB）,也可侵袭其他组织引起肺外结核（extrapulmonary TB）。据统计约17亿人（5-10%）在感染Mtb后会发展为TB,但在HIV患者中,其患病率会大大提高。TB的风险因素包括营养不良,糖尿病,吸烟,酗酒。2018年WHO结核报告显示,90%新发病例为成年人,男女比例为2:1。TB主要流行于中低端收入的发展中国家,占全球新发病例97%,每年用于TB预防、诊断、治疗的费用高达69亿。接种疫苗是预防TB及其严重并发症最经济有效的途径,从源头遏制TB感染,减轻后续经济负担,这对公共卫生事业的发展和完善具有极大的意义。卡介苗（Bacille Calmette Guerin,BCG）作为唯一通用的TB疫苗沿用至今,全球接种覆盖率达80%。其可对婴幼儿肺外结核提供免疫保护,但对于任何年龄段的肺外结核和成年人的肺结核都没有很好的保护作用。WHO制定的2030年目标:与2015年相比将TB的死亡率降低90%,发病率降低80%。若要完成这一目标,仅靠目前的BCG疫苗和防治手段完全行不通。虽然科研人员突破疫苗研制的重重困难,已有少量候选疫苗进入临床试验阶段,然而目前尚未有能替代BCG的候选疫苗出现,且随着全球TB防控形势的日益严峻,亟需打破常规,大胆引入新技术、新思路,开发新型的TB疫苗已刻不容缓。近年来,越来越多的研究发现,体外转录mRNA（in vitro transcribed mRNA,IVT mRNA）可作为替代传统疫苗的新型疫苗,且已在肿瘤治疗和蛋白质替代疗法的实践中发挥重要作用。IVT mRNA即在体外无细胞系统中合成编码目的蛋白的mRNA,进入机体后被机体细胞捕获表达抗原并呈递于细胞表面,激活MHC I类分子限制的CD8+T细胞反应,达到免疫预防作用。同时伴随着能在Mtb中发挥作用的重组酶Chec9 gp60和gp61的发现,利用传统同源重组方法构建重组BCG（recombinant BCG,rBCG）效率得到了极大的提高,迎来了新的春天。目前的DNA疫苗、亚单位疫苗和活菌苗都不能为TB感染提供百分百的保护,基于以上研究现状,本研究从新思路和老传统两个方向探索TB疫苗研制的新技术,填补目前TB疫苗研究的空缺,为后续TB疫苗的研制添砖加瓦。一、体外合成结核分枝杆菌Ag85B-mRNA及其免疫原性研究目的:本研究以Mtb Ag85B关键性保护抗原为靶标,Ag85B是Mtb早期分泌蛋白,其在机体内能有效诱导免疫反应,因此选择Ag85B为靶标具有重要的意义。在体外合成稳定的Ag85B mRNA,并在细胞中验证其半衰期和蛋白表达量,通过滴鼻和肌肉注射免疫BABL/c小鼠,评价其免疫原性,对TB mRNA疫苗的可行性和实践性进行初步探讨。方法:结合密码子偏好性、GC含量和mRNA二级结构自由能,优化Ag85B编码区序列,并在其两端插入β球蛋白3’和5’UTR序列。利用生物信息学方法,分析优化前后序列的参数,确认其稳定性。选择参数最优序列合成作为模板,单酶切为线性DNA后,利用T7聚合酶在体外进行转录。琼脂糖凝胶电泳鉴定转录后mRNA的大小和质量,检测是否有降解。体外利用lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,分别于不同时间点收集细胞RNA样和蛋白样,RT-qPCR检测mRNA在细胞内的半衰期,即其在胞内存留多长时间会被RNA酶降解;Western Blot检测mRNA在细胞内表达目的蛋白的量,即其翻译效率。制备的Ag85B mRNA联合鱼精蛋白分别通过滴鼻和肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测其特异性细胞免疫应答。结果:Ag85B优化序列二级结构分析显示,优化后序列具有更高的稳定性。琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒大小,片段在5700bp左右,大小正确,鉴定体外合成的Ag85B-mRNA,位于1200bp左右,大小正确。RT-qPCR显示转染后3h细胞内已有目的mRNA,6h-12h达高峰,可高达20倍左右,24h则已降解至3h水平,表明目的mRNA在细胞内降解周期大概24h左右。Western Blot检测Ag85B-mRNA转染HEK 293T细胞24、48小时蛋白表达,均有清晰特异性的目的蛋白条带。小鼠免疫后ELISA结果显示,Ag85B-mRNA可诱导机体针对Mtb Ag85B分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答（P<0.05）,并且与滴鼻免疫组相比,肌肉免疫组效果更稳定。结论:成功体外合成稳定的Ag85B-mRNA疫苗,动物实验证明其能有效的诱导细胞免疫应答,表明其具有较好的免疫原性,为探索mRNA疫苗技术研究奠定基础。二、利用同源重组系统构建新型重组卡介苗的技术研究目的:抑制吞噬-溶酶体成熟,是结核分枝杆菌能将机体内的巨噬细胞作为“根据地”,逃脱免疫监视和免疫反应的重要原因。Harth团队研究表明,脲素酶（Urease）是多种致病病原的毒力因子。在Mtb中脲素酶产生的氮被认为是碱化Mtb生存微环境的重要来源,不仅可以预防吞噬体的酸化,还可阻止吞噬体和溶酶体的融合。因此本部分研究旨在筛选出ureC BCG缺失株,建立快速高效的同源重组技术平台,以便后续可以在此缺失株基础上添加Mtb的各种抗原（代谢活跃期或休眠期）,为重组BCG疫苗奠定基础。方法:首先将表达gp60和gp61重组酶的质粒pSL002电转进BCG中,将左右侧同源臂构建到含有loxP片段的pSL001上,即,左侧同源臂-loxP-hyg-GFP-loxP-右侧同源臂。将该DNA片段电转入已含有质粒pSL002的BCG内,即可获得双交换的ureC缺失株,后续将表达Cre重组酶的质粒pSL003电转入成功进行双交换的突变株,剪切抗性基因和GFP。由于质粒pSL002和pSL003都含有SacB反向筛选基因,因此最后用2%蔗糖平板去除质粒pSL002和pSL003。结果:目前已成功构建出左右侧同源臂,获得ureC左侧同源臂-loxP-hyg-GFP-loxP-ureC-右侧同源臂片段,测序结果显示,完全正确。质粒pSL002的电转在进行中。结论:由于BCG生长周期较长（21天）,待筛选出ureC缺失株,抑制Mtb阻止吞噬溶酶体成熟的能力,使得巨噬细胞能够充分的消化分解其抗原成短肽,提呈于细胞表面供免疫细胞识别。并且也为后续可以在ureC缺失株上添加Mtb的各种抗原（代谢活跃期或休眠期）,以期可以预防发病的TB,对潜伏期TB也有预防作用,为构建新型重组BCG疫苗奠定基础。

论文目录

  • 缩略语表
  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一章 体外合成结核分枝杆菌Ag85B-mRNA疫苗候选体及其免疫原性研究
  •   引言
  •   1.1 实验材料与仪器
  •     1.1.1 实验动物
  •     1.1.2 细胞系
  •     1.1.3 菌株
  •     1.1.4 主要实验相关试剂
  •     1.1.5 主要仪器和设备
  •     1.1.6 合成目的基因
  •     1.1.7 主要试剂的配方
  •   1.2 实验设计技术路线
  •   1.3 实验方法
  •     1.3.1 Ag85B的合成
  •     1.3.2 DH5α感受态的制备
  •     1.3.3 质粒转化
  •     1.3.4 pUC57-Ag85B质粒提取
  •     1.3.5 pUC57-Ag85B质粒双酶切
  •     1.3.6 双酶切产物胶回收
  •     1.3.7 胶回收产物连接和转化
  •     1.3.8 菌液PCR鉴定
  •     1.3.9 质粒单酶切线性化及其回收
  •     1.3.10 体外转录及回收（Promega）
  •     1.3.11 体外转录及萃取回收（cellsrcipt）
  •     1.3.12 体外转录mRNA转染293T细胞
  •     1.3.13 q-PCR检测
  •     1.3.14 Western Blot检测
  •     1.3.15 小鼠免疫后脾细胞细胞因子检测
  •     1.3.16 检测小鼠免疫后血清的效价
  •   1.4 实验结果
  •     1.4.1 序列的优化
  •     1.4.2 质粒Ag85B的构建
  •     1.4.3 模板线性化和回收
  •     1.4.4 体外转录
  •     1.4.5 质粒GFP构建及验证Kozak序列
  •     1.4.6 细胞转染后mRNA的表达
  •     1.4.7 mRNA免疫后血清抗体效价及特异性细胞因子检测
  •   讨论
  • 第二章 利用同源重组系统构建重组卡介苗的技术研究
  •   引言
  •   2.1 实验材料与仪器
  •     2.1.1 BCG菌株
  •     2.1.2 菌株和相关质粒
  •     2.1.3 主要实验相关试剂
  •     2.1.4 主要仪器和设备
  •     2.1.5 主要试剂的配方
  •   2.2 实验设计技术路线
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 DH-5α感受态的制备
  •     2.3.2 质粒转化
  •     2.3.3 pSl001、pSL002、pSL003 质粒提取
  •     2.3.4 Ure C片段PCR及回收
  •     2.3.5 pSL001 质粒双酶切
  •     2.3.6 双酶切产物胶回收
  •     2.3.7 胶回收产物连接和转化
  •     2.3.8 菌液PCR鉴定
  •     2.3.9 菌液的冻存和复苏
  •     2.3.10 BCG的冻存和活化
  •     2.3.11 BCG的电转
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 构建Ure C片段
  •     2.4.2 构建左侧同源臂
  •     2.4.3 构建右侧同源臂
  •     2.4.4 pSL002 质粒电转
  •   讨论
  • 第三章 结论与展望
  • 参考文献
  • 作者在学期间取得的学术成果
  • 主要简历
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 夏敏

    导师: 王希良

    关键词: 结核分枝杆菌,疫苗,脲素酶,新型疫苗

    来源: 军事科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 军事科学院

    分类号: R392

    总页数: 76

    文件大小: 3616K

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