一、外源核苷酸对肠上皮细胞增殖和迁移的作用（论文文献综述）
白永飞[1]（2021）在《干酪乳杆菌刺激肠细胞产生抗菌肽的筛选及其对肠上皮细胞增殖作用研究》文中研究说明抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）是具有抗菌,抗病毒活性的小分子肽,一般包含20-50个氨基酸残基,带正电荷且为双亲性分子结构。AMP的多样性和抵抗病原微生物功能使其成为抗微生物药物和防腐剂研究的热点。某些乳酸杆菌会刺激肠道细胞分泌抗菌肽,清除肠道病原体,保护机体肠道屏障。筛选干酪乳杆菌刺激肠道上皮细胞分泌的抗菌肽,用于动物饲料添加剂,有效抵抗某些肠道病原微生物,保护动物肠道上皮细胞的完整性,对促进绿色健康的养殖业具有理论意义和应用价值。因此,本研究通过高通量测序技术对饲喂乳酸菌的小鼠肠道组织进行分析,筛选表达量高的抗菌肽;并探究体外表达抗菌肽抗菌活性、抗病毒活性、促细胞增殖迁移能力,为研发广谱型肠道抗菌修复制剂提供理论基础。本研究采用高通量转录组测序技术,对饲喂干酪乳酸菌的小鼠肠道组织进行数据分析,筛选了表达量高的抗菌肽基因,并使用q RT-PCR进行了验证;利用大肠杆菌原核表达系统对筛选出的抗菌肽进行了原核表达,并采用蛋白免疫印迹技术（Western Blot）验证了表达正确的抗菌肽;利用蛋白纯化系统对表达蛋白进行了纯化,随后纯化蛋白与肠毒素性大肠杆菌（ETEC）参考毒株ETEC-K88、ETEC-K99和ETEC-987p共孵育,验证抗菌肽抑制细菌增殖能力;应用CCK-8、细胞划痕实验了解抗菌肽促进肠上皮细胞增殖与迁移作用;Western Blot技术研究了抗菌肽刺激肠上皮细胞后紧密连接相关蛋白的表达情况,同时检测抗菌肽刺激肠上皮细胞后能否激活m TOR和Wnt/β-Catenin细胞信号通路。经转录组分析筛选出5个抗菌肽基因,分别是Defa39、Defa35、Defa38、Reg3a、Reg1。经表达载体构建、原核表达后发现Defa39、Defa35、Defa38无法进行表达;经Western Blot实验验证显示重组抗菌肽蛋白Reg3a与Reg1条带大小与预期结果一致;原核表达获得的重组抗菌肽蛋白具有在体外显着抑制ETEC-K88、ETEC-K99和ETEC-987p增殖能力;体外表达的重组抗菌肽激活了m TOR信号通路和Wnt/β-catenin上游信号通路;CCK-8细胞增殖实验揭示了抗菌肽Reg3a与Reg1促进了IPEC-J2与IEC-6细胞的增殖;两种肠道上皮细胞划痕实验与Western Blot实验表明抗菌肽Reg3a与Reg1促进了肠上皮细胞迁移,并且增强了紧密连接相关蛋白的表达。综上所述,体外表达重组抗菌肽蛋白Reg3a和Reg1对肠道致病菌有良好的抑制增殖作用;可能通过m TOR信号通路和Wnt/β-catenin信号通路促进肠道上皮细胞的增殖与迁移,并促进细胞间紧密连接的形成。
郑丹阳[2]（2021）在《间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障及肺血管屏障功能的保护作用及机制》文中研究指明脓毒症是临床最常见的急危重症之一,流行病学结果显示2020年全球感染脓毒症患者人数高达4890万人,死亡率高达25-30%,是人类健康的巨大威胁。肠道机械屏障由单层上皮细胞组成,是机体吸收营养和抵御外界刺激的重要屏障,脓毒症后肠屏障功能严重受损,可导致肠道内菌群和毒素移位入血,引发严重组织损伤,目前治疗手段有限。肺脏无时无刻都在发生血气交换,在脓毒症早期即会发生损伤,血管渗漏是肺损伤的典型病理生理过程,可导致组织水肿和器官功能障碍,目前缺乏有效的治疗手段。微囊泡（microvesicles,MV）是一种细胞分泌的天然膜性囊泡,携带大量蛋白质、脂质、核酸等生物活性分子,可参与多种病理生理过程的调控。间充质干细胞微囊泡（mesenchymal stem cell-derived microvesicles,MMV）可携带大量干细胞来源的治疗性物质,如角质细胞生长因子、m RNA、mi R-292、mi R295等,在急性肾损伤、肾小球肾炎、白血病等多种疾病治疗方面发挥重要作用。MMV能否改善脓毒症后肠屏障及肺血管屏障功能,目前尚不清楚。脓毒症后,在多种损伤因素刺激下,肺血管内皮细胞也会分泌大量MV（endothelial microvesicles,EMV）,前期研究发现EMV可携带mi R-23b引起肺血管渗漏,其具体调节机制不详。MV的产生受到多种因素调节,抑制EMV产生是否能减轻其损伤作用,目前尚不清楚。为此,本研究利用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）复制大鼠脓毒症模型和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激复制肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC-6）损伤模型,研究了MMV对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制,重点探讨了MMV递送mfn2、PGC-1α及功能性线粒体改善肠上皮细胞线粒体功能及屏障功能的机制。同时,我们研究了MMV对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制,重点探讨了MMV递送PKA及Wnt5a改善紧密连接及粘附连接的机制。最后,我们研究了阿米替林对脓毒症后EMV产生的抑制作用及对肺血管屏障功能的保护作用。研究内容:第一部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制1.间充质干细胞微囊泡对肠屏障功能的保护作用（1）脓毒症后肠屏障功能变化利用大鼠脓毒症模型及IEC-6细胞损伤模型,研究大鼠脓毒症后不同时相点肠道屏障功能变化,及IEC-6增殖及屏障功能变化,明确脓毒症后肠屏障的损伤特征。（2）MMV对脓毒症后肠屏障功能的保护作用MMV输注至脓毒症大鼠或与损伤IEC-6共孵育,研究MMV对大鼠肠屏障功能及对IEC-6屏障功能的作用,明确MMV对脓毒症后肠屏障功能的保护作用。2.间充质干细胞微囊泡通过改善线粒体功能恢复肠上皮细胞功能（1）MMV对IEC-6线粒体的保护作用MMV与损伤IEC-6共孵育,研究MMV对IEC-6内线粒体形态及数量、线粒体氧化磷酸化等功能的影响,明确MMV对线粒体的保护作用。（2）抑制氧化磷酸化对MMV保护作用的影响利用氧化磷酸化抑制剂2,4-二硝基苯酚与MMV共同处理IEC-6,研究抑制氧化磷酸化对MMV保护作用的影响,明确线粒体氧化磷酸化在MMV保护肠上皮功能中的作用。3.间充质干细胞微囊泡改善线粒体动力平衡的机制（1）MMV递送mfn2促进IEC-6内线粒体融合利用mfn2过表达及干扰病毒处理MSC,收集mfn2过表达及低表达的修饰MMV,并与损伤IEC-6孵育,研究MMV内mfn2对IEC-6线粒体融合功能的影响。（2）MMV递送PGC-1α促进IEC-6内线粒体生成利用PGC-1α过表达及干扰病毒处理MSC,收集PGC-1α过表达及低表达的修饰MMV,并与损伤IEC-6孵育,研究MMV内PGC-1α对IEC-6线粒体生成功能的影响。（3）MMV递送功能性线粒体改善IEC-6内线粒体功能利用透射电镜及流式,观察MMV内线粒体含量及功能;利用线粒体红色荧光质粒,观察MMV内线粒体与IEC-6内线粒体融合过程,明确MMV递送线粒体对IEC-6内线粒体功能的影响。第二部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制1.MMV对肺血管屏障功能的保护作用MMV输注至脓毒症大鼠及与损伤血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VEC）共孵育,研究MMV对大鼠肺血管渗漏、肺损伤的保护作用。2.MMV蛋白组学分析利用蛋白质谱对MMV进行蛋白组学分析,使用KEGG及GO分析MMV内调节血管渗漏相关蛋白。3.MMV保护肺血管屏障功能的机制（1）MMV递送PKA保护肺血管屏障功能利用PKA激活剂、抑制剂及PKA-si RNA,研究MMV内PKA对VEC内VASP、ZO-1的作用,阐明MMV递送的PKA对肺血管屏障功能的保护作用及机制。（2）MMV递送Wnt5a保护肺血管屏障功能利用Wnt5a激活剂、抑制剂及Wnt5a-si RNA,研究MMV内Wnt5a对VEC内cdc42、VE-cadherin的作用,阐明MMV递送的Wnt5a对肺血管屏障功能的保护作用及机制。第三部分血管内皮细胞微囊泡在脓毒症肺血管屏障功能中的作用1.EMV递送mi R-23b在肺血管渗漏中的作用利用mi R-23b过表达及干扰质粒,研究EMV对肺血管渗漏的作用,阐明EMV对肺血管屏障功能的作用及机制。2.抑制EMV对肺血管屏障功能的保护作用利用阿米替林处理VEC,检测EMV生成变化;收集相应EMV刺激大鼠及与VEC,观察经阿米替林处理的EMV对肺血管屏障功能的影响。研究结果:第一部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制1.间充质干细胞微囊泡对肠屏障功能的保护作用大鼠脓毒症后肠屏障功能严重受损,MMV输注可显着改善大鼠肠屏障功能,恢复肠上皮细胞增殖、屏障功能。2.间充质干细胞微囊泡通过改善线粒体功能恢复肠上皮细胞增殖及屏障功能MMV可改善IEC-6内线粒体动力平衡,从而改善线粒体膜电位及氧化磷酸化。抑制线粒体氧化磷酸化会抑制MMV对IEC-6的保护作用,提示线粒体动力平衡及氧化磷酸化在MMV保护IEC-6功能中发挥重要作用。进一步发现MMV可通过促进GOT1表达,恢复线粒体代谢中间产物天冬氨酸含量,提示天冬氨酸可能在MMV保护IEC-6功能中发挥重要作用。3.间充质干细胞微囊泡改善线粒体动力平衡的机制（1）MMV可携带线粒体融合蛋白mfn2并递送至IEC-6,通过促进线粒体融合改善线粒体动力平衡,恢复线粒体氧化磷酸化,从而改善IEC-6屏障及增殖功能。（2）MMV可携带线粒体生成蛋白PGC-1α并递送至IEC-6,通过促进线粒体生成改善线粒体动力平衡,恢复线粒体氧化磷酸化,从而改善IEC-6屏障及增殖功能。（3）MMV内可携带具有呼吸功能的线粒体并递送至IEC-6,与IEC-6内线粒体融合,直接改善IEC-6内线粒体功能。MMV内PGC-1α可增加MMV内线粒体含量,促进IEC-6内线粒体功能恢复。第二部分间充质干细胞微囊泡对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制1.MMV对肺血管屏障功能的保护作用MMV可改善大鼠肺血管渗漏及肺湿干重,减轻肺损伤,恢复VEC屏障功能;MMV还可改善大鼠动脉血气指标,提升大鼠存活率,延长存活时间。2.MMV蛋白组学分析使用KEGG及GO分析MMV内蛋白质谱结果,34种血管渗漏相关蛋白高表达,其中PKA与Wnt5a与血管渗漏调节密切相关,进一步发现MMV内可携带PKA及Wnt5a,可能对肺血管屏障功能的保护密切相关。3.MMV保护肺血管屏障功能的机制（1）MMV可递送PKA至VEC,通过促进VASP磷酸化从而招募ZO-1至细胞膜,恢复紧密连接功能,从而改善肺血管屏障功能。（2）MMV可递送Wnt5a至VEC,通过促进cdc42表达从而恢复VE-cadherin在细胞膜上的表达,恢复粘附连接功能,从而改善肺血管屏障功能。第三部分EMV在脓毒症肺血管屏障功能中的作用1.EMV递送mi R-23b在肺血管渗漏中的作用EMV可递送mi R-23b至VEC,通过与ZO-1 m RNA 3’UTR端结合从而抑制ZO-1表达,破坏紧密连接结构,导致肺血管屏障功能损伤。2.抑制EMV对肺血管屏障功能的保护作用阿米替林可显着抑制EMV产生,从而减轻EMV导致的肺血管渗漏及肺损伤,实现对肺血管屏障功能的保护。结论:1.脓毒症后肠屏障功能严重受损,MMV可递送mfn2、PGC-1α及功能性的线粒体至肠上皮细胞,通过恢复线粒体动力平衡,改善线粒体氧化磷酸化及代谢,从而恢复肠上皮细胞屏障及增殖功能,实现对肠屏障功能的保护。2.MMV可递送PKA及Wnt5a至血管内皮细胞,一方面通过PKA促进VASP磷酸化,促进ZO-1的募集从而改善紧密连接,另一方面通过Wnt5a促进cdc42生成,恢复VE-cadherin表达从而改善粘附连接,共同保护肺血管屏障功能。3.EMV可递送mi R-23b至血管内皮细胞,通过抑制ZO-1表达从而引起肺血管渗漏及肺损伤。阿米替林可减少EMV释放及其诱导的肺损伤,从而实现对肺血管屏障功能的保护。
安悦[3]（2021）在《Circ-LECRC内源性竞争结合miR-135b-5p上调靶基因KLF4抑制结直肠癌的增殖、转移及其机制研究》文中研究表明目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高。结直肠癌起病较为隐匿,患者早期一般无明显特异性症状,随着病情发展,出现表现为大便习惯改变等非特异性症状,往往容易忽视,导致很多患者就诊时已是中晚期,失去手术根治的机会。若对早期CRC进行临床干预,患者得5年生存率有望达到90%,而一旦肿瘤发生转移,则患者5年生存率仅为14%。结直肠癌发病经过局部粘膜浸润、区域扩散及远端转移等一系列进程,这个多步骤的过程往往也涉及多种基因及信号通路的参与。因此深入研究结直肠癌的发生发展机制,寻找早期诊断的重要分子标志物从而改善结直肠癌患者的预后显得尤为重要。环状RNA（circularRNA,circRNA）是一种不同于线性RNA的非编码RNA,通过外显子或内含子环化在3’和5’末端连接,通过共价键形成完整的环结构,不易被核酸外切酶降解,因此较线性RNA结构更加稳定。CircRNA具有广泛的生物学功能,其与miRNA具有极为丰富的结合位点,因此可以像分子海绵一样通过吸收miRNA起作用。CircRNA还可以通过碱基配对作用于其他RNA,也可以通过与蛋白相互作用来抑制蛋白的活性。另外,尽管circRNA是非编码RNA,但在某些条件下,它可以充当蛋白质合成的翻译模板并产生功能性蛋白。Circ-LECRC是来源于YAP1（Yes1 associated transcriptional regulator）基因转录而来,其另外的转录本circYAP1在胃癌、乳腺癌中已有研究报道,能够抑制肿瘤细胞的增殖及转移,发挥抑癌的作用。MiR-135b-5p是一种microRNA,TCGA数据库及GEO多个芯片数据提示其在肠癌中呈显着高表达趋势。文献报道miR-135b-5p可以通过与KLF4等靶基因的结合,促进结直肠癌的增殖、侵袭、转移等病理过程。KLF4作为真核生物的转录因子,参与调控细胞增殖、分化等重要生理过程。KLF4曾被命名为胃肠富集Krüppel样因子,在结直肠癌中被认为是抑癌基因,其表达在癌组织中明显下调,研究表明KLF4的缺失是结直肠癌患者预后的独立预测因素。通过生物信息学网站预测,miR-135b-5p与circ-LECRC及KLF4的3’UTR均存在结合位点,基于以上理论,我们推测circ-LECRC可能通过内源性竞争结合miR-135b-5p,从而提高KLF4的抑癌作用。本课题拟研究circ-LECRC、miR-135b-5p及KLF4在CRC组织及细胞系中的表达情况,分析其与病理资料及预后的关系,并在体外水平研究circ-LECRC对CRC细胞的恶性生物学影响,进而研究circ-LECRC、miR-135b-5p及KLF4之间作用机制。本课题重点研究circ-LECRC的表达水平与CRC的病理改变及预后的关系,并在CRC细胞系中探索其对肿瘤细胞生物学行为的影响,进而深入地揭示CRC发生发展的分子机制,以期实现CRC的早期诊断和治疗,并改善CRC患者的治疗效果和预后。研究方法:1、环状水平验证及稳定性检测:利用Sanger测序确定circ-LECRC为环状RNA,利用RNase R处理总RNA,qPCR检测表达量,比较处理前后的YAP1线性与环状的稳定性差异。2、Circ-LECRC的在结直肠癌组织及细胞系中的表达差异收集来自中国医科大学附属第一医院结直肠癌手术患者的癌组织和癌旁非癌组织标本,同时培养人源的结直肠癌细胞系:RKO、SW480、HCT116、HT29、SW620、DLD1细胞和正常肠粘膜上皮FHC细胞。通过原位杂交观察circ-LECRC在结直肠癌患者石蜡切片中的表达量,分析其表达量与患者病理资料及预后之间的关系。通过qPCR检测circ-LECRC在新鲜结直肠癌组织中的表达差异,分析其表达量与各病理资料间的关系。通过qPCR检测多种肠癌系及正常肠上皮间的表达差异,筛选用于功能实验的细胞系。3、验证circ-LECRC对肠癌细胞表型的影响向HCT116和SW480细胞转染质粒及慢病毒,构建circ-LECRC稳定过表达和敲减细胞系,并通过转染的方法实现miR-135b-5p、KLF4的过表达和敲减。通过CCK-8实验检测HCT116和SW480细胞的增殖能力;通过Transwell实验检测HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力;通过流式细胞术检测HCT116和SW480细胞的凋亡和周期。在4-6周Balb/c裸鼠皮下注射过表达circ-LECRC及对照的SW480细胞,监测裸鼠皮下成瘤情况。向裸鼠尾静脉注射过表达circ-LECRC及对照的SW480细胞观察其肺转移情况,体内验证circ-LECRC对SW480细胞增殖及转移能力的影响。4、构建circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4调控网络通过荧光原位杂交（FISH）实验确定circ-LECRC在HCT116和SW480细胞中的定位。再利用生物信息学方法构建circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4调控网络。FISH实验验证circ-LECRC与miR-135b-5p共定位关系。并且利用双荧光素酶实验直接验证circ-LECRC/miR-135b-5p及miR-135b-5p/KLF4之间的结合关系。使用Ago2抗体进行SW480细胞的RNA免疫共沉淀（RIP）,验证circLECRC/miR-135b-5p/KLF4之间的结合关系。5、验证肠癌组织miR-135b-5p及KLF4表达及其与circ-LECRC相关性使用之前检测circ-LECRC表达的同一批新鲜组织提取的RNA,检测miR-135b-5p及KLF4表达,分析circ-LECRC与miR-135b-5p、miR-135b-5p与KLF4、circ-LECRC与KLF4之间表达的相关性,进一步明确其调控关系。6、进一步探讨circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4作用轴的调控关系通过RIP实验,使用Ago2抗体富集circ-LECRC及KLF4,检测过表达circLECRC及NC组的SW480细胞中circ-LECRC与KLF4的调控变化。分别过表达及敲减circ-LECRC的HCT116和SW480细胞中,Western Blot检测靶基因KLF4的表达变化。7、circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4作用轴对肠癌细胞生物学行为的影响CCK8、Transwell侵袭及迁移实验对circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4之间进行功能回复,验证circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4作用轴的竞争性结合关系。结果:1、通过测序及比对,发现并验证了YAP1在结直肠癌中新的circRNA转录本,并且证实环状RNA的稳定性。2、circ-LECRC在组织中的表达量与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小及肿瘤远端转移无关。表达水平肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期呈负相关。且circ-LECRC的表达与结直肠癌患者预后呈负相关。与正常上皮FHC相比,circ-LECRC在RKO、HCT116、HT29、SW480、SW620细胞中表达均较低。3、CCK8实验显示在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC可以抑制肠癌细胞的增殖能力,敲减circ-LECRC可以增强肠癌细胞的增殖能力;Transwell实验显示在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC可以抑制肠癌细胞的迁移及能力,相反敲减circ-LECRC可以增强肠癌细胞的迁移及侵袭能力;同样在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC可以促进肠癌细胞凋亡,而敲减circ-LECRC能够抑制肠癌细胞凋亡。裸鼠成瘤实验中,过表达circ-LECRC组瘤体增长速度与最终重量较对照组小;肺转移实验中,过表达circ-LECRC组裸鼠肺转移灶较小且少。4、FISH实验验证circ-LECRC与miR-135b-5p均主要在SW480细胞质中表达。且网站预测miR-135b-5p与circ-LECRC的9号位点结合,与KLF4的924号位点结合。双荧光素酶实验验证miR-135b-5p与circ-LECRC及KLF4均存在结合,RIP实验进一步证实Ago2抗体可下拉circ-LECRC和KLF4。5、miR-135b-5p在肠癌组织中呈显着高表达,KLF4在肠癌组织中高表达。且circ-LECRC与miR-135b-5p表达呈负相关,miR-135b-5p与KLF4表达呈负相关,circ-LECRC与KLF4表达呈正相关。6、Western Blot实验证实,在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC,KLF4蛋白表达水平提高,相反,敲减circ-LECRC则KLF4蛋白表达水平降低。RIP中使用Ago2抗体富集circ-LECRC及KLF4,过表达circ-LECRC的SW480细胞中富集到的circ-LECRC增多,KLF4减少。7、CCK8及Transwell迁移、侵袭实验结果显示,circ-LECRC是通过竞争性结合miR-135b-5p来调控KLF4的表达,进而对肠癌细胞的生物学特性产生影响。结论:在结直肠癌中首次发现YAP1基因来源的变异环状RNA转录本（circLECRC）。证实circ-LECRC在结直肠癌组织中低表达,且低表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及预后密切相关。circ-LECRC通过竞争性结合miR-135b-5p来调控KLF4的表达,抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移,促进细胞凋亡。
王晓杰[4]（2020）在《山奈酚对脱氧雪腐镰刀菌烯醇致肠道屏障损伤的预防作用及机制》文中指出脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,是一种由镰刀菌属产生的具有高毒性的B类单端孢霉烯族真菌毒素,广泛分布于禾谷类作物中。虽然可以采取多种措施降低其污染程度,但食源性DON的暴露仍不可避免,因此对其体内毒性作用的预防和干预对于公众健康尤为重要。毒理学研究表明DON可严重破环肠道屏障稳态,引发多种毒性症状,因此肠道屏障稳态可能是体内预防和干预DON毒性的重要靶标。虽然有很多研究发现了植物化学物质对肠道屏障稳态的增强作用,但针对DON所引起的损伤,选择合适的植物化学物质进行预防或干预的研究却鲜有报道。植物化学物质山奈酚（KAM）是一种广泛分布于水果和蔬菜中的天然多酚类化合物,除了抗癌、抗氧化以及抗炎症活性外,它也具有增强Caco-2细胞单层模型完整性的作用。因此,本研究将采用营养学方法,探究KAM预处理对DON所导致的肠道屏障功能障碍的预防作用及其机制。具体研究内容及结果如下:1.建立模拟人体肠道上皮屏障的Caco-2细胞单层模型。通过对其完整性、通透性和细胞极性的测定验证模型的成功构建。对橙皮素、槲皮素、山奈酚、白藜芦醇、小檗碱、儿茶素和柚皮素等7种植物化学物质进行筛选,发现KAM预处理具有最佳效果。综合DON及KAM对Caco-2细胞增殖抑制率和模型通透性的影响,选择5?M DON和100?M KAM作为试验浓度,初步探究二者对Caco-2模型细胞活性、氧化应激以及细胞连接等生物功能的影响,结果表明KAM预处理对于DON引起的细胞紧密连接损伤有明显的改善作用。2.探究DON及KAM对不同增殖分化阶段Caco-2细胞连接的影响。为模拟肠上皮细胞的快速增殖与分化,选择建模的第3、11和21天三个时间点进行研究。结果表明,DON及KAM对Caco-2细胞模型完整性和紧密连接蛋白表达的影响高度依赖于细胞所处的增殖分化阶段。在细胞快速增殖期（第3 d）,DON和KAM都能够显着减缓细胞电阻值的增加;而在中期（第11 d）,同样剂量的DON和KAM反而显示出了促进作用;细胞分化成熟后（第21 d）,DON显着降低了细胞单层的完整性,而KAM预处理发挥了明显的改善作用。不同增殖分化时期紧密连接蛋白表达的变化表明claudin 4与DON具有密切的相关性,而KAM可通过上调claudin 3发挥作用,因此claudin蛋白可能是DON和KAM作用的靶蛋白。3.鉴于DON对蛋白质合成的抑制作用,采用蛋白质组学的方法研究KAM对Caco-2细胞模型单层完整性的保护作用及其机制。GO分析表明KAM、DON以及KAM+DON组在细胞黏附分子结合（MF）、细胞连接（CC）和细胞连接装配（BP）中都有显着的富集（p<0.05）。对KEGG富集结果进行层次聚类分析显示,KAM预处理对紧密连接、黏附连接和细胞骨架相关蛋白有明显改善作用。进一步的通路分析和WB验证表明,KAM预处理分别通过PKA途径和MAPK/ERK途径影响了紧密连接和黏附连接蛋白的表达和装配从而改善了DON引起的Caco-2细胞模型屏障功能损伤。4.为更全面了解DON及KAM作用后肠道屏障功能与其它生理过程之间的关系,对处理后的Caco-2细胞模型进行代谢组学分析,并结合蛋白质组学做组学关联分析。结果表明,各处理组间差异代谢物的数量和种类有明显区别,其中KAM+DON组有数量最多的显着性差异代谢物,且磷脂类代谢物变化明显。KAM组除了对嘌呤代谢和脂肪酸生物合成影响较为明显外,对氨基酸代谢相关通路也有广泛作用。KAM+DON组与DON单独作用组的代谢通路较为相似,二者对氨基酸代谢都有较大影响,其中最为显着的氨酰-t RNA生物合成通路与蛋白质合成密切相关。代谢组学和蛋白组学的关联分析表明,KAM及DON主要通过对t RNA连接酶蛋白表达的作用影响氨酰-t RNA生物合成通路,通过对醛脱氢酶、酰基甘油激酶、果糖二磷酸醛缩酶、乙醇脱氢酶和酰基甘油脂肪酶等的调节对甘油磷脂产生影响。5.最后,采用BALB/c小鼠模型,验证KAM预处理在体内对DON引起的肠道损伤的预防效果,同时研究肠道菌群与肠道屏障稳态之间的关系。结果表明,KAM预处理明显改善了DON引起的肠道绒毛损伤,降低了血清中FD-4和zonulin含量,提高了c NOS含量以及TC和HDL-C浓度,显示了其对DON引起的肠道屏障功能障碍和低度炎症反应的改善作用。此外,DON对短链脂肪酸代谢和肠道菌群会产生明显的不利影响,Erysipelotrichaceae丰度的增加以及毛螺菌科和瘤胃菌科丰度的降低可能与DON引起的肠道损伤相关。而KAM预处理能够增加DON引起的物种丰度的降低,并可通过减少Erysipelotrichaceae降低兼性厌氧菌和肠道炎症从而对肠道屏障稳态发挥一定的改善作用。
宋亚军[5]（2020）在《MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究》文中认为背景和目的心脏、肾脏等器官移植术后,患者须长期服用免疫抑制剂类药物预防和治疗排斥反应,以延长移植物存活。吗替麦考酚酯是临床上常用于实体器官移植术后的免疫抑制剂之一,通过肠道吸收后迅速在肝细胞内代谢成其活性成分-霉酚酸。在体内,霉酚酸可以通过非竞争性地、可逆地抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的活性,抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径,从而选择性地抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化增殖,降低机体的免疫水平,达到减轻对移植物排斥的目的,尽可能保护移植器官功能。但是,吗替麦考酚酯副作用明显,比如白细胞减少、贫血、败血症等,在胃肠道主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不良反应,即便使用肠溶剂型也难以改善。临床上多采用减少用药剂量甚至中断服药来减轻副作用。目前,吗替麦考酚酯引发胃肠反应的具体机制尚有待探究。角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）对多种细胞都具有促进增殖、分化的功能,能够有效改善克罗恩病、缺血再灌注等因素造成的肠粘膜损伤,修复肠粘膜屏障,改善腹痛、腹泻等不良症状。在肠道,KGF多由TCRγδT细胞分泌,在肠粘膜遭受刺激时,KGF表达可升高。多项研究表明,KGF的表达与细胞因子IL-17A高度相关,而作为IL-17A主要细胞来源的Th17细胞,理论上可直接受吗替麦考酚酯的抑制,根据以上反应链条,不难推测:在肠道,吗替麦考酚酯可能通过抑制Th17细胞及其IL-17A的分泌,减少TCRγδT细胞的活化和KGF的表达,进而造成肠粘膜屏障结构和功能受损,这可能是吗替麦考酚酯引发胃肠反应的作用机制之一。为了验证该假说,我们拟建立吗替麦考酚酯诱导的小鼠肠粘膜损伤模型,外源性给予KGF治疗,观察效果并探讨原因;设计体内、外实验,进一步探究吗替麦考酚酯是否通过作用Th17细胞及其特征性细胞因子IL-17A,进而影响肠道TCRγδT细胞表达KGF的部分作用机制。本研究可为减轻吗替麦考酚酯造成的胃肠道反应提供新的研究思路和干预措施。方法:1.建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型C57雄性小鼠,重20 g-25 g,按照:500 mg/kg,每天灌胃1次吗替麦考酚酯混悬液;或:250mg/kg,每天早、晚各灌胃1次的方式建模,连续灌胃14天,每天固定时间称量小鼠的体重,观察小鼠大便性状,处死后称量肠道湿重,并做病理检查,比较两种方法的建模效果。2.外源性KGF对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的保护作用研究我们设计实验,拟从小鼠体重等大体指标、肠道病理变化、肠粘膜通透性、肠上皮细胞凋亡、增殖,紧密链接蛋白表达以及肠粘膜TCRγδ+IEL细胞比例变化等角度,探究外源性KGF对于MMF模型的肠粘膜保护作用。（1）取30只C57小鼠随机分成3组,每组10只,分别为吗替麦考酚酯组（MMF组）,吗替麦考酚酯+重组角化上皮生长因子组（MMF+KGF组）和对照组（Control组）;（2）称量各组小鼠体重、观察肛门血污、肠道肉眼下状态并测量其长度;（3）用FITC-Dextran和多功能酶标仪检测小鼠肠粘膜通透性;（4）取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;（5）免疫荧光法和蛋白印迹法检测肠粘膜细胞紧密链接蛋白表达情况;（6）分别用Brd U法和TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞增殖和凋亡情况;（7）流式细胞仪检测对比各组小鼠肠道TCRγδ+IEL细胞比例。3.吗替麦考酚酯对小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A表达的影响。建立吗替麦考酚酯诱导的肠粘膜损伤模型,并在模型基础上给予Th17细胞回输,或IL-17A细胞因子腹腔注射,观察各组小鼠肠粘膜损伤,Th17细胞比例以及IL-17A表达情况,以期阐释吗替麦考酚酯的肠粘膜损害作用是否与Th17细胞抑制及其IL-17A表达下调有关。（1）动物模型的建立与分组:取40只C57小鼠随机分成4组,每组10只,分别为空白对照组（Control组）,吗替麦考酚酯组（MMF组）,MMF+Th17细胞回输组（MMF+Th17组）,和MMF+IL-17A腹腔注射组（MMF+IL-17A组）;（2）取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;（3）流式细胞仪检测各组小鼠肠粘膜Th17细胞比例;（4）免疫印迹法检测各组小鼠肠粘膜IL-17A的表达;4.IL-17A作用Vγ4细胞表达KGF机制的初步探讨（1）用IL-17A（1μg/kg/day,连续5天）腹腔注射野生型小鼠、抗体清除Vγ1细胞小鼠、抗体清除Vγ4细胞小鼠、JAK/STAT信号阻断剂（AG490）小鼠,空白对照组以同样方式注射生理盐水。5天后,用免疫组化法观察KGF表达情况,蛋白印迹法检测JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况;（2）体外培养Vγ4T淋巴细胞,实验组用IL-17A刺激,对照组加等量PBS缓冲液,6 h后用ELISA法检测细胞培养上清液中KGF蛋白的表达,用RT-PCR法检测KGF在RNA水平的变化,蛋白印迹法检测Vγ4T细胞内JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况。结果:1.与以往报道的方法相比,在保证灌饲吗替麦考酚酯总量不变的情况下,早8:00,晚6:00两个时间点分别灌胃的方法具有省时、稳定的优点,所以,我课题组采用这一方法建模。2.与对照组相比,MMF组小鼠体重减轻,肠粘膜损伤和通透性增加,紧密链接蛋白（ZO-1、Claudin-1）的表达减少,分布紊乱。肠粘膜上皮细胞的增殖减少,凋亡增加;相对于MMF组,MMF+KGF组肠粘膜屏障损害减轻,肠上皮细胞增殖增加,凋亡减少;肠上皮细胞间的紧密链接蛋白更加稳定,肠上皮细胞内的TCRγδ+细胞比例升高。3.与对照组相比,MMF组肠粘膜病理损伤严重,而MMF+Th17组和MMF+IL-17A组肠粘膜损伤好转,病理评分比MMF组下降;流式细胞检测显示MMF组肠粘膜Th17细胞比例下降,MMF+Th17组肠粘膜Th17细胞比例有所回升,MMF+IL-17A组肠粘膜Th17细胞比例与MMF组未见差异。4.免疫组化结果显示,与空白对照组相比,用IL-17A腹腔注射后,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组肠粘膜KGF表达增多,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠KGF表达未见差异;蛋白印迹结果显示,用IL-17A腹腔注射后,与空白对照组相比,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组p-JAK2、p-STAT3表达上升,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠p-JAK2、p-STAT3表达未见差异;在体外细胞培养实验中,相对于对照组,实验组（IL-17A刺激）KGF在蛋白和RNA水平表达升高,蛋白印迹法检测到Vγ4T细胞内p-JAK2、p-STAT3表达升高。5.结论:1.相对于传统,改良后的建模方法（早8:0,晚6:00用250 mg/m L的吗替麦考酚酯混悬液100μL灌胃）,建模时间缩短,肠粘膜损伤明确,最终血药浓度与传统方法无差异。模型的稳定性好,成功率高。2.外源性给予KGF可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这一作用可能是通过促进肠粘膜上皮细胞增殖、抑制其凋亡,保护肠上皮细胞间的紧密链接蛋白（ZO-1、Claudin-1）,稳定肠上皮内的TCRγδ+细胞实现的。3.回输Th17细胞和腹腔注射IL-17A细胞因子可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这些结果提示:吗替麦考酚酯抑制肠粘膜Th17细胞及IL-17A表达有可能是其造成肠粘膜损伤的部分机制。4.肠粘膜上分泌KGF的γδT细胞亚型主要是Vγ4;IL-17A可以激活Vγ4细胞,增加KGF分泌;体在外实验中,IL-17A可以通过激活JAK/STAT信号通路,上调p-JAK2、p-STAT3水平,进而调控KGF表达;JAK2抑制剂AG490可以有效抑制Vγ4细胞分泌KGF。这些结果提示:IL-17A可通过上调肠粘膜Vγ4细胞JAK/STAT信号通路磷酸化水平调控KGF表达。
王哲[6]（2020）在《FOXP3促进结直肠癌肝转移的机制研究》文中研究指明目的:结直肠癌是国内外常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高。在我国结直肠癌发病率居第四位,死亡率居第四位。2018全球癌症年报显示结直肠癌发病率10.2%,在全球新发癌症发病率中排第三。远处转移是结直肠癌患者治疗失败的主要原因。肝脏是血行转移最主要的靶器官,约20%-34%的患者在临床确诊时已有肝转移。结直肠癌肝转移也是结直肠癌患者最主要的死亡原因。目前肝转移发生的机制尚不清楚,早期检测有意义的生物标志物是改善结直肠癌患者生存的关键。因此,从基因水平寻找与结直肠癌肝转移有关的一系列变化,探讨结直肠癌肝转移发生、发展的分子机制,对改善结直肠癌肝转移患者的预后,并找到有效治的治疗靶点极为重要。FOXP3（Forkhead Box P3）是一种转录因子。已经发现FOXP3是调节性T细胞（Tregs）的重要标志基因,参与精确调控Tregs细胞的发展和功能。但是,最近的研究发现FOXP3基因在多种肿瘤细胞中表达。提示FOXP3可能参与肿瘤细胞的发生发展。目前在肠癌细胞中FOXP3表达及发挥的功能和机制还不清楚,相关的生物学行为仍不明确。本研究中,我们旨在探讨FOXP3在肠癌组织及肝转移组织中的表达、功能及其参与调控肠癌肝转移的机制,为肠癌肝转移患者的预后预测和治疗提供新的策略。研究方法:1、采用免疫组化技术检测癌旁组织、肠癌组织及肝转移组织中FOXP3蛋白的表达;2、应用TCGA（The Cancer Genome Atlas）及GEO（Gene Expression Omnibus）数据库及本中心临床随访数据分析FOXP3表达与肠癌患者临床病理参数间的关系;3、转染si RNA建立FOXP3敲减的瞬转细胞株;4、慢病毒转染沉默及过表达FOXP3建立稳转细胞株;5、采用CCK8实验检测细胞增殖能力;6、采用流式技术检测细胞周期变化;7、采用Transwell法测定细胞迁移和侵袭能力;8、采用免疫共沉淀法检测蛋白质相互结;9、采用非靶代谢质谱分析FOXP3影响细胞代谢小分子的改变;10?采用荧光素酶实验、PCR、Western bolt检测Wnt信号通路激活;11、采用免疫荧光实验检测β-连环蛋白（β-catenin）入核变化;12、采用裸鼠肠癌肝转移瘤模型进行体内研究;13、统计学分析:采用R软件及Graphpad统计软件进行统计学分析。所有实验结果均重复3次,并以均值±标准差（x±s）表示。P<0.05认为有统计学意义。结果:1、FOXP3在肠癌组织及肝转移组织中高表达。临床病理资料回顾分析显示,FOXP3的高表达与淋巴结转移、TNM分期及同时性（或异时性）肝转移相关。2、GEO及TCGA数据库分析结果表明,FOXP3在结直肠癌中的表达与KRAS（V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog）突变状态、微卫星不稳定性（Microsatellite instability,MSI）显着相关,而与（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）BRAF突变状态不相关。3、FOXP3促进肠癌细胞体内增殖。细胞增殖-毒性检测实验CCK8提示,沉默FOXP3后肿瘤细胞增殖能力降低,过表达FOXP3后其增殖能力升高。4、FOXP3促进肠癌细胞侵袭及迁移能力。Transwell实验结果提示,沉默FOXP3后,RKO及HT29细胞迁移及侵袭能力减弱,过表达FOXP3后细胞迁移及侵袭能力增强。5、体内研究证明裸鼠体内FOXP3促进肠癌细胞增殖。应用慢病毒过表达及敲减RKO细胞中FOXP3的表达水平,裸鼠腋窝皮下注射,28天后,沉默FOXP3组裸鼠腋窝处皮下肿瘤体积明显小于对照组小鼠,而过表达组肿瘤体积较对照组增大。4、体内研究证明裸鼠体内FOXP3促进肠癌细肝转移。免疫荧光、qPCR及Western blot充分验证利用慢病毒转染RKO细胞中过表达及沉默FOXP3的效率后,裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞,过表组肝转移瘤较对照组明显增多,而沉默组较对照组肝转移瘤减少。8、FOXP3促进肠癌细胞上皮细胞-间充质转化。qPCR及免疫印迹实验结果显示,沉默FOXP3后E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9的mRNA表达水平下降,过表达FOXP3后E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9的表达水平上升。9、FOXP3促进β-catenin入核。免疫荧光实验结果显示在肠癌细胞中过表达FOXP3后,增多的β-catenin主要定位在核中,提示FOXP3促进β-catenin入核。10、FOXP3与TCF4直接结合共激活Wnt信号通路。GSEA分析提示FOXP3升高后Wnt/β-catenin信号通路显着激活。双荧光素酶报告基因实验验证FOXP3激活Wnt/β-catenin信号通路。免疫共沉淀实验证实FOXP3与TCF4直接结合。QPCR及免疫印迹实验证明过表达FOXP3促进Cyclin D1、C-myc表达增高。反之,敲减FOXP3后Cyclin D1、C-myc表达下调。11、过表达FOXP3同时沉默TCF4逆转FOXP3促进细胞侵袭、迁移的作用。Treswell实验结果显示,过表达FOXP3后细胞侵袭能力上升,同时用siRNA沉默TCF4后,较FOXP3过表达组比较,细胞侵袭能力下降。12、过表达FOXP3同时沉默TCL4逆转FOXP3上调E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-9、Cyclin D1及C-myc的表达。13、FOXP3抑制甲硫氨酸循环循（S-adenosyl methionine,SAM）,减低MMP9启动子甲基化,促进MMP9表达。非靶代谢组学分析提示:FOXP3沉默后,对SAM循环的抑制减低,相关代谢产物增加,提示FOXP3抑制SAM循环;QPCR及免疫印迹实验证明FOXP3抑制SAM循环呈浓度依赖性,SAM循环抑制后减低MMP9启动子甲基化,促进MMP9表达,进而参与调控肠癌细胞的代谢重编程,促进肠癌肝转移。结论:FOXP3在肠癌及肝转移组织中高表达发挥癌基因的功能,促进肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移;FOXP3的表达与肠癌分期、同时性肝转移的发生、KRAS突变以及MSI-H（dMMR）状态相关;FOXP3促进肠癌细胞上皮-间充质转化,通过促进β-catenin入核并于TCF4直接结合形成转录共刺激因子,激活经典的Wnt/β-catenin信号通路促进肠癌肝转移;FOXP3通过影响甲硫氨酸循环的SAM代谢促进MMP9表达,进而促进肠癌肝转移的发生。
周兵[7]（2020）在《FNDC5抑制高血压的血管平滑肌细胞炎症、氧化应激和迁移的作用及分子机制》文中提出Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5（type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5）是一种糖基化的跨膜蛋白,糖基化位点位于39K及84A,结构主要包括两个纤连蛋白结构域、一个信号肽和一个插入细胞膜的疏水C末端结构域。在蛋白水解酶的作用下裂解并释放多肽片段鸢尾素（irisin）。FNDC5/irisin最初在肌肉组织中被发现,认为可以促进白色脂肪转化为棕色脂肪,具有提高机体能量消耗和改善代谢疾病的作用,在代谢性疾病发病机制中起重要作用。FNDC5/irisin通过激活信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）逆转血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表型转化,但目前FNDC5/irisin在VSMCs炎症、氧化应激和迁移中的作用与机制仍未见报道。本论文分成两个部分,分别研究了（1）FNDC5在高血压中对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3）炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制;（2）MiR-31-5p在调控FNDC5表达和对VSMCs迁移、氧化应激的作用及分子机制。一、FNDC5抑制血管平滑肌细胞NLRP3炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制1.背景高血压是一种常见的以持续性血压升高为基本特征的慢性心脑血管疾病。长期的慢性炎症和过高的氧化应激水平在高血压的发生发展过程中起到了关键作用,因此抑制血管炎症和氧化应激可能成为降低血压的治疗手段。VSMCs是血管中膜的主要细胞组成成分,VSMCs的功能异常在高血压、动脉粥样硬化、冠心病和动脉瘤等心血管疾病的病程中起重要作用。细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平是氧化应激水平的灵敏感受器,过度的氧化产物会导致炎症水平上升从而促进VSMCs的异常增殖、迁移、凋亡和细胞外基质沉积最终导致血管重构。然而在VSMCs中,FNDC5对NLRP3炎性小体激活和氧化应激的作用和机制未见报道。2.目的本研究拟探讨在血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）处理的VSMCs中,外源性FNDC5对NLRP3炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制,并探讨皮下埋泵微量缓释Ang Ⅱ对FNDC5-/-小鼠（以C57BL/6J小鼠为背景进行FNDC5基因敲除）胸主动脉炎症和氧化应激的作用。3.方法实验采用含10%FBS、100 units/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞系（A7R5）。小鼠原代VSMCs培养在原代VSMCs专用培养基中,培养基含有10%细胞生长因子、10%FBS和1%双抗,并保持在37oC、5%CO2的细胞培养箱中。本实验的动物购买自南京医科大学动物实验中心,采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠及FNDC5-/-小鼠。在小鼠适应环境一周后,随机分为四组,每组各6只,正常对照组皮下埋入含有PBS的微量注射泵、正常实验组皮下埋入含有等量Ang Ⅱ的微量注射泵、FNDC5-/-对照组皮下埋入含有PBS的微量注射泵、FNDC5-/-实验组皮下埋入含有等量Ang Ⅱ的微量注射泵。期间监测小鼠血压、心率。两周后对四组小鼠进行麻醉、取材并进行急性实验。蛋白质免疫分析技术（Western blotting）检测NLRP3、FNDC5、沉默信息因子2相关酶1（Silent mating type information regulation 2 homologl,SIRT1）、含CARD结构域的凋亡相关斑点蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）前体及成熟体、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）前体及成熟体、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4）和β-actin的蛋白表达水平。采用实时定量聚合酶链式反应（real-time PCR,RT-PCR）法检测FNDC5m RNA水平。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测SIRT1酶活性水平。采用马松染色（Masson’s trichrome staining）检测小鼠胸主动脉血管腔纤维化和狭窄程度。Dihydroethidium（DHE）染色法检测小鼠原代VSMCs和A7R5细胞中活性氧水平。免疫荧光技术检测A7R5细胞中NLRP3的表达量。4.结果（1）FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的高血压和血管重构:在皮下植入渗透泵缓释Ang Ⅱ两周引起的高血压小鼠模型中,与WT小鼠相比,FNDC5基因敲除小鼠血压升高的更加显着,且小鼠胸主动脉中膜厚度和面积增加的更加严重。同时给予Ang Ⅱ两周,抑制了WT小鼠胸主动脉FNDC5的表达。（2）FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的血管氧化应激和NLRP3炎性小体激活:皮下植入渗透泵缓释Ang Ⅱ两周后,在WT和FNDC5-/-小鼠胸主动脉中膜内,ROS的生成,NOX2、NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表达均升高,而与WT小鼠相比,这一效应在FNDC5-/-小鼠中更加显着。（3）在Ang Ⅱ处理的A7R5细胞中,外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ引起的氧化应激:Ang Ⅱ处理24 h增加了NOX2、NOX4的蛋白表达和ROS生成,外源性FNDC5的加入则抑制了Ang Ⅱ引起的这些效应。然而有趣的是,Ang Ⅱ处理24 h后,对A7R5细胞FNDC5的表达却无显着影响。（4）在A7R5细胞中,外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ引起的NLRP3炎性小体激活:Ang Ⅱ处理24 h后,增加了NLRP3、ASC、procaspase-1、Caspase-1和pro-IL-1β的蛋白表达,并促进IL-1β生成。而外源性FNDC5的加入则抑制了Ang Ⅱ引起的NLRP3、Caspase-1的蛋白表达上调和IL-1β的生成。（5）FNDC5抑制氧化应激和NLRP3炎性小体激活的效应可被AMPK抑制剂阻断:在Ang Ⅱ处理的A7R5细胞中,外源性FNDC5通过促进AMPKα磷酸化抑制Ang Ⅱ诱导的ROS产生,NOX2、NLRP3的蛋白表达上调和IL-1β的生成,而这一作用可被AMPK的抑制剂Compound C阻断。（6）SIRT1抑制剂阻断FNDC5对氧化应激和NLRP3炎性小体激活的抑制效应:在A7R5细胞中,外源性FNDC5对Ang Ⅱ诱导的ROS产生和IL-1β的生成,NOX2、NLRP3蛋白表达上调的抑制作用被SIRT1抑制剂EX527阻断。（7）整合素蛋白受体抑制剂阻断FNDC5对氧化应激和NLRP3炎性小体激活的抑制作用:在Ang Ⅱ处理的A7R5细胞中,外源性FNDC5对Ang Ⅱ诱导的ROS产生和IL-1β的生成,NOX2、NLRP3蛋白表达上调的抑制作用被整合素蛋白受体抑制剂GLPG0187阻断,此外,FNDC5对AMPKα磷酸化,SIRT1活性和蛋白表达的促进作用亦被整合素蛋白受体抑制剂GLPG0187抑制。（8）在Ang Ⅱ处理的小鼠原代VSMCs中,外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ诱导的氧化应激和NLRP3炎性小体激活:Ang Ⅱ（100 n M）处理小鼠原代VSMCs24 h,对小鼠原代VSMCs中FNDC5 m RNA和蛋白表达均无显着影响。外源性FNDC5抑制Ang Ⅱ诱导的ROS产生,NOX2、NLRP3蛋白表达上调以及IL-1β的生成,。同时Ang Ⅱ对AMPKα磷酸化、SIRT1活性和蛋白表达的抑制作用亦被外源性FNDC5所消除。5.结论FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的NLRP3炎性小体激活和氧化应激。外源性FNDC5通过激活整合素蛋白受体介导的AMPK磷酸化和SIRT1酶活性升高抑制Ang Ⅱ诱导的NLRP3炎性小体激活和氧化应激。二、MiR-31-5p通过抑制FNDC5表达促进血管平滑肌细胞迁移和氧化应激的作用及分子机制1.背景高血压是影响全球死亡率的一个重要因素,影响了全球25%以上的人口。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）在高血压的病程中和高血压所引发的终末器官损害中发挥着至关重要的作用。Ang Ⅱ是强有力的血管收缩剂,Ang Ⅱ直接诱导的血管收缩和VSMCs的过度增殖、迁移、炎症和氧化应激与高血压密切相关。Micro RNA（miRNA）是一类内源性的非编码小RNA,通过与靶基因m RNA的3’UTR区域结合抑制其转录水平。研究表明在大肠癌组织中,miR-31-5p通过抑制膜相关蛋白的表达促进大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。但目前FNDC5在Ang Ⅱ诱导的VSMCs迁移和氧化应激中的作用以及miR-31-5p对FNDC5表达的调控仍不明确。2.目的本实验旨在探讨miR-31-5p在调控FNDC5表达和VSMCs迁移、氧化应激中的作用及分子机制。3.方法实验采用南京医科大学实验动物中心的8周龄雄性C57/BL6J（WT）小鼠和FNDC5-/-小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司的8周龄雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rat,SHR）和Wistar-Kyoto（WKY）大鼠。采用酶消化法提取SHR和WKY大鼠原代VSMCs及Male wild-type（WT）和FNDC5-/-小鼠原代VSMCs,并将小鼠原代VSMCs、大鼠原代VSMCs和A7R5细胞培养在37oC、5%CO2的细胞培养箱中。Western Blot检测NOX2和NOX4蛋白表达水平。RT-PCR检测FNDC5和miR-31-5p水平。DHE染色法检测VSMCs活性氧水平。采用Boyden小室实验和伤口愈合实验检测VSMCs的迁移能力。双荧光素酶报告基因实验检测FNDC5与miR-31-5p的结合情况。4.结果（1）MiR-31-5p促进大鼠原代VSMCs迁移:MiR-31-5p模拟剂促进SHR和WKY大鼠原代VSMCs迁移,并且这一效应在SHR原代VSMCs中更加显着。而miR-31-5p抑制剂仅抑制SHR原代VSMCs迁移,对WKY大鼠原代VSMCs迁移无显着影响。（2）MiR-31-5p抑制FNDC5的表达:MiR-31-5p模拟剂抑制野生型（WT-FNDC5）质粒的荧光素酶分子活性,但在突变的（Mut-FNDC5）质粒中没有抑制效果;在SHR原代VSMCs中miR-31-5p表达量远高于WKY大鼠VSMCs;miR-31-5p模拟剂同时抑制WKY和SHR原代VSMCs中FNDC5的表达;并且在A7R5细胞中,miR-31-5p模拟剂同样也抑制了FNDC5的表达。（3）外源性FNDC5抑制SHR原代VSMCs迁移:在培养的大鼠原代VSMCs上清中加入外源性FNDC5,外源性FNDC5的加入抑制了SHR原代VSMCs迁移但对WKY大鼠原代VSMCs迁移无显着抑制效果。（4）FNDC5基因敲除促进小鼠原代VSMCs迁移:Ang Ⅱ（100 nmol/L）处理小鼠原代VSMCs 24小时构建细胞迁移体外模型。与WT小鼠原代VSMCs相比,Ang Ⅱ诱导的促细胞迁移作用在FNDC5-/-小鼠原代VSMCs中表现的更加显着。（5）外源性FNDC5抑制SHR原代VSMCs氧化应激:SHR原代VSMCs中ROS的产生,NOX2和NOX4的蛋白表达均高于WKY大鼠原代VSMCs,而外源性FNDC5的加入则显着抑制SHR原代VSMCs中ROS的产生,NOX2蛋白表达,但对WKY和SHR原代VSMCs中NOX4蛋白表达均无显着影响。（6）FNDC5基因敲除加重小鼠原代VSMCs氧化应激:PBS处理后,WT小鼠或FNDC5-/-小鼠VSMCs中ROS的产生,NOX2、NOX4的蛋白表达均不升高。Ang Ⅱ处理则显着升高小鼠VSMCs中ROS的产生,NOX2的蛋白表达,并且这一效应在FNDC5-/-小鼠中更加显着。但Ang Ⅱ处理对WT和FNDC5-/-小鼠VSMCs中NOX4的表达均无显着影响。（7）MiR-31-5p抑制剂抑制SHR原代VSMCs氧化应激:MiR-31-5p抑制剂对WKY大鼠VSMCs中ROS产生,NOX2的蛋白表达没有影响,但显着抑制SHR原代VSMCs中ROS产生,NOX2的蛋白表达,且对WKY和SHR原代VSMCs中NOX4的表达均无显着影响。（8）外源性FNDC5抑制miR-31-5p模拟剂诱导的氧化应激增强:MiR-31-5p模拟剂、MiR-31-5p模拟剂+外源性FNDC5对WKY大鼠VSMCs中ROS产生,NOX2的蛋白表达均无显着影响。而在SHR原代VSMCs中,miR-31-5p模拟剂显着增加ROS产生,NOX2的蛋白表达,而外源性FNDC5的加入则抑制了这一现象。但是miR-31-5p模拟剂、miR-31-5p模拟剂+FNDC5对WKY和SHR原代VSMCs中NOX4的蛋白表达均无显着影响。5.结论MiR-31-5p通过抑制FNDC5的表达加重SHR原代VSMCs迁移和氧化应激。外源性FNDC5抑制SHR原代VSMCs迁移和氧化应激。FNDC5基因敲除加重Ang Ⅱ诱导的小鼠原代VSMCs迁移和氧化应激。
杨莉[8]（2019）在《益母草碱对肉仔鸡的免疫和抗氧化作用及其机制研究》文中指出目的:研究益母草碱对肉仔鸡生长性能,免疫功能、抗氧化活性以及肠道黏膜屏障保护作用的调控机制,为益母草碱在肉鸡养殖中的应用提供理论依据。方法:（1）将600只1日龄ROSS 308肉仔鸡随机分为5个处理组,每个处理组8个重复,每个重复15只鸡。每个处理组分别是在基础饲粮中添加0,15,30,60,120 mg/kg的益母草碱,整个试验分为中期（021日龄）和后期（2242）两个阶段。通过检测不同水平益母草碱对肉仔鸡生长性能,免疫器官指数、抗体效价、血脂含量以及血清免疫抗氧化等指标,确定益母草碱的最佳添加水平。（2）在上一部分研究结果的基础上,采用2×2因子随机区组设计,以添加益母草碱（0或者120 mg/kg）和LPS（腹腔注射生理盐水或者1.5 mg/kg BW的LPS）攻毒作为处理因素,将120只1日龄健康、体重相近的肉仔鸡,随机分为2个处理组,每个处理组12个重复,每个重复5只。第14、16、18和20天,从每个处理组选出半数肉仔鸡腹腔注射LPS,另一半注射相同剂量的生理盐水,检测21和28日龄肉仔鸡生长性能、免疫器官指数、血清和脾脏免疫抗氧化水平,了解益母草碱对LPS诱导的炎症反应和氧化应激是否有缓解作用,为后续研究提供试验依据。（3）在试验二的基础上,采集21和28日龄肉仔鸡十二指肠、空肠以及回肠黏膜和其内容物,通过检测其小肠黏膜形态、肠道菌群数量变化以及肠黏膜抗氧化指标,观察益母草碱对LPS诱导的肠黏膜屏障损伤的保护作用;通过荧光定量PCR检测炎性因子和炎性介质的mRNA表达水平,探究益母草碱对炎症反应的调控作用;通过Western Blot检测紧密连接蛋白和MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白的磷酸化水平,明确益母草碱缓解肠道炎症反应和氧化应激的作用机制。（4）采用14胚龄的SPF鸡胚原代分离肠上皮细胞,建立体外培养模型,采用CCK-8法检测细胞活力,确定益母草碱和LPS的最佳处理浓度和时间;通过荧光定量PCR检测炎性因子、抗氧化酶和紧密连接蛋白mRNA的表达水平,探明益母草碱对LPS诱导的肠上皮细胞炎症反应的保护作用;通过Western Blot检测相关信号通路因子的磷酸化水平,明确益母草碱对缓解体内和体外肠道屏障功能损伤影响的作用机制是否一致。结果:（1）在饲粮中添加益母草碱对全期肉鸡的生长性能无明显影响,但益母草碱显着增加脾脏指数、新城疫抗体效价、血清中IgA、IgM、CAT、T-SOD、T-AOC、LDL-C、HDL-C的含量,能够显着降低血清中MDA、TC以及CHOL的含量（P<0.05）。此外,还可以显着增加42日龄肉仔鸡血清中GSH的活性（P<0.05）。但对法氏囊和胸腺指数、传染性法氏囊抗体滴度、血清中IgG、IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度无显着影响（P>0.05）。综上所述,饲粮补充益母草碱可提高肉鸡的免疫功能和抗氧化能力,降低肉鸡的血脂水平。（2）在饲粮中添加益母草碱对LPS应激前后肉仔鸡（1-14天,22-28天）的生长性能和血清中免疫球蛋白含量无显着差异。在LPS应激期（14-21）和恢复期（21-28）,益母草碱可有效缓解LPS诱导的肉仔鸡ADG和ADFI的降低、脾脏指数的增加、血清和脾脏MDA水平的升高以及GSH和SOD活力的下降（P<0.05）。此外,添加益母草碱可显着减轻LPS诱导的血清和脾脏中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的增加（P<0.05）,并显着降低脾脏中NF-κB mRNA的表达量（P<0.05）。（3）经LPS诱导可显着破坏肉仔鸡十二指肠和空肠的黏膜形态,提高其血清中二胺氧化酶和D-乳酸的含量、小肠内容物中大肠杆菌和沙门氏菌的数量和MDA的水平,降低十二指肠和空肠黏膜中GSH和T-SOD活性以及乳酸杆菌的数量（P<0.05）。而在饲料中添加益母草碱能显着缓解LPS对十二指肠和空肠的影响（P<0.05）,对回肠的作用不显着（P>0.05）。与此同时,添加益母草碱还可显着下调因LPS诱导空肠黏膜中NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-1β以及IL-l-6 mRNA的表达量的升高（P<0.05）,上调ZO-1和Occludin mRNA的表达量（P<0.05）。另外,益母草碱还抑制了LPS诱导的p38、ERK and JNK MAPKs信号通路的激活、IκBα磷酸化和NF-κB的核易位。（4）经检测,采用40μM/mL益母草碱预处理3 h后,可显着缓解LPS诱导的肠上皮细胞的凋亡,益母草碱能通过提高SOD1、GPX1、ZO-1以及Occludin基因表达量（P<0.05）,降低iNOS、COX-2、TNF-α以及IL-1β的表达量（P<0.05）,抑制MAPK/NF-κB信号通路的激活,从而缓解LPS应激对肠上皮细胞造成的损伤,保护细胞的完整性。结论:在饲粮中添加120 mg/kg的益母草碱可显着增强肉鸡的免疫功能和抗氧化水平,缓解由LPS诱导引起的肉鸡肠道炎症反应、氧化应激以及黏膜屏障功能的损伤,其保护作用的机制是通过抑制NF-κB核转位和MAPK信号通路关键分子的磷酸化,阻碍炎性因子和炎性介质的表达,并通过提高抗氧化酶的活性,进而干预LPS引起的炎症反应和氧化应激;抑制肠道病原菌的过渡繁殖,调节紧密连接蛋白的表达,进而维持肠道黏膜屏障的稳定和完整性。本试验为抗应激新饲料添加剂的开发提供了新的理论依据。
李彪[9]（2019）在《日粮中添加尿苷酸对仔猪生长性能的影响及其作用机制》文中研究表明核苷酸在仔猪日粮添加,对仔猪胃肠道发育、肠道的损伤修复、脂质代谢、免疫系统等产生重大的影响。核苷酸被称作是一种“半必需”或“条件性”营养素。通过检测对比母猪整个哺乳期乳中和仔猪教槽料中的核苷酸含量变化,发现仔猪教槽料中尿苷酸最缺乏。本研究旨在系统研究尿苷酸在仔猪日粮中添加对仔猪生长性能、腹泻情况、氨基酸代谢、脂肪代谢、肠道黏膜形态和核苷酸代谢基因表达的影响,揭示尿苷酸对提高仔猪生长性能、促进肠道黏膜发育和调节脂肪代谢的作用机制,探讨其在仔猪教槽料中添加的可行性,为教槽料的升级改进方向提供科学依据。主要研究内容和结果如下。选取48只21日龄断奶的（长白×大白×杜洛克）仔猪（6.64±0.23 kg）,随机分为2组,即对照组和尿苷酸组,每组分6栏进行饲养,每栏为1个重复,每个重复4头仔猪,公母各半。对照组饲喂基础日粮,尿苷酸组饲喂0.07%尿苷酸二钠+基础日粮,饲喂14天。试验结果表明:1、与对照组相比,尿苷酸组ADFI（P<0.05）和ADG（P<0.01）显着增加,添加尿苷酸的仔猪F:G极显着降低（P<0.01）。日粮中添加UMP可显着降低仔猪腹泻率（P<0.05）。结果提示:尿苷酸在仔猪断奶日粮中添加有很好的改善仔猪生产性能的应用效果。2、尿苷酸组血液中球蛋白GLB、免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgM含量都高于对照组。尿苷酸组血液乳酸脱氢酶LDH显着增加（P<0.05）。血液中氨基酸含量,尿苷酸组中的尿素氮Urea（P<0.05）比对照组显着降低,肝脏中氨基酸含量,尿苷酸组牛磺酸（P<0.01）和甘氨酸（P<0.01）含量极显着性提高。结果提示:尿苷酸可提高仔猪的非特异性免疫能力,同时可加速脂肪酶解。3、与对照组相比,尿苷酸组空肠绒毛长度（P<0.05）和绒腺比（P<0.01）显着提高,回肠绒毛长度（P<0.01）和绒腺比（P<0.01）均极显着提高。结果提示:尿苷酸可显着性改善仔猪空肠和十二指肠的肠道黏膜形态,这可能是尿苷酸能降低仔猪料肉比的原因之一。4、相比对照组,尿苷酸组肝脏中牛磺酸（P<0.01）、甘氨酸（P<0.01）含量极显着提,肝脏中尿苷酸合成酶UMPS（P<0.01）表达显着降低,尿苷酸组肝脏中γ-亚麻酸甲酯（P<0.01）和二十碳五烯酸（P>0.05）含量提高,脂肪酸合成酶FAS（P<0.01）极显着降低。结果提示:尿苷酸可促进仔猪肝脏中脂肪代谢。综上所述,在断奶仔猪日粮中添加尿苷酸,可以提高仔猪平均日采食量和日增重,降低料肉比和腹泻率。尿苷酸的添加可增加仔猪空肠和回肠的肠绒毛长度和绒腺比,改善仔猪的肠道黏膜形态。尿苷酸可使肝脏中牛磺酸的合成量增加,同时提高肝脏中多不饱和脂肪酸的含量,反向抑制肝脏中脂肪酸合成酶的含量,减少脂肪合作,可能会进一步减少机体能量损耗,也可能是改善动物生长性能的原因之一。
罗敏[10]（2019）在《miR-30c-2-3p介导的细胞迁移在肠上皮细胞损伤修复作用及甘草酸的干预研究》文中指出完整的肠粘膜上皮屏障能够有效阻止肠腔内细菌、抗原等有害物质侵入体内,是人体内重要的保护屏障。相关研究表明,在严重感染、创伤、休克和大手术等应激刺激下,肠粘膜受损,其自我修复能力必然降低,可导致肠粘膜上皮完整性被破坏。近年来的研究强调分子信号传导对肠粘膜上皮损伤后的修复和屏障功能重建的关键作用。长期进化以来,肠粘膜已形成了一套损伤后的自我修复机制,包括快速修复和慢速修复。肠粘膜受损时,机体迅速启动快速修复机制来保护肠粘膜,以防细菌、内毒素趁虚而入,相对于细胞增殖,细胞迁移要快得多,首先紧邻缺损部位的活性肠上皮细胞失去其柱状极性并快速迁移,覆盖病灶部位,可在几分钟至几小时内完成修复,随后发生肠上皮的慢速修复机制,肠道干细胞不断增殖分化,并通过移行的方式不断向上迁移以填补减少的细胞数目。细胞迁移过程必然涉及一系列转录和转录后基因修饰水平的调控,miRNA在其中发挥了至关重要的作用,然而,miRNA对肠上皮细胞迁移的作用及机制尚不完全明确。研究显示,健脾益气中药甘草可通过促进肠上皮细胞的增殖、分化和移行等加快肠粘膜屏障损伤的修复。甘草有健脾益气功效,研究表明,甘草中的活性成分甘草酸能够降低肠粘膜通透性,减轻炎症反应,促进肠粘膜屏障损伤修复。本课题旨在研究miR-30c-2-3p在小肠上皮移行修复的作用及机制,同时,初步探讨甘草酸对肠上皮细胞迁移的作用及相关信号通路。目的:研究miR-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖、迁移能力的影响;验证miR-30c-2-3p与STIM2之间的靶向调控关系,深入研究miR-30c-2-3p对肠上皮细胞迁移的作用机制及相关信号通路,并初步探讨甘草酸对PYK2/MYLK/MLC2信号通路中的作用,从而为进一步阐明miR-30c-2-3p在肠粘膜损伤修复的作用机制。方法:1.通过MTT实验、EdU实验、细胞划痕实验评价miR-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响。2.采用靶基因预测软件预测和分析miR-30c-2-3p可能调节的靶基因,并结合Biotinylated-miRNA pull down实验和双荧光素酶报告基因实验检测miR-30c-2-3p与STIM2之间是否存在靶向调控关系;采用Realtime-PCR技术及Western blot技术进一步检测miR-30c-2-3p对STIM2在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,从而验证miR-30c-2-3p对STIM2的靶向调控作用。3.通过Western blot技术、Fura-2 AM钙离子检测的方法,检测miR-30c-2-3p对细胞内钙离子浓度和钙离子相关的MYLK/MLC2信号通路蛋白表达的影响。4.利用FITC标记鬼笔环肽标记F-肌动蛋白骨架,并通过激光共聚焦扫描显微镜观察miR-30c-2-3p对肠上皮细胞骨架的变化。5.通过siRNA技术沉默STIM2及质粒过表达STIM2分别验证miR-30c-2-3p通过靶向调控STIM2促进肠上皮细胞的迁移。6.应用细胞划痕实验、Fura-2 AM钙离子检测、Western blot技术,检测甘草酸对细胞内钙离子浓度和钙离子相关的PYK2/MYLK/MLC2信号通路蛋白表达的影响。结果:1.将miR-30c-2-3p mimic和inhibitor转染进入IEC-6中,细胞增殖实验结果表明各转染组相对于对照组IEC-6细胞增殖能力并没有明显变化;细胞划痕实验结果发现转染48h后各组呈现明显差别,在IEC-6细胞中转染miR-30c-2-3p mimic后细胞迁移速度明显快于miR-30c-2-3p mimic NC组,愈合能力增强（P<0.05）,而加入miR-30c-2-3p inhibitor能够抑制这种现象,细胞迁移能力明显减弱,与miR-30c-2-3p inhibitor NC相比差异具有统计学意义（P<0.05）。2.生物信息学软件预测结果显示,STIM2可能为miR-30c-2-3p预测的靶基因,Pull down实验结果表明,miR-30c-2-3p mimic组与STIM2 mRNA结合率明显高于对照组（P<0.05）,同时双荧光素酶报告基因实验结果发现,与共转染miR-30c-2-3p mimic NC 和 pEZ-STIM2 3’ UTR 野生型重组质粒（WT）相比,转染 miR-30c-2-3pmimic和pEZ-STIM2 3’ UTR野生型重组质粒的荧光素酶活性明显降低（P<0.05）,而转染miR-30c-2-3p mimic和pEZ-STIM2 3’ UTR突变型重组质粒（MUT）则无明显变化,这结果说明miR-30c-2-3p可以直接作用于STIM2 3’ UTR靶序列,下调STIM2的表达;RT-PCR、WB验证表明miR-30c-2-3p过表达时抑制STIM2的基因水平和蛋白水平的表达,miR-30c-2-3p抑制表达时,STIM2的基因水平和蛋白表达水平上调。证实miR-30c-2-3p对STIM2存在调控作用。3.miR-30c-2-3p增加细胞内钙离子浓度,同时上调MYLK、p-MLC2和MLC2的蛋白表达,细胞骨架变化使细胞呈延展状态。4.siRNA沉默STIM2实验结果表明,沉默STIM2能够增加IEC-6细胞内钙离子浓度,上调MYLK的表达,同时增高了 p-MLC2和MLC2蛋白含量,并促进细胞迁移。而过表达质粒STIM2转染实验结果显示,过表达STIM2降低细胞内钙离子浓度,减少钙离子内流,下调MYLK的表达,同时降低了 p-MLC2和MLC2的表达,从而逆转miR-30c-2-3p mimic对IEC-6细胞的促迁移作用。5.50 μ g/mL甘草酸作用IEC-6细胞48h后,甘草酸能显着促进IEC-6细胞迁移,激活PYK2,增加细胞内钙离子浓度,并促进MYLK、p-MLC2和MLC2蛋白的表达。结论:本研究表明,miR-30c-2-3p靶向调控STIM2,增加细胞内钙离子浓度,并影响MYLK/MLC2信号通路蛋白的表达,促进细胞迁移。甘草酸能激活PYK2/MYLK/MLC2信号通路介导IEC-6细胞的迁移。
二、外源核苷酸对肠上皮细胞增殖和迁移的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外源核苷酸对肠上皮细胞增殖和迁移的作用（论文提纲范文）
（1）干酪乳杆菌刺激肠细胞产生抗菌肽的筛选及其对肠上皮细胞增殖作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干酪乳酸菌的益生功能 |
| 1.2 肠黏膜屏障 |
| 1.2.1 肠道微生物群 |
| 1.2.2 黏液层 |
| 1.2.3 sIgA |
| 1.2.4 上皮细胞 |
| 1.3 抗菌肽 |
| 1.3.1 抗菌肽的来源与分类 |
| 1.3.2 抗菌肽生物学功能 |
| 1.3.3 抗菌肽的应用与前景 |
| 1.4 肠道屏障信号通路 |
| 1.4.1 mTOR通路 |
| 1.4.2 Wnt/β-Catenin通路 |
| 1.5 高通量测序与转录组学 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 干酪乳杆菌刺激小鼠产生抗菌肽转录组分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 .结果与分析 |
| 2.2.1 干酪乳杆菌刺激小鼠产生抗菌肽转录组分析 |
| 2.2.2 抗菌肽基因qRT-PCR验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 抗菌肽基因原核表达及其蛋白功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2.结果与分析 |
| 3.2.1 抗菌肽基因RT-PCR结果 |
| 3.2.2 抗菌肽重组质粒PCR与酶切结果 |
| 3.2.3 重组抗菌肽蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.4 重组抗菌肽蛋白抑制ETEC的增殖 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 重组抗菌肽蛋白促进肠上皮细胞增殖能力的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 .结果与分析 |
| 4.2.1 重组抗菌肽蛋白可促进肠上皮细胞增殖 |
| 4.2.2 重组抗菌肽蛋白可促进肠上皮细胞迁移 |
| 4.2.3 重组抗菌肽蛋白促进细胞紧密连接相关蛋白表达 |
| 4.2.4 重组抗菌肽蛋白激活mTOR与Wnt/β-Catenin通路 |
| 4.3 .讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（2）间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障及肺血管屏障功能的保护作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障功能的保护作用及机制 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 间充质干细胞微囊泡对脓毒症肺血管屏障功能的保护作用及机制 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 血管内皮细胞微囊泡在脓毒症肺血管屏障功能中的作用 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料及方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞外囊泡简介及在创伤休克中的治疗作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（3）Circ-LECRC内源性竞争结合miR-135b-5p上调靶基因KLF4抑制结直肠癌的增殖、转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:Circ-LECRC在结直肠癌细胞系及组织标本中的差异表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 组织来源 |
| 2.2 材料试剂 |
| 2.2.1 实验细胞 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 数据分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 总RNA提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 Real-time PCR |
| 2.3.5 原位杂交(ISH) |
| 2.4 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 circ-LECRC的环状水平验证及稳定性检测 |
| 3.1.1 结直肠癌中circ-LECRC的发现 |
| 3.1.2 circ-LECRC的环状水平验证 |
| 3.1.3 circ-LECRC的稳定性检测 |
| 3.2 qPCR检测肠癌组织与癌旁组织中circ-LECRC的表达差异 |
| 3.2.1 收集65 例肠癌患者的基本信息 |
| 3.2.2 circ-LECRC在肠癌组织及其癌旁非癌组织中的表达情况 |
| 3.2.3 分析结直肠癌患者临床及病理资料与circ-LECRC表达量之间的关系 |
| 3.3 ISH检测肠癌组织与癌旁非癌组织中circ-LECRC的表达差异及预后资料分析 |
| 3.3.1 收集52 例肠癌患者的基本信息 |
| 3.3.2 Circ-LECRC在肠癌组织及其癌旁非癌组织中的表达情况 |
| 3.3.3 分析结直肠癌患者临床及病理资料与circ-LECRC表达量之间的关系 |
| 3.3.4 分析结直肠癌患者预后资料与circ-LECRC表达量之间的关系 |
| 3.4 qPCR检测肠癌细胞系中circ-LECRC的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:Circ-LECRC对结直肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 仪器试剂 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 RNA提取 |
| 2.4.2 反转录 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4.4 细胞转染 |
| 2.4.5 构建稳定转染细胞系 |
| 2.4.6 CCK8 实验 |
| 2.4.7 Transwell实验 |
| 2.4.8 流式细胞仪测凋亡实验 |
| 2.4.9 流式细胞仪测周期实验 |
| 2.4.10 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.4.11 裸鼠肿瘤肺转移实验 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 过表达及干扰肠癌细胞系circ-LECRC的表达 |
| 3.2 Circ-LECRC对肠癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.3 Circ-LECRC对肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4 Circ-LECRC对肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 Circ-LECRC对肠癌细胞凋亡的影响 |
| 3.6 Circ-LECRC对肠癌细胞周期的影响 |
| 3.7 体内验证circ-LECRC对 SW480 细胞的生长抑制作用 |
| 3.7.1 建立稳定过表达circ-LECRC的 SW480 细胞系 |
| 3.7.2 验证circ-LECRC对 SW480 细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 |
| 3.7.3 验证circ-LECRC对SW480细胞裸鼠肺转移抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:Circ-LECRC内源性竞争结合miR-135b-5p上调靶基因KLF4 抑制结直肠癌的增殖、转移及其机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA提取 |
| 2.2.2 茎环法反转录 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 CCK8 实验 |
| 2.2.5 Transwell实验 |
| 2.2.6 蛋白提取及定量 |
| 2.2.7 Western Blot |
| 2.2.8 荧光原位杂交(FISH) |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因 |
| 2.2.10 RNA免疫共沉淀 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 Circ-LECRC在细胞中的定位 |
| 3.2 构建circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4 调控网络 |
| 3.3 验证circ-LECRC/miR-135b-5p及 miR-135b-5p/KLF4 结合 |
| 3.3.1 FISH验证circ-LECRC与 miR-135b-5p在 SW480 细胞中共定位 |
| 3.3.2 双荧光素酶验证circ-LECRC/miR-135b-5p及 miR-135b-5p/KLF4结合 |
| 3.3.3 RIP验证miR-135b-5p与 circ-LECRC及 KLF4 结合 |
| 3.4 验证肠癌组织miR-135b-5p及 KLF4 表达及其与circ-LECRC相关性 |
| 3.4.1 miR-135b-5p在结直肠癌患者中表达情况及与circ-LECRC相关性 |
| 3.4.2 KLF4 在结直肠癌患者中表达情况及与circ-LECRC相关性 |
| 3.5 验证肠癌细胞中circ-LECRC对 KLF4 表达的影响 |
| 3.6 RIP验证验证circ-LECRC/miR-135b-5p及 miR-135b-5p/KLF4 调控关系 |
| 3.7 circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4 作用轴对肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 3.7.1 对肠癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.7.2 对肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.7.3 对肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 综述 环状RNA在结直肠癌中的表达与功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研业绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）山奈酚对脱氧雪腐镰刀菌烯醇致肠道屏障损伤的预防作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肠道屏障 |
| 1.1.1 肠道屏障组成 |
| 1.1.2 细胞连接 |
| 1.1.3 肠道菌群 |
| 1.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 |
| 1.2.1 DON的来源与分布 |
| 1.2.2 DON的污染情况及限量标准 |
| 1.2.3 DON的吸收代谢和毒性作用 |
| 1.2.4 DON与肠道屏障 |
| 1.3 植物化学物质与肠道屏障 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 Caco-2 细胞模型的建立及DON和 KAM作用初探 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 试验材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 主要溶液的配制 |
| 2.3.2 细胞的培养 |
| 2.3.3 Caco-2细胞模型的建立 |
| 2.3.4 跨膜电阻值TEER的测定 |
| 2.3.5 跨膜转运标志物通透性测定 |
| 2.3.6 Caco-2细胞增殖抑制率的测定 |
| 2.3.7 碱性磷酸酶(ALP)活性的测定 |
| 2.3.8 乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 |
| 2.3.9 氧化指标的测定 |
| 2.3.10 免疫荧光染色 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 Caco-2细胞模型的建立及验证 |
| 2.4.2 植物化学物质的筛选 |
| 2.4.3 DON和 KAM作用浓度的选择 |
| 2.4.4 DON及 KAM对 Caco-2 细胞模型活性的影响 |
| 2.4.5 DON及 KAM对 Caco-2 细胞模型氧化还原体系的影响 |
| 2.4.6 DON及 KAM对 Caco-2 模型细胞连接的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 DON及 KAM对不同增殖分化时期Caco-2 细胞模型屏障功能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 试验材料与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 Caco-2细胞模型的建立 |
| 3.3.2 试验处理及分组 |
| 3.3.3 碱性磷酸酶活性的测定 |
| 3.3.4 蛋白样品的提取 |
| 3.3.5 Western blot试验 |
| 3.3.6 免疫荧光染色 |
| 3.3.7 数据分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Caco-2细胞模型在不同增殖分化时期的特征 |
| 3.4.2 DON及 KAM对 Caco-2 细胞模型不同时期ALP相对活性的影响 |
| 3.4.3 DON及 KAM对不同时期Caco-2 细胞模型完整性和紧密连接的影响 |
| 3.4.4 Caco-2细胞模型完整性与紧密连接蛋白表达的相关性分析 |
| 3.4.5 DON及 KAM对不同时期claudin3和claudin4 的免疫荧光影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 KAM对 DON致 Caco-2 细胞模型屏障损伤预防作用的蛋白质组学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 试验材料与试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 Caco-2细胞模型的建立 |
| 4.3.2 细胞样品准备 |
| 4.3.3 定性与定量蛋白质组学 |
| 4.3.4 Western blot试验 |
| 4.3.5 数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 原始数据预处理 |
| 4.4.2 不同处理间差异表达蛋白的鉴定 |
| 4.4.3 不同对比策略下差异表达蛋白的基因本体论(GO)富集分析 |
| 4.4.4 不同对比策略下差异表达蛋白的KEGG代谢通路富集分析 |
| 4.4.5 细胞连接相关差异表达蛋白的层次聚类分析 |
| 4.4.6 细胞连接代谢通路及相关蛋白表达 |
| 4.4.7 细胞连接代谢通路相关蛋白表达的WB验证 |
| 4.4.8 差异表达蛋白的相互作用(PPI)网络分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 DON及 KAM作用下Caco-2 细胞模型的代谢组学及组学关联研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 试验材料与试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 Caco-2细胞模型的建立 |
| 5.3.2 细胞样品准备 |
| 5.3.3 代谢组学 |
| 5.3.4 组学关联分析 |
| 5.3.5 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 代谢组学分析质量控制 |
| 5.4.2 DON及 KAM作用后Caco-2 细胞模型代谢物的多元变量分析 |
| 5.4.3 DON及 KAM作用后Caco-2 细胞模型差异代谢物的筛选 |
| 5.4.4 差异代谢物的层次聚类分析 |
| 5.4.5 差异代谢物的代谢通路分析 |
| 5.4.6 蛋白质组学与代谢组学的关联分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 DON及 KAM对小鼠肠道屏障及肠道菌群的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 试验材料与试剂 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 主要溶液的配制 |
| 6.3.2 实验动物处理 |
| 6.3.3 FD-4透过性试验 |
| 6.3.4 一氧化氮合酶的测定 |
| 6.3.5 小鼠粪便短链脂肪酸的测定 |
| 6.3.6 小鼠粪便样品高通量测序 |
| 6.3.7 数据分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 小鼠体重及脏器指数 |
| 6.4.2 DON及 KAM对小鼠的肠道组织病理学影响 |
| 6.4.3 DON及 KAM对小鼠肠道通透性的影响 |
| 6.4.4 DON及 KAM对小鼠肠道炎症反应的影响 |
| 6.4.5 小鼠粪便中短链脂肪酸的测定 |
| 6.4.6 小鼠肠道菌群测序及分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 外源性 KGF 对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的 保护作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 吗替麦考酚酯降低小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 IL-17A调控Vγ4 细胞表达KGF机制的初步探讨 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 总结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 γδT细胞在人类疾病中的免疫学作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）FOXP3促进结直肠癌肝转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :FOXP3在肠癌中高表达并激活上皮-间质转化促进肠癌细胞侵袭转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 临床资料收集及分组 |
| 2.2.1 辽宁省肿瘤医院肠癌样本及临床资料收集 |
| 2.3 生物信息学分析 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 Real-Time PCR |
| 2.4.3 CCK8实验 |
| 2.4.4 流式术检测细胞凋亡 |
| 2.4.5 Transwell侵袭实验 |
| 2.4.6 迁移实验 |
| 2.4.7 小干扰siRNA进行细胞转染 |
| 2.4.8 免疫组织化学实验 |
| 2.4.10 裸鼠皮下移植瘤模型 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析证明FOXP3在肠癌组织较癌旁组织中高表达 |
| 3.1.1 GEPIA数据库分析显示FOXP3 在肠癌中高表达 |
| 3.1.2 肠癌(伴同时性或异时性肝转移)患者FOXP3表达与临床资料相关性的分析 |
| 3.1.3 FOXP3 高表达与肠癌KRAS突变及MSI亚型相关 |
| 3.2 FOXP3在肠癌及肝转移组织及肠癌细胞系中高表达 |
| 3.2.1 FOXP3蛋白在人肠癌组织及肝转移组织中较癌旁组织高表达 |
| 3.2.2 FOXP3在肠癌细胞系中较肠上皮细胞系表达上调 |
| 3.3 FOXP3促进肠癌细胞的增殖及侵袭 |
| 3.3.1 FOXP3在RKO及 HT-29 中沉默及过表达的效率验证 |
| 3.3.2 体外研究证明FOXP3促进肠癌细胞增殖 |
| 3.3.3 FOXP3抑制肠癌细胞凋亡 |
| 3.3.4 FOXP3促进肠癌细胞的侵袭 |
| 3.4 体内研究验证FOXP3促进肠癌细胞增殖及转移 |
| 3.4.1 体内验证FOXP3促进肠癌细胞增殖 |
| 3.4.2 体内研究验证FOXP3促进肠癌细胞肝转移 |
| 3.5 过表达FOXP3 促进肠癌细胞EMT |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :FOXP3 促进β-catenin入核激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 生物信息分析 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 siRNA转染 |
| 2.4.3 q RT-PCR |
| 2.4.4 蛋白免疫印迹(Westernblot)实验 |
| 2.4.5 免疫共沉淀 |
| 2.4.6 免疫荧光 |
| 2.4.7 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 权重共表达基因网络分析揭示肠癌肝转移相关基因集 |
| 3.2 KEGG分析及GSEA分析提示FOXP3 可能通过激活Wnt信号通路促进肠癌肝转移 |
| 3.3 Oncomine数据库验证Wnt下游靶基因在肠癌中高表达 |
| 3.4 FOXP3 在肠癌中激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.5 FOXP3 促进Wnt/β-catenin下游靶基因表达 |
| 3.6 FOXP3 通过促进β-catenin入核激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.7 FOXP3 与核内β-catenin直接结合共激活Wnt信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :FOXP3 调节SAM循环改变MMP9 启动子甲基化促进肠癌转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 代谢物提取 |
| 2.3.2 标准溶液配制 |
| 2.3.3 差异代谢物分析 |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP) |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 非靶代谢组学分析发现FOXP3 抑制SAM循环 |
| 3.2 差异代谢物的筛选与鉴定 |
| 3.3 高表达FOXP3 抑制SAM循环 |
| 3.4 FOXP3经SAM循环影响MMP9 表达促进肠癌细胞侵袭 |
| 3.5 FOXP3 抑制SAM循环改变MMP9 启动子的甲基化状态 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）FNDC5抑制高血压的血管平滑肌细胞炎症、氧化应激和迁移的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 FNDC5 抑制血管平滑肌细胞 NLRP3 炎性小体激活和氧化应激的作用及分子机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiR-31-5p通过抑制FNDC5表达促进血管平滑肌细胞迁移和氧化应激的作用及分子机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:FNDC5/irisin 的生物学特点与研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语 |
| 攻读学位期间发表研究论文及科研工作情况 |
| 致谢 |
（8）益母草碱对肉仔鸡的免疫和抗氧化作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 益母草碱研究概括 |
| 2.2 免疫应激及其相关信号通路 |
| 2.3 肠道黏膜的损伤及其机制 |
| 3 主要研究内容 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 益母草碱对肉仔鸡生长性能、免疫功能、抗氧化能力和血脂指标的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料与动物 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物的处理与分组 |
| 2.2 饲养管理 |
| 2.3 指标测定与方法 |
| 2.3.1 生长性能 |
| 2.3.2 免疫器官指数 |
| 2.3.3 血清免疫球蛋白、抗体效价和细胞因子含量 |
| 2.3.4 血清抗氧化指标的测定 |
| 2.3.5 血脂相关指标的测定 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 益母草碱对肉仔鸡生长性能的影响 |
| 3.2 益母草碱对肉仔鸡免疫器官的影响 |
| 3.3 益母草碱对肉仔鸡抗体效价和细胞因子的影响 |
| 3.4 益母草碱对肉仔鸡血清免疫球蛋白的影响 |
| 3.5 益母草碱对血清中MDA、T-SOD以及CAT的影响 |
| 3.6 益母草碱对血清中T-AOC和GSH的影响 |
| 3.7 益母草碱对血脂指标的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 益母草碱对肉仔鸡生产性能和免疫功能的影响 |
| 4.2 益母草碱对肉仔鸡血清抗氧化指标和血脂含量的影响 |
| 5 小结 |
| 试验二 益母草碱对LPS应激肉仔鸡的生长性能、免疫功能和脾脏免疫抗氧化的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料与动物 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物的处理与分组 |
| 2.2 攻毒与饲养管理 |
| 2.3 指标测定与方法 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 益母草碱对LPS应激肉仔鸡生产性能的影响 |
| 3.2 益母草碱对LPS应激肉仔鸡免疫器官指数的影响 |
| 3.3 益母草碱对LPS应激肉仔鸡血清抗氧化指标的影响 |
| 3.4 益母草碱对LPS应激肉仔鸡脾脏抗氧化能力的影响 |
| 3.5 益母草碱对LPS应激肉仔鸡血清中细胞因子的影响 |
| 3.6 益母草碱对LPS应激肉仔鸡血清免疫指标影响 |
| 3.7 益母草碱对LPS应激肉仔鸡脾脏中相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 益母草碱对LPS诱导肉仔鸡生产性能和免疫器官指数的影响 |
| 4.2 益母草碱对LPS诱导肉仔鸡血清抗氧化指标的影响 |
| 4.3 益母草碱对LPS诱导肉仔鸡免疫指标的影响 |
| 4.4 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡脾脏相关基因的表达 |
| 5 小结 |
| 试验三 益母草碱对LPS应激肉仔鸡肠道免疫抗氧化的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验药物与动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验器材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物分组及处理 |
| 2.2 攻毒与饲养管理 |
| 2.3 指标测定与方法 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡肠黏膜形态的影响 |
| 3.2 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡肠道菌群的影响 |
| 3.3 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡肠道黏膜抗氧化指标的影响 |
| 3.4 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡血清中二胺氧化酶和D-乳酸的影响 |
| 3.5 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡肠黏膜相关基因表达量的影响 |
| 3.6 益母草碱对LPS诱导的肉仔鸡肠黏膜相关蛋白表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 益母草碱对LPS应激小肠形态的影响 |
| 4.2 益母草碱对LPS应激小肠菌群的影响 |
| 4.3 益母草碱对LPS应激小肠黏膜氧化指标的影响 |
| 4.4 益母草碱对LPS应激空肠黏膜信号通路的影响 |
| 4.5 益母草碱对LPS应激空肠黏膜紧密连接蛋白和通透性的影响 |
| 5 小结 |
| 试验四 益母草碱对脂多糖应激鸡胚肠上皮细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料与鸡胚 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 试验器材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 原代鸡肠上皮细胞分离、培养与鉴定 |
| 2.2 细胞荧光免疫 |
| 2.3 不同浓度及时间的益母草碱对鸡胚肠上皮细胞活力的影响 |
| 2.4 不同浓度及时间的LPS对鸡肠上皮细胞活力的影响 |
| 2.5 益母草碱对LPS应激的鸡肠上皮细胞活力的模型建立 |
| 2.6 RT-PCR检测益母草碱对肠上皮细胞相关基因表达量的影响 |
| 2.7 蛋白质印记法(Western-Blot)检测蛋白的表达量 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡胚肠上皮细胞的生长动态 |
| 3.2 鸡肠上皮原代细胞细胞荧光免疫结果 |
| 3.3 不同浓度和时间的益母草碱对肠上皮细胞活力的影响 |
| 3.4 不同浓度和时间LPS对肠上皮细胞的影响 |
| 3.5 益母草碱对LPS诱导的鸡胚肠上皮细胞活力的保护作用 |
| 3.6 益母草碱对LPS诱导鸡胚肠上皮细胞相关基因表达量的影响 |
| 3.7 益母草碱对LPS诱导鸡胚肠上皮细胞相关蛋白表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡肠上皮细胞的分离、培养及鉴定 |
| 4.2 益母草碱对LPS诱导的鸡肠上皮细胞活力和相关酶的影响 |
| 4.3 益母草碱对LPS诱导的鸡肠上皮紧密连接蛋白和MAPKs/NF-κB信号通路的影响 |
| 5 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（9）日粮中添加尿苷酸对仔猪生长性能的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 核苷酸的研究进展 |
| 1 核苷酸的来源 |
| 2 核苷酸的消化吸收与代谢 |
| 2.1 核苷酸的消化 |
| 2.2 核苷酸的吸收 |
| 2.3 核苷酸的代谢 |
| 3 核苷酸的功效作用 |
| 3.1 对肠道健康的影响 |
| 3.2 对免疫功能的影响 |
| 3.3 对生长性能的影响 |
| 第二节 尿苷酸的研究进展 |
| 1 尿苷酸的结构、吸收和代谢 |
| 1.1 尿苷酸的结构 |
| 1.2 尿苷酸的合成途径 |
| 1.3 尿苷酸在肠道的吸收与转运 |
| 2 尿苷酸与三大营养物质的代谢关系 |
| 2.1 尿苷酸与糖代谢 |
| 2.2 尿苷酸与氨基酸代谢 |
| 2.3 尿苷酸与脂质代谢 |
| 3 尿苷酸的生物学功能 |
| 3.1 尿苷酸与免疫 |
| 3.2 尿苷酸与氧化应激 |
| 3.3 尿苷酸与细胞周期 |
| 4 尿苷酸在动物生产中的应用 |
| 4.1 提高动物采食量 |
| 4.2 促进肠道发育,维护肠道健康 |
| 4.3 降低腹泻率,提高生长性能 |
| 第三节 研究的目的和意义 |
| 1 尿苷酸的添加 |
| 2 尿苷酸的需求量 |
| 3 研究内容 |
| 第二章 尿苷酸对仔猪生长性能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 动物试验设计 |
| 1.3 试验日粮 |
| 1.4 饲养管理 |
| 1.5 生长性能的测定 |
| 1.6 腹泻指标的测定 |
| 1.7 样品的采集 |
| 1.8 脏器指数的测定 |
| 1.9 数据统计和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生长性能 |
| 2.2 腹泻情况 |
| 2.3 器官指数 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 尿苷酸对仔猪生理生化指标和氨基酸代谢的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 生理生化指标的测定 |
| 1.3 氨基酸指标的测定 |
| 1.4 数据统计和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生理生化指标 |
| 2.2 血浆氨基酸的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 尿苷酸对仔猪肠道黏膜形态的影响机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 石蜡切片的制备与HE染色 |
| 1.3 HE染色 |
| 1.4 肠道组织形态学的测定 |
| 1.5 肠道荧光定量PCR(RT-q PCR) |
| 1.6 数据统计和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 尿苷酸对仔猪肠道形态学的影响 |
| 2.2 尿苷酸对仔猪肠道粘膜核苷酸代谢相关基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 尿苷酸对仔猪肠道形态学的影响 |
| 3.2 尿苷酸对仔猪肠道黏膜核苷酸代谢基因的影响 |
| 4 小结 |
| 第五章 尿苷酸对仔猪肝脏脂肪和核苷酸代谢基因的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 肝脏游离氨基酸的测定 |
| 1.3 肝脏中脂肪酸的测定 |
| 1.4 肝脏的RNA提取及c DNA合成 |
| 1.5 肝脏中核苷酸代谢相关基因荧光定量PCR(RT-q PCR) |
| 1.6 肝脏中脂肪酸代谢相关基因荧光定量PCR(RT-q PCR) |
| 1.7 数据统计和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 肝脏游离氨基酸 |
| 2.2 肝脏脂肪酸 |
| 2.3 肝脏中核苷酸代谢基因 |
| 2.4 肝脏脂肪代谢基因 |
| 3 讨论 |
| 3.1 尿苷酸对断奶仔猪肝脏氨基酸的影响 |
| 3.2 尿苷酸对断奶仔猪肝脏脂肪酸的影响 |
| 3.3 尿苷酸对仔猪肝脏核苷酸代谢基因的影响 |
| 3.4 尿苷酸对断奶仔猪肝脏脂肪酸相关基因的影响 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）miR-30c-2-3p介导的细胞迁移在肠上皮细胞损伤修复作用及甘草酸的干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肠粘膜上皮屏障的研究概况 |
| 第二节 miRNA在肠粘膜上皮损伤修复的研究进展 |
| 第三节 甘草酸在肠粘膜上皮损伤修复的影响 |
| 第四节 本论文的研究思路 |
| 第二章 miR-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖、迁移能力的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 一、miR-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖能力的影响 |
| 二、miR-30c-2-3p对肠上皮细胞迁移能力的影响 |
| 第三节 结果讨论 |
| 第三章 miR-30c-2-3p对STIM2的靶向调控作用 |
| 第一节 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 一、生物信息学软件预测miR-30c-2-3p调控的靶基因 |
| 二、miR-30c-2-3p靶向调控STIM2的表达 |
| 第三节 结果讨论 |
| 第四章 miR-30c-2-3p对Ca~(2+)/MYLK/MLC2信号通路的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 一、miR-30c-2-3p对IEC-6细胞Ca~(2+)/MYLK/MLC2的影响 |
| 二、miR-30c-2-3p对IEC-6细胞MLC2/F-actin的影响 |
| 第三节 结果讨论 |
| 第五章 siRNA沉默STIM2及过表达质粒STIM2转染对IEC-6细胞Ca~(2+)/MYLK/MLC2信号通路的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 一、沉默STIM2蛋白表达对IEC-6细胞迁移能力的影响 |
| 二、过表达STIM2蛋白表达对IEC-6细胞迁移能力的影响 |
| 第三节 结果讨论 |
| 第六章 甘草酸对IEC-6细胞迁移的作用及相关信号通路研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 第二节 实验结果 |
| 一、不同浓度的甘草酸对IEC-6细胞迁移能力的影响 |
| 二、甘草酸对IEC-6细胞钙离子及相关信号通路的影响 |
| 第三节 结果讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、外源核苷酸对肠上皮细胞增殖和迁移的作用（论文参考文献）
- [1]干酪乳杆菌刺激肠细胞产生抗菌肽的筛选及其对肠上皮细胞增殖作用研究[D]. 白永飞. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]间充质干细胞微囊泡对脓毒症肠屏障及肺血管屏障功能的保护作用及机制[D]. 郑丹阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]Circ-LECRC内源性竞争结合miR-135b-5p上调靶基因KLF4抑制结直肠癌的增殖、转移及其机制研究[D]. 安悦. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]山奈酚对脱氧雪腐镰刀菌烯醇致肠道屏障损伤的预防作用及机制[D]. 王晓杰. 江南大学, 2020(03)
- [5]MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究[D]. 宋亚军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [6]FOXP3促进结直肠癌肝转移的机制研究[D]. 王哲. 中国医科大学, 2020(01)
- [7]FNDC5抑制高血压的血管平滑肌细胞炎症、氧化应激和迁移的作用及分子机制[D]. 周兵. 南京医科大学, 2020(06)
- [8]益母草碱对肉仔鸡的免疫和抗氧化作用及其机制研究[D]. 杨莉. 石河子大学, 2019(01)
- [9]日粮中添加尿苷酸对仔猪生长性能的影响及其作用机制[D]. 李彪. 湖南农业大学, 2019
- [10]miR-30c-2-3p介导的细胞迁移在肠上皮细胞损伤修复作用及甘草酸的干预研究[D]. 罗敏. 广州中医药大学, 2019(04)