论文摘要
对烷基卤脱卤酶DhaA结构和催化性质的深入理解,化学毒剂芥子气（HD）的生物酶绿色降解路径逐渐成为可能,但DhaA稳定性差仍然是制约生物酶洗消剂走向应用的瓶颈问题。采用硅基介孔材料进行吸附固定化是生物酶稳定化的通用技术,但由于天然生物酶分子间的结构性质差异较大,目前尚未形成基于不同生物酶分子特异性的通用型载体设计合成和修饰改性方案,造成DhaA的吸附固定化相关研究工作仍然处于空白,在化学毒剂洗消领域的应用也未开展。本文从介孔泡沫（MCF）与DhaA相互作用研究入手,首次采用―计算机模拟—实验验证‖的方式对DhaA的MCF吸附过程进行研究,指导MCF的官能团修饰,结合DhaA变性过程和热力学参数变化研究探讨DhaA稳定化机理,基于DhaA吸附后修饰技术设计并制备了类―三明治‖结构模型,进一步提高了DhaA的稳定性。论文主要的研究内容和创新性发现如下:1.MCF制备及其与DhaA相互作用研究基于DhaA的分子尺寸,利用水热合成法制备了二维孔道结构的SBA系列和三维笼状结构的MCF系列吸附载体。通过DhaA在两类吸附载体中的吸附动力学、饱和吸附量/解吸附量、不同pH值下吸附情况研究,发现孔径尺寸大、孔道结构开放的MCF对DhaA的吸附效果更好。系统研究了DhaA在MCF中的吸附过程,发现DhaA在MCF中的内扩散是吸附动力学的限速步骤,DhaA与MCF之间的静电排斥作用是主要影响因素。DhaA吸附后催化活性仅残留12.4%,荧光光谱证实催化活性的降低是由于吸附过程中静电排斥作用导致DhaA构象变化造成的。2.改性MCF与DhaA相互作用研究采用并行退火蒙特卡洛算法计算了DhaA分子在不同电荷表面的优势吸附取向,并以此为基础进行了DhaA在不同官能团表面的分子动力学模拟。模拟结果发现,DhaA在COOH、SO3、CH3表面吸附后均会发生构象或底物进出口通道变化,不利于底物进出。在解离度25%的NH2表面,DhaA与表面结合能高,造成DhaA底物进出口通道结构变化大,催化位点Glu130与His272之间无法形成氢键,影响催化活性。解离度7%的NH2表面通过与DhaA残基Asp76、Asp78、Asp156的静电吸引作用吸附DhaA,吸附后DhaA底物进出口通道朝向表面,但DhaA构象得到保持,底物进出口通道结构的变化有利于底物参与催化反应。通过氨基、甲基和磺酸基官能团修饰实验,分别得到了Zeta电位为+3.2mV、-2.9mV和-23.8mV的MCF改性载体,并且保持了满足DhaA吸附的孔道结构。DhaA在甲基和磺酸基修饰MCF中吸附后发生荧光光谱位移,残存DhaA催化活性分别为5.5%和7.2%;DhaA在氨基修饰MCF中吸附后荧光光谱显示构象得到保持,催化活性残留99.4%,对计算机模拟结果进行了有效验证。更重要的是,DhaA在氨基修饰MCF中吸附后稳定性得到增强。3.NH2-MCF吸附对DhaA稳定化机理研究采用荧光光谱和分子动力学模拟技术对DhaA在尿素和DMSO两种体系中的变性机制进行了研究,发现尿素分子能够取代DhaA周围水化层中的水分子而与DhaA形成氢键,导致底物进出口通道变长、曲率增加、瓶颈尺寸减小,从而造成DhaA失活,变性过程符合二态过程。与之相反,DMSO分子无法破坏DhaA与水分子之间形成的氢键,但能够进入DhaA的疏水空腔,导致底物进出口通道缩短、曲率减小、瓶颈尺寸增大,DhaA构象发生变化,从而造成DhaA去折叠,变性过程符合三态过程。DhaA经过NH2-MCF吸附后,在尿素和DMSO两种体系中的变性过程没有变化,但变性热力学参数有所改变。尿素体系中,DhaA与NH2-MCF形成的静电作用和氢键有效阻碍了尿素分子的结合,提高了DhaA变性的ΔG（H2O）;DMSO体系中,NH2-MCF的孔道内极性微环境有效阻碍了DMSO的进入,减小了DhaA的溶液可及化面积。4.NH2-MCF吸附DhaA后PEG修饰研究在NH2-MCF吸附DhaA的基础上,使用8臂PEG交联剂将DhaA结合到NH2-MCF孔道表面,增强了DhaA与载体之间的结合力。接着采用PEG-mal表面修饰技术进一步为DhaA提供了水化保护层。结果发现DhaA经吸附后PEG修饰,在NH2-MCF中的泄漏率从14.6%降低至1.1%,催化活性残留83.7%,催化效率Kcat/KM从0.450 s-1·（mmol/L）-1提高至0.575 s-1·（mmol/L）-1。与此同时,经吸附后PEG修饰的DhaA稳定性得到明显提高,40%DMSO中5h残留活性提高99.8%,3mol/L尿素下残留活性87.3%,pH 3.0下残留活性25.9%。室温存放30天后吸附后PEG修饰DhaA仍然残留51.8%的催化活性。因此,该研究有望开发一种可以满足实际应用的固定化DhaA。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 郑禾
导师: 钟近艺,刘景全
关键词: 介孔泡沫,稳定化机理,相互作用,分子动力学模拟
来源: 军事科学院
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,化学
单位: 军事科学院
分类号: O647.3;Q814.2
总页数: 128
文件大小: 10475K
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