余志强[1]2004年在《枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子P△glvA整合表达载体的构建及启动子功能的初步探讨》文中研究说明在原核生物界，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是继大肠杆菌(E.coli)后最有发展前景的外源基因表达体系。但枯草芽孢杆菌自身没有合适的内源质粒，现用于枯草杆菌的载体大都来自于其它种属的细菌，如金黄色葡萄球菌，乳酸杆菌等，虽然已有外源基因成功克隆表达的报道，但由于其在枯草杆菌中存在分离复制的不稳定及外源基因的克隆表达效率低的现象，故都不是枯草杆菌的最佳选择。 将外源目的基因整合到染色体上复制表达是解决染色体外复制质粒在宿主中遗传不稳定现象的有效策略。另外，一个好的表达载体除了遗传与复制稳定外，还应该有一个高效的表达盒。包括启动子元件，终止子元件和合适的多克隆位点。其中，一个强而可控的启动子是实现外源基因高效表达的关键。启动子表达的强弱一般会受到自身和宿主多种因素的影响。 本课题主要工作是构建带有代谢物阻遏元素(catabolite repression element)突变(cre~-)的枯草杆菌麦芽糖启动子P△glvA，并以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的热稳定的β-半乳糖甙酶基因(bga)为报告基因，以整合载体PAX01为骨架的整合表达载体Pyzq-3； 另外，为了初步探讨枯草杆菌spo0A因子对麦芽糖启动子的功能，从枯草杆菌(Bacillus subtilis)168的衍生菌株1094的基因组DNA中分别扩增孢子形成的早期因子基因spo0A的上、下游片段spo0A-front和spo0A-back，并以大肠杆菌(E.coli)质粒pBluescript Ⅱ ks(+)为骨架，以来自pBEST501质粒上的新霉素(neo~r)抗性基因为枯草杆菌中的筛选标记，构建了基于枯草杆菌spo0A基因位点的整合载体Pyzq-1。 将线性化的Pyzq-3转化宿主枯草杆菌IA785，得到突变株GJYY-03。线性化的载体Pyzq-1转化突变株GJYY-03，得到突变株GJYY-05。检测突变株GJYY-03，GJYY-05在不同浓度诱导物(含0％，0.2％，0.5％，1％浓度的麦芽糖)，培养基中含1％浓度的葡萄糖的情况下由P△glvA控制的β-半乳糖甙酶酶活。 结果表明，启动子P△glvA在0.5％浓度的麦芽糖诱导下表现出最大的活性；培养基中存在1％的葡萄糖，由启动子P△glvA控制的β-半乳糖甙酶的活性受华中农业大学2004届硕士毕业论文到抑制;sPo0A基因产物的缺失(sPo0A一)，由启动子P△glvA控制的p一半乳糖贰酶的活性也受到抑制;而且，在培养基中存在1%葡萄糖及spoOA基因产物的缺失(sP口0A一)双重因子的作用下，启动子P△glvA的活性受到了严重且长久的抑制。
祁艳霞[2]2005年在《热稳定性β-半乳糖苷酶工程菌构建及其培养条件优化》文中认为本研究利用基因重组技术构建热稳定性β-半乳糖苷酶基因工程菌,并对筛选获得的工程菌优化培养条件。通过试验获得如下主要结果: 1.将枯草芽孢杆菌生孢子早期因子spo0A基因整合载体pGJ09和pGJ16分别以双交叉和单交叉同源重组方式整合到枯草芽孢杆菌野生株1A747 中,得到spo0A 基因突变株BGJ09-5 和BGJ16-3。通过PCR、酶切检测BGJ09-5 的spo0A 基因完全敲除,生孢子培养结果完全丧失生孢子能力,并且BGJ09-5 生长速度受到严重抑制,而BGJ16-3 是在spo0A 基因位点插入一段新霉素抗性基因,其仍具有生孢子能力,但相对阴性对照野生株1A747 生孢子速度慢。 2.热稳定性β-半乳糖苷酶基因表达载体pGJ222 电转化野生菌1A747、突变株BGJ16-3和BGJ09-5,得到转化子BGJ222 和BGJ222-16。对BGJ222 和BGJ222-16 表达β-半乳糖苷酶的情况进行研究,发现BGJ222 比突变株BGJ222-16 表达β-半乳糖苷酶的能力强。 3.将获得的BGJ222 进行发酵培养,筛选出最佳培养基配方及发酵工艺参数为:1%蛋白胨(Trypton)、1%酵母抽提物(Yeast extract)、1%山梨醇(D-Soribitol)、1%乳糖(Lactose)、1.3%Na2HPO4·12H2O、1%NaH2PO4·2H2O,灭菌前调PH 值为6.6;发酵工艺参数为250ml 叁角瓶装液量30ml、接种量2%、温度37℃、转速225rpm/min。 4.由于表达载体是枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子pglvA,在发酵培养6h时以终浓度3%的麦芽糖诱导,培养28h 时收集初酶液最佳。此时β-半乳糖苷酶表达量达到22992.7 miller unit,比初始时在LB 中的最高表达量860.3 miller unit 提高了27 倍。由于葡萄糖的碳分解阻遏作用对麦芽糖启动子转录活性的抑制,本试验初步探讨了发酵液中的葡萄糖含量对启动子转录活性的的影响,发现当发酵液中的葡萄糖含量小于0.3mg/ml 时葡萄糖抑制被解除,β-半乳糖苷酶开始大量表达。
王晶[3]2008年在《枯草芽孢杆菌表达检测载体的构建与生物素合成酶（BioB）的表达检测》文中研究说明生物素(vitamin H)是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一,在畜牧业、食品及医药等领域应用广泛。我国所用的生物素大部分从美国、日本等国家进口,价格昂贵。因此,有必要进行生物素合成的研究。由于化学法生产的高污染性,利用微生物发酵生产生物素成为国际上高新技术竞争一大热点。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌,细胞壁不含内毒素,能分泌大量蛋白到体外,作为一些重要工业酶制剂的生产菌种成为生产生物素的首选宿主菌。在生物素生物合成的研究过程中,发现大肠杆菌、沙雷氏菌、球形芽孢杆菌的生物素高产菌中,生物素合成酶基因(bioB)的高表达会引起宿主菌生长抑制,其蛋白表达存在表达量少、和不稳定等问题。关于枯草芽孢杆菌bioB基因的高表达尚无相关报道,为解决此问题,我们需要找出bioB基因低表达的原因,使生物素合成实现生物发酵以替代化学合成。本研究以枯草芽孢杆菌菌株为研究材料,利用强启动子PglvM和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体构建枯草芽孢杆菌表达检测载体,该载体不仅可以检测出bioB低表达的原因,为生物素的合成奠定基础,还可以为今后的基因表达检测提供一个简易方便的工具。本试验以嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶编码基因(bgaB)为报告基因构建枯草芽孢杆菌表达检测载体。用ApaI和EcoRI双酶切质粒pBluskm-PglvM,得到启动子片段PglvM;用EcoRI和SacI双酶切质粒pDL获得报告基因bgaB;用ApaI和SacI消化大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ103得到载体骨架;将以上叁个片段用DNA连接酶连接得到表达检测载体pGJ324。测序结果表明,该载体从启动子PglvM开始依次为含SD序列的多克隆位点与含SD序列的bgaB基因。为了检测枯草芽孢杆菌表达检测载体pGJ324的表达效果,将无启动子的壮观霉素抗性基因(spec)克隆到pGJ324和pGJ103(无启动子)中得到spec基因表达检测载体pGJ324-spec和pGJ103-spec。将两个载体电转枯草芽孢杆菌1A747中得到重组菌pGJ324-spec(1A747)和pGJ103-spec(1A747),重组菌在含壮观霉素的固体LB培养基中培养36 h后,结果表明无启动子的壮观霉素抗性基因在PglvM的调控下成功表达,而pGJ103-spec(1A747)中的spec基因不能表达。另外,pGJ324-spec(1A747)的发酵液中检测到了β-半乳糖苷酶酶活,表明中bgaB基因也表达成功。pGJ324-spe(c1A747)中bgaB基因和spec基因的成功表达说明表达检测载体pGJ324构建成功。为了构建bioB基因表达检测载体,将基因bioB和bioI克隆到pGJ324中得到表达载体pGJ324-bioI和pGJ324-bioB。将两个载体转入1A747中进行表达,SDS-PAGE检测表明,pGJ324-bioI载体中的bgaB和bioI有明显条带,而bioB没有可见的蛋白条带,但是β-半乳糖苷酶的酶活测定表明pGJ324-bioB中的bgaB确实得到表达,说明处于bgaB上游位置的基因bioB成功转录。为进一步的研究,将约500 bp的bioB和bioI克隆到pGJ324的相应位点构建表达载体pGJ324- bioI500和pGJ324-bioB500,将载体质粒电转入1A747中进行表达,SDS-PAGE检测显示500 bp的基因片段被成功翻译成多肽,说明bioB和bioI的基因片段被成功翻译,β-半乳糖苷酶的酶活测定也显示融合表达载体上的bioI500,bioB500,bgaB被成功表达并且翻译。试验结果表明,枯草芽孢杆菌表达检测载体pGJ324构建成功;bioB可以被正常的转录和翻译,但是较低地蛋白表达原因仍需要进一步研究。
杨燕芳[4]2017年在《枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能分析》文中认为枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,广泛应用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的工业化生产,是重要的工业菌种。枯草芽孢杆菌具有分泌蛋白能力强、非致病性、同时易于分离培养,遗传背景较清晰等特点,在基因工程是一种表达和分泌外源蛋白的理想宿主。实践表明目前枯草芽孢杆菌的载体系统常用的启动子不能满足越来越多外源基因表达的要求,因此筛选新型强启动子或者通过改造启动子以期实现外源基因的高效表达。利用本研究所构建的探针型质粒载体PUC-knaa直接在大肠杆菌中筛选启动子,并获得了具有启动子活力的PK3片段,以麦芽糖α-淀粉酶基因sva为报告基因构建pHCMC04-Pk3-sva重组质粒,导入B.subtilis 1A857菌株中进行表达,结果表明PK3片段在枯草芽孢杆菌中能使sva基因成功表达,通过测定胞外发酵液粗酶活力为27.3 U/mL。为了研究人工双启动子的转录功能,利用来自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的启动子PaprE和胞苷脱氨酶(cdd)基因的启动子P43,分别构建了麦芽糖α-淀粉酶sva基因为报告基因的pHCMC04-PaprE-sva、pHCMC04-P43-sva、pHCMC04-P43-PaprE-sva 和 pHCMC04-PaprE-p43-sva表达载体,然后分别转化B.subtilis1A857感受态细胞,不同时间取样测定麦芽糖α-淀粉酶sva酶活并比较其酶活力,结果显示重组菌B.subtilis pHCMC04-PaprE-sva、pHCMC04-p43-sva、pHCMC04-P43-PaprE-sva和pHCMC04-PaprE-P43-sva 表达的sv 酶活分别为 69.4 U/mL,79.7 U/mL,97.6U/mL,121.8U/mL,菌体密度 OD600 值分别为 8.6、9.03、9.5、9.3。表明双启动子较单个启动子表达量均有所提高,串联组合P43-PaprE较单启动子提高1.2倍,串联顺序为PaprE-p43酶活较单个启动子提高1.6倍,串联组合P43-PaprE与单个启动子相比差距不显着,PaprE-p43组合效果最佳。相较于组成型启动子而言,诱导型启动子具有可控性强的优势,适合用于对表达调控要求严格的外源基因表达。根据上述实验结果,尝试获得更高效的诱导型表达载体。以本实验室构建好的pHCMC04-Pglv-sva为骨架,构建重组质粒 pHCMC04-P43-Pglv-sva和 pHCMC04-Pglv-p43-sva分别转化到B.subtilis1A857感受态细胞进行发酵培养。结果显示,添加1.5%麦芽糖后,重组菌pHCMC04-Pglv-sva最高酶活为112.4 U/mL,pHCMC04-P43-sva 为 121.6 U/mL,pHCMC04-P43-Pglv-sva 为 123.8 U/mL,pHCMC04-Pglv-P43-sva为52.3 U/mL。虽然Pglv启动子与P43启动子串联后,启动子的表达时间有所延长,但是双启动子对比单个启动子在最高酶活方面没有显示出优势。
刘欣[5]2018年在《枯草芽孢杆菌ATCC6051宿主构建及表达元件、蛋白折迭功能基因的研究》文中进行了进一步梳理枯草芽孢杆菌表达系统具有生物安全性高、遗传背景清晰、蛋白分泌能力强等突出特点,广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白。本研究旨在利用无痕敲除技术和胞外蛋白谱构建无抗性标记的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达宿主、采用转录组学技术和信号肽库筛选挖掘最优表达元件以及分析Sec分泌途径中折迭相关基因功能的研究,建立具有应用潜力的枯草芽孢杆菌高效表达系统。本文先通过温敏型质粒pKS2无痕敲除体系失活了B.subtilis ATCC 6051的八种蛋白酶编码基因(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA),一个芽孢形成因子F编码基因spollAC和surfactin合成酶编码基因srfAC,成功构建了B.subtilis无抗性标记、不产孢子且副产物少的宿主;并以B.subtilis 168为参照做相对应的研究。将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的转谷氨酰胺酶酶原(proMTG)和嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)来源的耐热半乳糖苷酶(BgaB)验证表达宿主的重组蛋白可行性,菌株B.subtilis ATCC6051?10(?spollAC、?srfAC、?aprE、?nprE、?nprB、?epr、?mpr、?bpr、?vpr、?wprA)对proMTG和BgaB的重组表达效果最好;且建立了该宿主的胞外分泌蛋白谱图。基于对数生长后期的叁株模式芽孢杆菌(B.subtilis 168、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC14580、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319)的RNA-Seq数据分析,以BgaB为报告蛋白构建了启动子筛选质粒,先将叁株芽孢杆菌中高表达的前十个基因的启动子片段供筛选,获得了31个启动子侯选库;其中两个启动子(P_(glvA)和P_(hag))在对数生长后期BgaB酶活高于传统强启动子P43。将叁株芽孢杆菌表达基因通过同源基因家族分析(Orthomcl)和RPKM值排名关系数值,将前十个共同高表达同源基因的启动子片段供筛选,得到30个启动子侯选库;筛选得到五个启动子的BgaB酶活高于P43,其中启动子P_(ydzA)(B.subtilis 168)酶活最高为44.3 U/mL,是P43的3.41倍。将上述七个强启动子表达proMTG和来自长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶(PUL),结果表明启动子P_(sodA)(B.naganoensis DSM319)表达proMTG酶活最高为82.6 U/mL,是P43的1.49倍,启动子P_(spoVG)(B.Subtilis 168)表达PUL酶活最高为328.4 U/mL,是P43的1.47倍。将173种Sec信号肽库构建信号肽高通量筛选载体,以BgaB为目标蛋白进行筛选,共得到了48种有效分泌的信号肽,其中细胞分离酶LytF信号肽的分泌效果最显着。将信号肽库进一步用于proMTG和来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖型淀粉酶AmyM的信号肽筛选研究,proMTG获得30种有效分泌的信号肽,AmyM获得27种有效分泌的信号肽,都是在AprE的引导分泌效果最好。结果证实了信号肽对不同蛋白的分泌效率有着明显的差异,需对目标蛋白进行特异性筛选。将前期筛选的最佳表达宿主6051?10、最强启动子P_(sodA)和最优分泌信号肽S_(aprE)重组表达proMTG,重组菌M5-1在摇瓶培养48 h达到酶活最高值126.55 U/mL;经亲和层析纯化后的酶活为53.06 U/mg,比同期研究报道酶活高1.74倍。5 L发酵罐中进行培养,54 h得到最高酶活855.54 U/mL,是摇瓶的6.76倍;经亲和层析纯化后的酶活为171.98U/mg,是摇瓶的3.24倍。结果表明该表达系统成功实现了proMTG的高效重组分泌表达,具有较好的应用潜力。以6051?10为出发株,构建了四株Sec分泌途径中折迭相关的prsA、htrA、htrB基因缺失的工程菌和叁株整合不同芽孢杆菌的PrsA蛋白的基因工程菌株。应用于重组表达proMTG,结果表明失活prsA的工程菌的酶活最低,只有重组菌M5-1的12.5%,整合及共表达PrsA蛋白均在一定程度上改善了失活自身PrsA蛋白的B.subtilis对proMTG的重组分泌表达。以6051?10为宿主,构建了叁株共表达不同芽孢杆菌的PrsA蛋白和proMTG的重组菌,结果表明过表达PrsA均促进了proMTG的分泌,其中来自B.megaterium的PrsA蛋白迭加效果最好。
参考文献：
[1]. 枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子P△glvA整合表达载体的构建及启动子功能的初步探讨[D]. 余志强. 华中农业大学. 2004
[2]. 热稳定性β-半乳糖苷酶工程菌构建及其培养条件优化[D]. 祁艳霞. 西北农林科技大学. 2005
[3]. 枯草芽孢杆菌表达检测载体的构建与生物素合成酶（BioB）的表达检测[D]. 王晶. 西北农林科技大学. 2008
[4]. 枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能分析[D]. 杨燕芳. 广西大学. 2017
[5]. 枯草芽孢杆菌ATCC6051宿主构建及表达元件、蛋白折迭功能基因的研究[D]. 刘欣. 华南理工大学. 2018
标签：一般化学工业论文; 枯草芽孢杆菌论文; 启动子论文; 分泌蛋白论文; 重组蛋白论文; 基因合成论文; 质粒载体论文; 科技新闻论文;